Digestione enzimatica e dissociazione manuale: un metodo per preparare embrioni C. elegans per la coltura cellulare

Overview

Questo video introduce un metodo per isolare e coltura sterile le cellule embrionali C. elegans in vitro.

Protocol

1. Dissociazione delle cellule embrionali

1. Eseguire i passaggi successivi della procedura in condizioni sterili utilizzando una cappa di flusso laminare. Mentre gli animali sono vestiti su piastre batteriche, i lavaggi e il trattamento con la soluzione di lisi contenente candeggina dovrebbero eliminare la maggior parte se non tutti i batteri. Pertanto, l'utilizzo di una cappa laminare a questo punto della procedura previene la nuova contaminazione della sospensione dell'uovo.
2. Resuspend uova a pellet in 1 ml di 2 mg/ml di chitinasi (stock in tampone di uova pH 6.5) e trasferirle in un nuovo tubo conico sterile da 15 ml. Dondolare il tubo per 10-30 minuti a temperatura ambiente. Il tempo esatto di incubazione cambia in base alla freschezza dell'enzima e alla temperatura della stanza e deve quindi essere determinato per ogni preparazione. Si consiglia di iniziare a monitorare le uova al microscopio a coltura cellulare invertita dopo 10 minuti di incubazione. Nota: nella nostra esperienza, il basso pH aumenta l'attività enzimatica chitinasi. Per questo motivo usiamo il tampone delle uova a pH 6,5 per sciogliere la chitinasi (ricetta riportata sopra, dove il pH viene regolato a 6,5 usando NaOH).
3. Quando ~ l'80% dei gusci d'uovo viene digerito dal trattamento con chitinasi(figure 1 A-B),pellet le uova per centrifugazione a 900 x g (~ 2.500 giri/min) per 3 min. Utilizzando un pipettor P1000 e punte sterili, rimuovere con cura il supernatante e aggiungere 3 ml di mezzo L-15.
4. Trasferire le uova in una piastra di 6 cm di diametro e dissociare delicatamente le cellule utilizzando una siringa sterile da 10 ml dotata di un ago da 18 G. Monitorare il grado di dissociazione posizionando una goccia di sospensione in una piastra di Petri di plastica fresca e visualizzando al microscopio. Non aspirare aria nella siringa durante questa procedura per evitare di danneggiare le cellule. Continuare la dissociazione fino a quando ~ 80% delle cellule sono dissociate.
5. Filtrare la sospensione utilizzando un filtro sterile da 5 μm millipore. Le sospensioni cellulari devono essere filtrate per rimuovere ciuffi cellulari, uova non digerite e larve tratteggiate. Filtrare ulteriori 4-5 ml di supporti L-15 freschi attraverso il filtro per recuperare tutte le cellule. Non utilizzare una forza eccessiva durante la fase di filtrazione per evitare di danneggiare il filtro e/o le cellule.

2. Cellule di coltivazione

1. Pellettizzare le cellule dissociate per centrifugazione a 900 x g (~2.500 giri/min) per 3 min. Utilizzando un pipettor P1000 e punte sterili rimuovere con cura tutto il supernatante. Rimostrare le celle a pellet in mezzo L-15 completo e piastra 1 ml/pozzo. La quantità del mezzo aggiunto dipende dal numero di piastre 8P utilizzate, dalla confluenza dei vermi sulle piastre e dal tipo di esperimenti che verranno eseguiti sulle cellule. La densità cellulare può essere determinata usando un emocitometro. Per le registrazioni patch-clamp la densità di placcatura di ~ 230.000 celle/cm² è ottimale.
2. Conservare la piastra di 24 pozzi in un contenitore di tupperware di plastica contenente tovaglioli di carta bagnati per evitare l'evaporazione del terreno di coltura. Conservare il contenitore in un incubatore umidificato a 20 °C e aria ambiente.
3. Le cellule sono solitamente pronte per gli esperimenti entro 24 ore quando la differenziazione morfologica e l'espressione dei marcatori GFP sono complete. Le cellule possono essere tenute in coltura fino a 2 settimane, ma di solito sono più sane fino a 7-9 giorni dopo la placcatura. Il mezzo deve essere sostituito una volta al giorno per mantenere cellule sane.

Representative Results

Figura 1. C. embrioni elegani prima e dopo il trattamento con chitinasi. (A) Fotografia delle uova prima dell'esposizione alla chitinasi. La freccia punta al guscio d'uovo trasparente e intatto che circonda un embrione. (B) Uova trattate con chitinasi per 10 minuti. I gusci d'uovo sono stati digeriti e non sono più visibili intorno agli embrioni. Le frecce puntano a tre embrioni rilasciati dal guscio d'uovo. La casella blu circonda un gruppo di celle ancora attaccate l'una all'altra.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
REAGENTS
Leibovitz's L-15 Medium (1x) Liquid	Invitrogen	11415-064
Fetal Bovine Serum	Invitrogen	16140-063
Penicillin-streptomycin	Sigma	P4333-100ML
Chitinase from Streptomyces Griseus	Sigma	C6137-25UN
Peanut Lectin	Sigma	L0881-10MG
EQUIPMENT
101-1000 μl Blue Graduated Pipet Tips	USA Scentific	1111-2821
10 ml Sterilized Pipet Individually Wrapped	USA Scentific	1071-0810
Ergonomic Variable Volume (100-1000 μl) Pipettor with tip ejector	VWR International Inc.	89079-974
Portable Pipet Aid, Drummond	VWR International Inc.	53498-103
Transfer Plastic Pipet Sterile	VWR International Inc.	14670-114
15 ml Conical Tube	USA Scentific	1475-1611
Sterile 18 gauge Needles	Becton, Dickinson and Co.	305196
Sterile 10 ml Syringes	Becton, Dickinson and Co.	305482
Plastic Syringe Filters Corning 0,20 μm pore size	Corning	431224
Acrodic 25 mm Syringe filter w/5 μm versapor Membrane	VWR International Inc.	28144-095
60x15 mm Petri Dish Sterile	VWR International Inc.	82050-548
100x15 mm Petri Dish Sterile	VWR International Inc.	82050-912
12 mm Diameter Glass Coverslips	VWR International Inc.	48300-560
Clear Cell Culture Plates 24 Well Flat Bottom w/lid	Thomas scientific	6902A09
Dumont #5- Fine Forceps	Fine Science Tools	11254-20
Centrifuge 5702	Eppendorf	22629883
Laminar Flow Hood
Inverted Microscope with x10 objective
Ambient air humidified Incubator