Enzymatisk fordøjelse og manuel dissociation: En metode til at forberede C. elegans embryoner til cellekultur

In This Article

Abstract

Kilde: Sangaletti, R. og Bianchi, L. A Metode til Dyrkning Embryonale C. elegans Celler. J. Vis. Exp. (2013).

Denne video introducerer en metode til at isolere og sterilt kultur embryonale C. elegans celler in vitro.

Protocol

1. Dissociation af embryonale celler

Udfør de næste trin i proceduren under sterile forhold ved hjælp af en laminar flow hætte. Mens dyr er kjole på bakterieplader, vasker og behandling med lysis løsning, der indeholder blegemiddel bør fjerne de fleste, hvis ikke alle bakterier. Således ved hjælp af en laminar hætte på dette tidspunkt af proceduren forhindrer ny forurening af ægget suspension.
Genbrugte pelleterede æg i 1 ml på 2 mg/ml chitinase (lager i ægbuffer pH 6.5) og overføre dem til et nyt sterilt 15 ml konisk rør. Rock røret i 10-30 minutter ved stuetemperatur. Den nøjagtige inkubationstid ændres i henhold til enzymets friskhed og rummets temperatur og bør derfor bestemmes for hvert præparat. Det anbefales at begynde at overvåge æggene under et omvendt cellekulturmikroskop efter 10 minutters inkubation. Bemærk: Det er vores erfaring, at lav pH øger chitinase enzymatisk aktivitet. Af denne grund bruger vi æg buffer på pH 6,5 til at opløse chitinase (opskrift rapporteret ovenfor, hvor pH er justeret til 6,5 ved hjælp af NaOH).
Når ~ 80% af æggeskallerne fordøjes af chitinase behandling(Figur 1 A-B), pellet æggene ved centrifugering på 900 x g (~ 2.500 rpm) i 3 min. Ved hjælp af en P1000 pipettor og sterile spidser fjernes forsigtigt supernatanten og tilsæt 3 ml L-15 medium.
Æggene overføres til en plade med en diameter på 6 cm, og cellerne adskilles forsigtigt ved hjælp af en 10 ml steril sprøjte, der er udstyret med en 18 G-nål. Overvåg graden af dissociation ved at placere en dråbe suspension i en frisk plast petriskål og ved at se under mikroskopet. Luft ikke ind i sprøjten under denne procedure for at undgå at beskadige celler. Fortsæt dissociationen, indtil ~ 80% af cellerne er adskilt.
Suspensionen filtreres med et sterilt Millipore-filter på 5 μm. Celleophæng skal filtreres for at fjerne celleklumper, ufordøjede æg og udklækkede larver. Filter yderligere 4-5 ml frisk L-15 medier gennem filteret for at inddrive alle cellerne. Brug ikke overdreven kraft under filtreringstrinnet for at undgå at beskadige filteret og/eller cellerne.

2. Dyrkning af celler

Pellet de dissociated celler ved centrifugation på 900 x g (~ 2.500 omdrejninger) i 3 min. Ved hjælp af en P1000 pipettor og sterile tips forsigtigt fjerne alle supernatant. De pelleterede celler genbruges i hele L-15-medium og plade 1 ml/brønd. Mængden af det tilføjede medie afhænger af antallet af anvendte 8P-plader, ormenes sammenløb på pladerne og den type eksperimenter, der udføres på cellerne. Celletætheden kan bestemmes ved hjælp af et hæmocytometer. For patch-klemme optagelser plating tæthed på ~ 230.000 celler / cm² er optimal.
Opbevar 24 brønde plade i en plastik Tupperware beholder, der indeholder våde papirhåndklæder for at undgå fordampning af kultur medium. Beholderen opbevares i en befugtet inkubator ved 20 °C og omgivende luft.
Cellerne er normalt klar til forsøgene inden for 24 timer, når den morfologiske differentiering og udtryk for GFP-markører er afsluttet. Celler kan opbevares i kultur i op til 2 uger, men de er normalt mest sunde op til 7-9 dage efter plating. Mediet skal udskiftes en gang om dagen for at opretholde sunde celler.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

figure-results-1
Figur 1. C. elegans embryoner før og efter chitinase behandling. (A) Fotografi af æg, før de udsættes for chitinase. Pilen peger på den gennemsigtige og intakte æggeskal omkring et foster. (B) Æg behandlet med chitinase i 10 min. Æggeskallerne er blevet fordøjet og er ikke længere synlige omkring embryonerne. Pilene peger på tredobbelte embryone...