Enzymatisk fordøjelse og manuel dissociation: En metode til at forberede C. elegans embryoner til cellekultur
Published: April 30, 2023
Abstract
Kilde: Sangaletti, R. og Bianchi, L. A Metode til Dyrkning Embryonale C. elegans Celler. J. Vis. Exp. (2013).
Denne video introducerer en metode til at isolere og sterilt kultur embryonale C. elegans celler in vitro.
Protocol
1. Dissociation af embryonale celler Udfør de næste trin i proceduren under sterile forhold ved hjælp af en laminar flow hætte. Mens dyr er kjole på bakterieplader, vasker og behandling med lysis løsning, der indeholder blegemiddel bør fjerne de fleste, hvis ikke alle bakterier. Således ved hjælp af en laminar hætte på dette tidspunkt af proceduren forhindrer ny forurening af ægget suspension. Genbrugte pelleterede æg i 1 ml på 2 mg/ml chitinase (lager i ægbuffer pH 6.5…
Representative Results
Figur 1. C. elegans embryoner før og efter chitinase behandling. (A) Fotografi af æg, før de udsættes for chitinase. Pilen peger på den gennemsigtige og intakte æggeskal omkring et foster. (B) Æg behandlet med chitinase i 10 min. Æggeskallerne er blevet fordøjet og er ikke længere synlige omkring embryonerne. Pilene peger på tredobb…
Materials
| REAGENTS | ||
| Leibovitz's L-15 Medium (1x) Liquid | Invitrogen | 11415-064 |
| Fetal Bovine Serum | Invitrogen | 16140-063 |
| Penicillin-streptomycin | Sigma | P4333-100ML |
| Chitinase from Streptomyces Griseus | Sigma | C6137-25UN |
| Peanut Lectin | Sigma | L0881-10MG |
| EQUIPMENT | ||
| 101-1000 μl Blue Graduated Pipet Tips | USA Scentific | 1111-2821 |
| 10 ml Sterilized Pipet Individually Wrapped | USA Scentific | 1071-0810 |
| Ergonomic Variable Volume (100-1000 μl) Pipettor with tip ejector | VWR International Inc. | 89079-974 |
| Portable Pipet Aid, Drummond | VWR International Inc. | 53498-103 |
| Transfer Plastic Pipet Sterile | VWR International Inc. | 14670-114 |
| 15 ml Conical Tube | USA Scentific | 1475-1611 |
| Sterile 18 gauge Needles | Becton, Dickinson and Co. | 305196 |
| Sterile 10 ml Syringes | Becton, Dickinson and Co. | 305482 |
| Plastic Syringe Filters Corning 0,20 μm pore size | Corning | 431224 |
| Acrodic 25 mm Syringe filter w/5 μm versapor Membrane | VWR International Inc. | 28144-095 |
| 60×15 mm Petri Dish Sterile | VWR International Inc. | 82050-548 |
| 100×15 mm Petri Dish Sterile | VWR International Inc. | 82050-912 |
| 12 mm Diameter Glass Coverslips | VWR International Inc. | 48300-560 |
| Clear Cell Culture Plates 24 Well Flat Bottom w/lid | Thomas scientific | 6902A09 |
| Dumont #5- Fine Forceps | Fine Science Tools | 11254-20 |
| Centrifuge 5702 | Eppendorf | 22629883 |
| Laminar Flow Hood | ||
| Inverted Microscope with x10 objective | ||
| Ambient air humidified Incubator |
Cite This Article
Enzymatic Digestion and Manual Dissociation: A Method to Prepare C. elegans Embryos for Cell Culture. J. Vis. Exp. (Pending Publication), e20159, doi: (2023).