Enzymatisk fordøjelse og manuel dissociation: En metode til at forberede C. elegans embryoner til cellekultur

Overview

Denne video introducerer en metode til at isolere og sterilt kultur embryonale C. elegans celler in vitro.

Protocol

1. Dissociation af embryonale celler

1. Udfør de næste trin i proceduren under sterile forhold ved hjælp af en laminar flow hætte. Mens dyr er kjole på bakterieplader, vasker og behandling med lysis løsning, der indeholder blegemiddel bør fjerne de fleste, hvis ikke alle bakterier. Således ved hjælp af en laminar hætte på dette tidspunkt af proceduren forhindrer ny forurening af ægget suspension.
2. Genbrugte pelleterede æg i 1 ml på 2 mg/ml chitinase (lager i ægbuffer pH 6.5) og overføre dem til et nyt sterilt 15 ml konisk rør. Rock røret i 10-30 minutter ved stuetemperatur. Den nøjagtige inkubationstid ændres i henhold til enzymets friskhed og rummets temperatur og bør derfor bestemmes for hvert præparat. Det anbefales at begynde at overvåge æggene under et omvendt cellekulturmikroskop efter 10 minutters inkubation. Bemærk: Det er vores erfaring, at lav pH øger chitinase enzymatisk aktivitet. Af denne grund bruger vi æg buffer på pH 6,5 til at opløse chitinase (opskrift rapporteret ovenfor, hvor pH er justeret til 6,5 ved hjælp af NaOH).
3. Når ~ 80% af æggeskallerne fordøjes af chitinase behandling(Figur 1 A-B), pellet æggene ved centrifugering på 900 x g (~ 2.500 rpm) i 3 min. Ved hjælp af en P1000 pipettor og sterile spidser fjernes forsigtigt supernatanten og tilsæt 3 ml L-15 medium.
4. Æggene overføres til en plade med en diameter på 6 cm, og cellerne adskilles forsigtigt ved hjælp af en 10 ml steril sprøjte, der er udstyret med en 18 G-nål. Overvåg graden af dissociation ved at placere en dråbe suspension i en frisk plast petriskål og ved at se under mikroskopet. Luft ikke ind i sprøjten under denne procedure for at undgå at beskadige celler. Fortsæt dissociationen, indtil ~ 80% af cellerne er adskilt.
5. Suspensionen filtreres med et sterilt Millipore-filter på 5 μm. Celleophæng skal filtreres for at fjerne celleklumper, ufordøjede æg og udklækkede larver. Filter yderligere 4-5 ml frisk L-15 medier gennem filteret for at inddrive alle cellerne. Brug ikke overdreven kraft under filtreringstrinnet for at undgå at beskadige filteret og/eller cellerne.

2. Dyrkning af celler

1. Pellet de dissociated celler ved centrifugation på 900 x g (~ 2.500 omdrejninger) i 3 min. Ved hjælp af en P1000 pipettor og sterile tips forsigtigt fjerne alle supernatant. De pelleterede celler genbruges i hele L-15-medium og plade 1 ml/brønd. Mængden af det tilføjede medie afhænger af antallet af anvendte 8P-plader, ormenes sammenløb på pladerne og den type eksperimenter, der udføres på cellerne. Celletætheden kan bestemmes ved hjælp af et hæmocytometer. For patch-klemme optagelser plating tæthed på ~ 230.000 celler / cm² er optimal.
2. Opbevar 24 brønde plade i en plastik Tupperware beholder, der indeholder våde papirhåndklæder for at undgå fordampning af kultur medium. Beholderen opbevares i en befugtet inkubator ved 20 °C og omgivende luft.
3. Cellerne er normalt klar til forsøgene inden for 24 timer, når den morfologiske differentiering og udtryk for GFP-markører er afsluttet. Celler kan opbevares i kultur i op til 2 uger, men de er normalt mest sunde op til 7-9 dage efter plating. Mediet skal udskiftes en gang om dagen for at opretholde sunde celler.

Representative Results

Figur 1. C. elegans embryoner før og efter chitinase behandling. (A) Fotografi af æg, før de udsættes for chitinase. Pilen peger på den gennemsigtige og intakte æggeskal omkring et foster. (B) Æg behandlet med chitinase i 10 min. Æggeskallerne er blevet fordøjet og er ikke længere synlige omkring embryonerne. Pilene peger på tredobbelte embryoner frigivet fra æggeskallen. Den blå boks omgiver en gruppe celler, der stadig er knyttet til hinanden.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
REAGENTS
Leibovitz's L-15 Medium (1x) Liquid	Invitrogen	11415-064
Fetal Bovine Serum	Invitrogen	16140-063
Penicillin-streptomycin	Sigma	P4333-100ML
Chitinase from Streptomyces Griseus	Sigma	C6137-25UN
Peanut Lectin	Sigma	L0881-10MG
EQUIPMENT
101-1000 μl Blue Graduated Pipet Tips	USA Scentific	1111-2821
10 ml Sterilized Pipet Individually Wrapped	USA Scentific	1071-0810
Ergonomic Variable Volume (100-1000 μl) Pipettor with tip ejector	VWR International Inc.	89079-974
Portable Pipet Aid, Drummond	VWR International Inc.	53498-103
Transfer Plastic Pipet Sterile	VWR International Inc.	14670-114
15 ml Conical Tube	USA Scentific	1475-1611
Sterile 18 gauge Needles	Becton, Dickinson and Co.	305196
Sterile 10 ml Syringes	Becton, Dickinson and Co.	305482
Plastic Syringe Filters Corning 0,20 μm pore size	Corning	431224
Acrodic 25 mm Syringe filter w/5 μm versapor Membrane	VWR International Inc.	28144-095
60x15 mm Petri Dish Sterile	VWR International Inc.	82050-548
100x15 mm Petri Dish Sterile	VWR International Inc.	82050-912
12 mm Diameter Glass Coverslips	VWR International Inc.	48300-560
Clear Cell Culture Plates 24 Well Flat Bottom w/lid	Thomas scientific	6902A09
Dumont #5- Fine Forceps	Fine Science Tools	11254-20
Centrifuge 5702	Eppendorf	22629883
Laminar Flow Hood
Inverted Microscope with x10 objective
Ambient air humidified Incubator