Overview
このビデオでは、インビトロで胚性C.エレガンス細胞を単離し、無菌培養する方法を紹介します。
Protocol
1. 胚細胞解離
- 層流フードを使用して滅菌条件下で手順の次のステップを行います。動物は細菌プレートにガウンを着ているが、漂白剤を含む溶解溶液による溶解と治療は、すべての細菌ではないにしても、最も排除すべきである。したがって、手順のこの時点で層状フードを使用すると、卵の懸濁液の新たな汚染を防ぐことができます。
- ペレット化した卵を1mlの2mg/mlのチチナーゼ(卵バッファーpH 6.5のストック)で再懸濁し、新しい滅菌15ml円錐管に移します。室温で10〜30分間チューブを揺らします。正確なインキュベーション時間は、酵素の新鮮さと部屋の温度に応じて変化するため、各調製物について決定する必要があります。インキュベーションの10分後に、逆細胞培養顕微鏡で卵のモニタリングを開始することをお勧めします。注:我々の経験では、低pHは、チチナーゼ酵素活性を増加させる。このため、我々は、ピチナーゼを溶解するためにpH 6.5で卵バッファーを使用しています (上記のレシピ, pHはNaOHを使用して6.5に調整されます).
- ~80%の卵殻がキチナーゼ処理(図1A-B)によって消化されると、卵を900xg(〜2,500rpm)で3分間遠心分離してペレット状にする。P1000ピペットと滅菌チップを使用して、上清を慎重に取り出し、3mlのL-15培地を加えます。
- 直径6cmのプレートに卵を移し、18G針を装着した10mlの滅菌シリンジを使用して細胞を穏やかに解約します。新鮮なプラスチックペトリ皿にサスペンションの滴を入れ、顕微鏡で見ることによって解離の程度を監視します。細胞に損傷を与えないようにするために、この手順の間に空気を注射器に吸引しないでください。解離を続けて、細胞の80%が解離されるまで続ける。
- 滅菌5 μm ミリポアフィルターを使用して懸濁液をフィルター処理します。細胞の塊、未消化の卵、孵化した幼虫を除去するために細胞懸濁液を濾過する必要があります。フィルターを介して新鮮なL-15培地の追加4-5 mlをフィルターし、すべてのセルを回復します。フィルターや細胞の損傷を避けるために、濾過工程中に過度の力を使用しないでください。
2. 細胞の培養
- ペレットは、900xg(〜2,500rpm)で遠心分離して3分間解約した細胞を表す。P1000ピペットと滅菌チップを使用して慎重にすべての上清を除去します。ペレット化した細胞を完全なL-15培地に再懸濁し、プレート1 ml/wellにします。添加される培地の量は、使用される8Pプレートの数、プレート上のワームの合流点、および細胞上で行われる実験の種類によって異なります。細胞密度は、ヘモサイトメーターを用いて決定することができる。パッチクランプ記録の場合、メッキ密度~230,000セル/cm2が最適です。
- 24個のウェルプレートを、湿ったペーパータオルを含むプラスチック製のタッパーウェア容器に入れて、培養液の蒸発を避けます。20°Cと周囲空気で加湿インキュベーターに容器を保管してください。
- 細胞は通常、GFPマーカーの形態的分化および発現が完了すると、24時間以内に実験の準備が整う。細胞は2週間まで培養することができますが、通常はめっき後7〜9日まで最も健康です。健康な細胞を維持するために、培地は1日1回交換する必要があります。
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Representative Results
図 1.C.エレガンス胚は、チチナーゼ治療の前後に起こる。(A)チチナーゼに曝される前の卵の写真。矢印は、胚を取り巻く透明で無傷の卵殻を指しています。(B)卵を10分間、チチナーゼで処理した。卵殻は消化され、胚の周りにはもはや見えません。矢印は卵殻から放出された3倍の胚を指しています。青いボックスは、互いにまだ接続されているセルのグループを囲みます。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENTS | |||
| Leibovitz's L-15 Medium (1x) Liquid | Invitrogen | 11415-064 | |
| Fetal Bovine Serum | Invitrogen | 16140-063 | |
| Penicillin-streptomycin | Sigma | P4333-100ML | |
| Chitinase from Streptomyces Griseus | Sigma | C6137-25UN | |
| Peanut Lectin | Sigma | L0881-10MG | |
| EQUIPMENT | |||
| 101-1000 μl Blue Graduated Pipet Tips | USA Scentific | 1111-2821 | |
| 10 ml Sterilized Pipet Individually Wrapped | USA Scentific | 1071-0810 | |
| Ergonomic Variable Volume (100-1000 μl) Pipettor with tip ejector | VWR International Inc. | 89079-974 | |
| Portable Pipet Aid, Drummond | VWR International Inc. | 53498-103 | |
| Transfer Plastic Pipet Sterile | VWR International Inc. | 14670-114 | |
| 15 ml Conical Tube | USA Scentific | 1475-1611 | |
| Sterile 18 gauge Needles | Becton, Dickinson and Co. | 305196 | |
| Sterile 10 ml Syringes | Becton, Dickinson and Co. | 305482 | |
| Plastic Syringe Filters Corning 0,20 μm pore size | Corning | 431224 | |
| Acrodic 25 mm Syringe filter w/5 μm versapor Membrane | VWR International Inc. | 28144-095 | |
| 60x15 mm Petri Dish Sterile | VWR International Inc. | 82050-548 | |
| 100x15 mm Petri Dish Sterile | VWR International Inc. | 82050-912 | |
| 12 mm Diameter Glass Coverslips | VWR International Inc. | 48300-560 | |
| Clear Cell Culture Plates 24 Well Flat Bottom w/lid | Thomas scientific | 6902A09 | |
| Dumont #5- Fine Forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Centrifuge 5702 | Eppendorf | 22629883 | |
| Laminar Flow Hood | |||
| Inverted Microscope with x10 objective | |||
| Ambient air humidified Incubator |
