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Encyclopedia of Experiments

Enzymatische Verdauung und manuelle Dissoziation: Eine Methode zur Vorbereitung von C. elegans Embryonen auf die Zellkultur

Overview

Dieses Video stellt eine Methode vor, um embryonale C. elegans-Zellen in vitro zu isolieren und steril zu kulturisieren.

Protocol

1. Embryonale Zelldissoziation

  1. Führen Sie die nächsten Schritte des Verfahrens unter sterilen Bedingungen mit einer laminaren Durchflusshaube durch. Während Tiere auf Bakterienplatten gekleidet sind, sollten die Wässer und die Behandlung mit der Lyselösung, die Bleichmittel enthält, die meisten, wenn nicht alle Bakterien eliminieren. So verhindert die Verwendung einer laminaren Haube an dieser Stelle des Verfahrens eine erneute Kontamination der Eisuspension.
  2. Pelleteier in 1 ml 2 mg/ml Chitinase (Vorrat im Eipuffer pH 6,5) aufheben und in eine neue sterile 15 ml konische Röhre geben. Rock die Röhre für 10-30 min bei Raumtemperatur. Die genaue Inkubationszeit ändert sich entsprechend der Frische des Enzyms und der Raumtemperatur und sollte daher für jede Zubereitung bestimmt werden. Es wird empfohlen, die Eier nach 10 min Inkubation unter einem invertierten Zellkulturmikroskop zu überwachen. Hinweis: Unserer Erfahrung nach erhöht ein niedriger pH-Wert die enzymatische Aktivität der Chitinase. Aus diesem Grund verwenden wir den Eipuffer bei pH 6,5, um Chitinase aufzulösen (Rezept oben berichtet, wobei der pH-Wert mit NaOH auf 6,5 eingestellt wird).
  3. Wenn 80% der Eierschalen durch die Chitinase-Behandlung verdaut werden (Abbildungen 1 A-B), pellet die Eier durch Zentrifugation bei 900 x g (ca. 2.500 U/min) für 3 min. Mit einem P1000 Pipettor und sterilen Spitzen, entfernen Sie vorsichtig den Überstand und fügen Sie 3 ml L-15 Medium.
  4. Übertragen Sie die Eier in eine Platte mit einem Durchmesser von 6 cm und lösen Sie die Zellen vorsichtig mit einer 10 ml sterilen Spritze, die mit einer 18 G Nadel ausgestattet ist. Überwachen Sie den Grad der Dissoziation, indem Sie einen Tropfen Suspension in eine frische Petrischale aus Kunststoff legen und unter dem Mikroskop betrachten. Während dieses Verfahrens keine Luft in die Spritze absaugen, um schädliche Zellen zu vermeiden. Setzen Sie die Dissoziation fort, bis 80 % der Zellen dissoziiert sind.
  5. Filtern Sie die Suspension mit einem sterilen 5-m-Millipore-Filter. Zellsuspensionen müssen gefiltert werden, um Zellklumpen, unverdaute Eier und geschlüpfte Larven zu entfernen. Filtern Sie zusätzliche 4-5 ml frische L-15-Medien durch den Filter, um alle Zellen wiederherzustellen. Verwenden Sie während des Filtrationsschritts keine übermäßige Kraft, um eine Beschädigung des Filters und/oder der Zellen zu vermeiden.

2. Culturing Cells

  1. Pellet die dissoziierten Zellen durch Zentrifugation bei 900 x g (ca. 2.500 U/min) für 3 min. Mit einem P1000 Pipettor und sterilen Spitzen entfernen Sie sorgfältig alle Überstand. Die Pelletzellen in vollständigem L-15-Medium und Platte 1 ml/well wieder aufhängen. Die Menge des hinzugefügten Mediums hängt von der Anzahl der verwendeten 8P-Platten, dem Zusammenfluss der Würmer auf den Platten und der Art der Experimente ab, die an den Zellen durchgeführt werden. Die Zelldichte kann mit einem Hämozytometer bestimmt werden. Für Patch-Clamp-Aufnahmen ist die Beschichtungsdichte von 230.000Zellen/cm2 optimal.
  2. Bewahren Sie die 24 Brunnenplatte in einem Tupperware-Kunststoffbehälter mit nassen Papiertüchern auf, um eine Verdunstung des Kulturmediums zu vermeiden. Bewahren Sie den Behälter in einem befeuchteten Inkubator bei 20 °C und Umgebungsluft auf.
  3. Die Zellen sind in der Regel innerhalb von 24 Stunden für die Experimente bereit, wenn die morphologische Differenzierung und Expression von GFP-Markern abgeschlossen sind. Zellen können in Kultur für bis zu 2 Wochen gehalten werden, aber sie sind in der Regel am meisten gesund bis zu 7-9 Tage nach der Beschichtung. Das Medium muss einmal täglich ausgetauscht werden, um gesunde Zellen zu erhalten.

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Representative Results

Figure 1
Abbildung 1. C. elegans Embryonen vor und nach der Chitinase-Behandlung. (A) Foto von Eiern vor der Chitinase. Der Pfeil zeigt auf die transparente und intakte Eierschale, die einen Embryo umgibt. (B) Eier, die 10 min lang mit Chitinase behandelt wurden. Die Eierschalen sind verdaut und sind um die Embryonen herum nicht mehr sichtbar. Die Pfeile zeigen auf dreifache Embryonen, die aus der Eierschale freigesetzt werden. Das blaue Feld umgibt eine Gruppe von Zellen, die noch miteinander verbunden sind.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
REAGENTS
Leibovitz's L-15 Medium (1x) Liquid Invitrogen 11415-064
Fetal Bovine Serum Invitrogen 16140-063
Penicillin-streptomycin Sigma P4333-100ML
Chitinase from Streptomyces Griseus Sigma C6137-25UN
Peanut Lectin Sigma L0881-10MG
EQUIPMENT
101-1000 μl Blue Graduated Pipet Tips USA Scentific 1111-2821
10 ml Sterilized Pipet Individually Wrapped USA Scentific 1071-0810
Ergonomic Variable Volume (100-1000 μl) Pipettor with tip ejector VWR International Inc. 89079-974
Portable Pipet Aid, Drummond VWR International Inc. 53498-103
Transfer Plastic Pipet Sterile VWR International Inc. 14670-114
15 ml Conical Tube USA Scentific 1475-1611
Sterile 18 gauge Needles Becton, Dickinson and Co. 305196
Sterile 10 ml Syringes Becton, Dickinson and Co. 305482
Plastic Syringe Filters Corning 0,20 μm pore size Corning 431224
Acrodic 25 mm Syringe filter w/5 μm versapor Membrane VWR International Inc. 28144-095
60x15 mm Petri Dish Sterile VWR International Inc. 82050-548
100x15 mm Petri Dish Sterile VWR International Inc. 82050-912
12 mm Diameter Glass Coverslips VWR International Inc. 48300-560
Clear Cell Culture Plates 24 Well Flat Bottom w/lid Thomas scientific 6902A09
Dumont #5- Fine Forceps Fine Science Tools 11254-20
Centrifuge 5702 Eppendorf 22629883
Laminar Flow Hood
Inverted Microscope with x10 objective
Ambient air humidified Incubator

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Enzymatische Verdauung und manuelle Dissoziation: Eine Methode zur Vorbereitung von <em>C. elegans</em> Embryonen auf die Zellkultur
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Quelle: Sangaletti, R. und Bianchi, L. A Method for Culturing Embryonic C. elegans Cells. J. Vis. (2013). 

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