Enzymatisk matsmältning och manuell dissociation: En metod för att förbereda C. elegans embryon för cellkultur

Overview

Denna video introducerar en metod för att isolera och sterilt odla embryonala C. elegans celler in vitro.

Protocol

1. Dissociation av embryonala celler

1. Utför nästa steg i proceduren under sterila förhållanden med hjälp av en laminär flödeshuv. Medan djur är klänningar på bakterieplattor, bör tvättarna och behandlingen med lyslösningen som innehåller blekmedel eliminera de flesta om inte alla bakterier. Således med hjälp av en laminar huva vid denna tidpunkt av förfarandet förhindrar ny förorening av äggsuspensionen.
2. Återanvänd pelleterade ägg i 1 ml 2 mg/ml chitinas (bestånd i äggbuffert pH 6.5) och överför dem till ett nytt sterilt 15 ml koniskt rör. Gunga röret i 10-30 min vid rumstemperatur. Den exakta inkubationstiden ändras beroende på enzymets färskhet och rummets temperatur och bör därför bestämmas för varje beredning. Det rekommenderas att börja övervaka äggen under ett inverterat cellkulturmikroskop efter 10 minuters inkubation. Observera: enligt vår erfarenhet ökar lågt pH chitinas enzymatisk aktivitet. Av denna anledning använder vi äggbuffert vid pH 6,5 för att lösa upp chitinas (recept rapporterat ovan, där pH justeras till 6,5 med NaOH).
3. När ~ 80% av äggskalen smälts av chitinasbehandlingen (figur 1 A-B), pellet ägget genom centrifugering vid 900 x g (~ 2 500 rpm) i 3 min. Använd en P1000 pipetor och sterila spetsar, ta försiktigt bort supernaten och tillsätt 3 ml L-15 medium.
4. Överför äggen till en 6 cm diameter tallrik och försiktigt dissociera cellerna med en 10 ml steril spruta utrustad med en 18 G nål. Övervaka graden av dissociation genom att placera en droppe suspension i en färsk petriskål av plast och genom att titta under mikroskopet. Aspirera inte in luft i sprutan under detta förfarande för att undvika att skada celler. Fortsätt dissociationen tills ~ 80% av cellerna är dissocierade.
5. Filtrera suspensionen med ett sterilt 5 μm Millipore-filter. Cellupphängningar måste filtreras för att avlägsna cellklumpar, osmälta ägg och kläckta larver. Filtrera ytterligare 4-5 ml färskt L-15-medium genom filtret för att återställa alla celler. Använd inte överdriven kraft under filtreringssteget för att undvika att skada filtret och/eller cellerna.

2. Odlingsceller

1. Pellet de dissocierade cellerna genom centrifugering vid 900 x g (~ 2 500 rpm) i 3 min. Använd en P1000 pipetor och sterila spetsar försiktigt ta bort all supernatant. Återanvänd de pelleterade cellerna i komplett L-15 medium och platta 1 ml/brunn. Mängden medium som tillsätts beror på antalet 8P-plattor som används, sammanflödet av maskarna på plattorna och vilken typ av experiment som kommer att utföras på cellerna. Celltätheten kan bestämmas med hjälp av en hemocytometer. För patchklämmainspelningar är pläteringstätheten ~ 230 000 celler/cm² optimal.
2. Förvara 24 brunnsplattan i en Tupperware-behållare av plast som innehåller våta pappershanddukar för att undvika avdunstning av odlingsmedium. Förvara behållaren i en fuktad inkubator vid 20 °C och omgivningsluft.
3. Cellerna är vanligtvis redo för experimenten inom 24 timmar när den morfologiska differentiering och uttryck av GFP-markörer är klar. Celler kan hållas i kultur i upp till 2 veckor men de är vanligtvis mest friska upp till 7-9 dagar efter plätering. Mediet måste bytas ut en gång om dagen för att upprätthålla friska celler.

Representative Results

Figur 1. C. elegans embryon före och efter chitinas behandling. a) Fotografi av ägg före exponering för chitinas. Pilen pekar på det genomskinliga och intakta äggskalet som omger ett embryo. B) Ägg behandlade med chitinas i 10 minuter. Äggskalen har smälts och syns inte längre runt embryona. Pilarna pekar på trefaldiga embryon som frigörs från äggskalet. Den blå rutan omger en grupp celler som fortfarande är kopplade till varandra.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
REAGENTS
Leibovitz's L-15 Medium (1x) Liquid	Invitrogen	11415-064
Fetal Bovine Serum	Invitrogen	16140-063
Penicillin-streptomycin	Sigma	P4333-100ML
Chitinase from Streptomyces Griseus	Sigma	C6137-25UN
Peanut Lectin	Sigma	L0881-10MG
EQUIPMENT
101-1000 μl Blue Graduated Pipet Tips	USA Scentific	1111-2821
10 ml Sterilized Pipet Individually Wrapped	USA Scentific	1071-0810
Ergonomic Variable Volume (100-1000 μl) Pipettor with tip ejector	VWR International Inc.	89079-974
Portable Pipet Aid, Drummond	VWR International Inc.	53498-103
Transfer Plastic Pipet Sterile	VWR International Inc.	14670-114
15 ml Conical Tube	USA Scentific	1475-1611
Sterile 18 gauge Needles	Becton, Dickinson and Co.	305196
Sterile 10 ml Syringes	Becton, Dickinson and Co.	305482
Plastic Syringe Filters Corning 0,20 μm pore size	Corning	431224
Acrodic 25 mm Syringe filter w/5 μm versapor Membrane	VWR International Inc.	28144-095
60x15 mm Petri Dish Sterile	VWR International Inc.	82050-548
100x15 mm Petri Dish Sterile	VWR International Inc.	82050-912
12 mm Diameter Glass Coverslips	VWR International Inc.	48300-560
Clear Cell Culture Plates 24 Well Flat Bottom w/lid	Thomas scientific	6902A09
Dumont #5- Fine Forceps	Fine Science Tools	11254-20
Centrifuge 5702	Eppendorf	22629883
Laminar Flow Hood
Inverted Microscope with x10 objective
Ambient air humidified Incubator