Enzymatisk matsmältning och manuell dissociation: En metod för att förbereda C. elegans embryon för cellkultur

In This Article

Abstract

Källa: Sangaletti, R. och Bianchi, L. A Metod för odling av embryonala C. elegansceller. J. Vis. Exp. (2013).

Denna video introducerar en metod för att isolera och sterilt odla embryonala C. elegans celler in vitro.

Protocol

1. Dissociation av embryonala celler

Utför nästa steg i proceduren under sterila förhållanden med hjälp av en laminär flödeshuv. Medan djur är klänningar på bakterieplattor, bör tvättarna och behandlingen med lyslösningen som innehåller blekmedel eliminera de flesta om inte alla bakterier. Således med hjälp av en laminar huva vid denna tidpunkt av förfarandet förhindrar ny förorening av äggsuspensionen.
Återanvänd pelleterade ägg i 1 ml 2 mg/ml chitinas (bestånd i äggbuffert pH 6.5) och överför dem till ett nytt sterilt 15 ml koniskt rör. Gunga röret i 10-30 min vid rumstemperatur. Den exakta inkubationstiden ändras beroende på enzymets färskhet och rummets temperatur och bör därför bestämmas för varje beredning. Det rekommenderas att börja övervaka äggen under ett inverterat cellkulturmikroskop efter 10 minuters inkubation. Observera: enligt vår erfarenhet ökar lågt pH chitinas enzymatisk aktivitet. Av denna anledning använder vi äggbuffert vid pH 6,5 för att lösa upp chitinas (recept rapporterat ovan, där pH justeras till 6,5 med NaOH).
När ~ 80% av äggskalen smälts av chitinasbehandlingen (figur 1 A-B), pellet ägget genom centrifugering vid 900 x g (~ 2 500 rpm) i 3 min. Använd en P1000 pipetor och sterila spetsar, ta försiktigt bort supernaten och tillsätt 3 ml L-15 medium.
Överför äggen till en 6 cm diameter tallrik och försiktigt dissociera cellerna med en 10 ml steril spruta utrustad med en 18 G nål. Övervaka graden av dissociation genom att placera en droppe suspension i en färsk petriskål av plast och genom att titta under mikroskopet. Aspirera inte in luft i sprutan under detta förfarande för att undvika att skada celler. Fortsätt dissociationen tills ~ 80% av cellerna är dissocierade.
Filtrera suspensionen med ett sterilt 5 μm Millipore-filter. Cellupphängningar måste filtreras för att avlägsna cellklumpar, osmälta ägg och kläckta larver. Filtrera ytterligare 4-5 ml färskt L-15-medium genom filtret för att återställa alla celler. Använd inte överdriven kraft under filtreringssteget för att undvika att skada filtret och/eller cellerna.

2. Odlingsceller

Pellet de dissocierade cellerna genom centrifugering vid 900 x g (~ 2 500 rpm) i 3 min. Använd en P1000 pipetor och sterila spetsar försiktigt ta bort all supernatant. Återanvänd de pelleterade cellerna i komplett L-15 medium och platta 1 ml/brunn. Mängden medium som tillsätts beror på antalet 8P-plattor som används, sammanflödet av maskarna på plattorna och vilken typ av experiment som kommer att utföras på cellerna. Celltätheten kan bestämmas med hjälp av en hemocytometer. För patchklämmainspelningar är pläteringstätheten ~ 230 000 celler/cm² optimal.
Förvara 24 brunnsplattan i en Tupperware-behållare av plast som innehåller våta pappershanddukar för att undvika avdunstning av odlingsmedium. Förvara behållaren i en fuktad inkubator vid 20 °C och omgivningsluft.
Cellerna är vanligtvis redo för experimenten inom 24 timmar när den morfologiska differentiering och uttryck av GFP-markörer är klar. Celler kan hållas i kultur i upp till 2 veckor men de är vanligtvis mest friska upp till 7-9 dagar efter plätering. Mediet måste bytas ut en gång om dagen för att upprätthålla friska celler.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

figure-results-1
Figur 1. C. elegans embryon före och efter chitinas behandling. a) Fotografi av ägg före exponering för chitinas. Pilen pekar på det genomskinliga och intakta äggskalet som omger ett embryo. B) Ägg behandlade med chitinas i 10 minuter. Äggskalen har smälts och syns inte längre runt embryona. Pilarna pekar på trefaldiga embryon som frigörs från ä...