Summary
Özetlenen protokol, HiBiT-reseptör bağlayıcı etki alanı protein kompleksinin üretilmesi prosedürünü ve SARS-CoV-2 antikorlarının hızlı ve hassas tespiti için uygulanmasını açıklar.
Abstract
COVID-19 pandemisinin ortaya çıkması, şiddetli akut solunum sendromu coronavirus 2'nin (SARS-CoV-2) epidemiyolojik etkisini belirlemek için daha iyi serolojik tespit yöntemlerine olan ihtiyacı artırmıştır. SARS-CoV-2 enfeksiyonlarının sayısının artması, daha iyi antikor tespiti testlerine olan ihtiyacı artırmaktadır. Mevcut antikor algılama yöntemleri hız için hassasiyeti tehlikeye atmaktadır veya hassastır ancak zaman alıcıdır. SARS-CoV-2 nötralize edici antikorların büyük bir kısmı SARS-CoV-2'nin birincil immünojenik bölmelerinden biri olan reseptör bağlayıcı etki alanını (RBD) hedef alıyor. Sars-CoV-2 antikorlarını tespit etmek için son derece hassas, biyolüminesan etiketli bir RBD (NanoLuc HiBiT-RBD) tasarladık ve geliştirdik. Aşağıdaki metinde HiBiT-RBD kompleksini üretme prosedürü ve bu aracı kullanarak RBD hedefleme antikorlarının varlığını değerlendirmek için hızlı bir test açıklanmaktadır. HiBiT-RBD protein ürününün çok çeşitli sıcaklıklar üzerindeki dayanıklılığı ve 1 saat içinde tamamlanabilen daha kısa deneysel prosedür nedeniyle, protokol hasta serum örneklerinde SARS-CoV-2 antikorlarını tespit etmek için daha verimli bir alternatif olarak düşünülebilir.
Introduction
Sars-CoV21 adlı yeni bir koronavirüsün ortaya çıkışı, 30 Mart 20212 itibarıyla 2 milyon 800 binden fazla can kaybına ve 128 milyon enfeksiyona neden oldu. SARS-CoV-2 klinik tedavileri için güvenilir ve köklü bir tedavi prosedürünün olmaması nedeniyle, daha fazla viral bulaşmayı kısıtlamak ve daha da önemlisi etkili ve sağlam bir tedavi veya aşı geliştirmek için birçok çaba yapılmıştır3. Bugüne kadar, Dünya Sağlık Örgütü tarafından bildirilen çalışmalarda 50'den fazla COVID-19 aşı adayı var4. SARS-CoV-2'ye karşı antikorların tespiti, aşının ve COVID-195'in iyileşmiş hastalarında, humoral yanıtın uzun vadeli stabilitesini belirlemek için son derece önemlidir. Bazı çalışmalar, iyileşen SARS-CoV-2 hastalarının 1 yıl sonra RBD bağlayıcı antikorların çoğunu kaybetme olasılığının olduğunu göstermiştir5,6,7,8,9. Kalıcı bağışıklığı daha iyi anlamak için daha fazla araştırma yapılması gerekir ve daha hassas antikor tespit platformları bu tür çalışmaların daha fazla yapılmasına yardımcı olabilir. Uzun süreli antikor yanıtları öneren hafif SARS-CoV-2 enfeksiyonlarının sürekli bağışıklığı raporları da ilginç ve değerli bir çalışma alanıdır. Popülasyondaki bağışıklık hakkında daha fazla bilgi sağlamak için bireylerin serasındaki antikorların izlenmesi için hızlı ve doğru bir tespit yöntemi gereklidir.
Diğer koronavirüsler gibi SARS-CoV-2 de viral ve hücre zarlarının füzyonuna yol açan olayların bir basamaklarını başlatmak için anjiyotensin dönüştürücü enzim-2'ye (ACE2) bağlanmak için çıkıntılı başak glikoproteini kullanır6,7. Son zamanlarda yapılan çeşitli çalışmalar, Spike proteininin RBD'sinin SARS-CoV28,9,10,11'e karşı güçlü ve spesifik antikor yanıtının ortaya çıkarırken çok önemli bir role sahip olduğunu kanıtlamaktadır. Özellikle, Premkumar ve ark. tarafından RBD bağlayıcı antikor titresi ile hastaların plazmasının SARS-CoV-2 nötralizasyon gücü arasında gözlenen korelasyonlar, RBD'nin virüs yapısının immünojenik bir bölmesi olmasıyla tutarlıdır9. Bunu göz önünde bulundurarak, SARS-CoV-2 antikor tespiti için mevcut birçok tanı testi zaman ve maliyet yoğundur, uzun bir kuluçka ve yıkama prosedürü gerektirir (enzime bağlı immünosorbent testi [ELISA]) veya hassasiyet ve doğruluktan yoksundur (lateral akış immünoassay [LFIA])12. Bu nedenle, YÜKSEK hassasiyet, hızlı yanıt ve nispeten düşük maliyetli COVID-19 türevi antikor tespitinin nicel ve hızlı bir tamamlayıcı serolojik yöntemi, SARS-CoV-2 epidemiyolojik gözetimi için güvenilir bir serolojik test ihtiyacına hizmet edecektir.
Toplu olarak, mevcut serolojik tahlillerin sınırlamaları, biyolüminesan raporlama sisteminin gelecekteki serosurveylerde potansiyel bir tanı ajanı olarak araştırılmasına neden oldu. Biyolüminesans, ışık emisyonu ile doğal olarak oluşan bir enzim / substrat reaksiyonudur. Nanoluc luciferaz en küçük (19 kDa), ancak Renilla ve firefly luciferase (sırasıyla 36 kDa ve 61 kDa) ile karşılaştırıldığında en parlak sistemdir 13,14. Ayrıca, Nanoluc daha önce bahsedilen sistemler arasında gürültü oranına ve stabilitesine en yüksek sinyale sahiptir. Nanoluc'un yüksek sinyal yoğunluğu, çok düşük miktarlarda muhabir füzyonlarının bile algılanmasını destekler15. Nanoluc İkili Teknolojisi (NanoBiT), nanoluc sisteminin iki segmenti olan bölünmüş bir versiyonudur: küçük BiT (11 amino asit; SmBiT) ve nispeten düşük benzeşimli etkileşimlere sahip büyük BiT (LgBiT) (KD = 190 μM) bir lüminesan kompleksi oluşturmak için16. NanoBiT, protein-protein etkileşimlerinin tanımlanmasını içeren çeşitli çalışmalarda yaygın olarak kullanılmaktadır15,17,18,19 ve hücresel sinyal yolları11,20,21.
Son zamanlarda, LGBiT'ye belirgin şekilde daha yüksek bir benzeğe sahip başka bir küçük peptit (KD = 0.7 nM), yani SmBiT yerine HiBiT Nano-Glo sistemi tanıtıldı. Nano-Glo "ekle-karıştır-oku" testinin yüksek benzeşimi ve güçlü sinyali, HiBiT'i uygun, nicel, parlak bir peptit etiketi yapar. Bu yaklaşımda, HiBiT etiketi minimum yapısal parazit uygulayan bir yapı geliştirilerek hedef proteine eklenir. HiBiT-protein füzyonu aktif olarak LgBiT muadili'ne bağlanacak ve algılama reaktiflerinin varlığında tespit edilebilir biyolüminesans üretmek için son derece aktif bir luciferaz enzimi üretecektir (Şekil 1). Benzer şekilde, SARS-CoV-2'nin kurtardığı bireylerin serasında nötralize edici antikor titresini kolayca ölçmek için HiBiT Nano-Glo tabanlı bir sistem geliştirdik ve yakın zamanda HiBiT etiketli bir SARS-CoV-2 RBD geliştirdik. Bu makalede, standart laboratuvar prosedürleri ve ekipmanları kullanılarak HiBiT-RBD biyoreporterinin üretilmesine ilişkin protokol açıklanmaktadır ve bu biyoreporterin SARS-CoV-2 RBD hedefleme antikorlarını tespit etmek için hızlı ve verimli bir testte nasıl kullanılabileceğini göstermektedir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
NOT: Aşağıda açıklanan protokol, 20200371-01H protokol koduna göre tüm etik kurallara uyar.
1. HiBiT-RBD biyo-raporlayıcının üretimi ve değerlendirilmesi
- Yeterli miktarda HiBiT-RBD biyoreporter üretmek
- Hücre kültürüne hazırlanın
- %10 fetal sığır serumu ve %1 penisilin/streptomisin içeren tam Dulbecco modifiye Eagle ortasını (DMEM) hazırlayın. Ardından, medyayı 37 °C'lik bir su banyosunda ısıtın.
- Biyolojik güvenlik kabinini (BSC) açın ve kabin yüzeyini sterilize etmek için% 70 v/ v etanol kullanın.
- Hücre satırını kültüre edin.
- Hücre hattını -80 °C veya sıvı azottan çıkar ve 37 °C'lik bir su banyosunda çözün.
NOT: Uygun bir hücre hattının kültürde bakımı kolaydır, yüksek transfeksiyon verimliliğine sahiptir ve eksojen protein üretimi için uygundur. Bu protokol için insan embriyonik böbreği, HEK293 hücreleri kullanılmıştır. - Çözülmüş hücreleri en az 10 mL tam orta ile karıştırın, hücre süspansiyonunu 10 cm Petri kabına pipetlayın ve tabaktaki hücreleri eşit şekilde dağıtmak için plakayı döndürün. Yemeği 37 °C, %5 CO2 ve %85-95 nemde bir hücre kültürü inkübatörüne yerleştirin.
- Mikroskop altındaki hücreleri, izdiah seviyesi% 80-90'a ulaşana kadar gözlemleyin. Yüksek izdiahta, ortamı çıkarın, hücreleri ılık fosfat tamponlu salin (PBS) ile yıkayın ve hücreleri yüzeyden ayırmak için% 0.25 tripsin-etilenediamin tetraasetik asit 1 mL ekleyin.
NOT: HEK293 hücreleri oldukça kolay bir şekilde ayrılır. Bu nedenle, yıkama adımı yanlışlıkla kopma ve hücre kaybını önlemek için çok nazikçe yapılmalıdır. - Yaklaşık 5 dakika sonra, mikroskop altındaki hücrelere bakın. Tüm hücreler yüzüyorsa, en az 4 mL orta ekleyin ve hücre süspansiyonu yeni bir steril tüpe aktarın. Hemositometre kullanarak hücreleri sayın ve transfeksiyon için 6 kuyulu bir plakanın her kuyusuna 1 × 106 hücre ekleyin.
NOT: 24 saat sonra hücreler %80 veya daha fazla bir arada olmalıdır.
- Hücre hattını -80 °C veya sıvı azottan çıkar ve 37 °C'lik bir su banyosunda çözün.
- HiBiT-RBD plazmidinin transfeksiyon
- Uygun bir transfeksiyon reaktifi ile HiBiT-RBD ekspresyon plazmidinin 1 μg'sını kullanın. Oda sıcaklığında 10-15 dakika kuluçkaya yatırın ve ardından toplam hacmi plakanın her kuyusuna damla açısından ekleyin.
NOT: Üreticinin transfection protokolünü izleyin. Bu durumda, DMEM'deki seyreltilmiş plazmidin (1 μg) DMEM ile transfeksiyon reaktifinin bir karışımı (belirli bir miktar) eklenmiştir ( bkz. Malzeme Tablosu). Transeksiyon verimliliğini izlemek için kontrol olarak (örneğin, yeşil floresan protein [GFP]) plazmid içeren bir işaretleyici kullanın. - Ertesi gün, transfeksiyon karışımını içeren ortamı tam ortamla değiştirin. Transeksiyondan 48 saat sonra transfeksiyon kontrolünü iyi gözlemleyin.
NOT: Transfeksiyon pozitif ve verimliyse (%80'den fazla GFP pozitif), hücreler HiBiT-RBD biyo-raporlayıcının toplanmasına hazır olmalıdır. Yapı ayrıca, toplam süpernatant yerine saflaştırılmış protein elde etmek için kullanılabilecek His etiketini de içerir. - Süpernatant'ı 1,5 mL mikrotüplerde toplayın. Hücrelere 500 μL 1x pasif lizis tamponu (PLB) ekleyin; hücre lizisi için oda sıcaklığında plakayı 15 dakika kuluçkaya yatırın ve sallayın.
NOT: Süpernatant ve lilat çözeltisi -20 °C'de en az 6 ay boyunca küçük bütünlük kaybı ile korunabilir. Azad ve ark.22'ye göre, muhabir çok çeşitli pH (4-12) ve sıcaklıkta (4-42 °C) stabildir.
- Uygun bir transfeksiyon reaktifi ile HiBiT-RBD ekspresyon plazmidinin 1 μg'sını kullanın. Oda sıcaklığında 10-15 dakika kuluçkaya yatırın ve ardından toplam hacmi plakanın her kuyusuna damla açısından ekleyin.
- Hücre kültürüne hazırlanın
- Biyoreporterden gelen lüminesan sinyalin luciferaz tahlili ile değerlendirilmesi
- Reaksiyon bileşenlerinin hazırlanması
- Süpernatant'ı biyo-raporlayıcının kaynağı olarak kullan.
NOT: Hem süpernatant hem de lisat HiBiT-RBD biyo-raporlayıcı içerir ve test için kullanılabilir. Ancak, aşağıdaki notlarda açıklanan nedenlerden dolayı kaynak olarak süpernatant önerilir. - LgBiT'yi seyreltin ve kullanmadan önce 1x'e kadar substratı seyreltin (stok konsantrasyonu 100x'tir).
NOT: LgBiT hakkında ayrıntılı bilgi için Malzeme Tablosuna bakın.
- Süpernatant'ı biyo-raporlayıcının kaynağı olarak kullan.
- Luciferase tahlil
- Süpernatant'ın 50 μL'sini her bir kuyudan veya tüpten 96 kuyu plakasına aktarın ve her kuyuya 50 μL 1x LgBiT ekleyin. Oda sıcaklığında 5 dakika kuluçkaya yatır.
- Luminometre yazılımını açın, her kuyuya 50 μL 1x substrat (furimazine) ekleyin, plakayı luminometreye yerleştirin ve yazılımı çalıştırın.
NOT: Sinyal ölçümünden önce aktif enzimler tarafından substrat tüketimini önlemek için plakayı okumadan hemen önce substratı ekleyin.
- Reaksiyon bileşenlerinin hazırlanması
2. Anti-RBD antikorlarının hızlı ve hassas bir testle tespiti
- HiBiT-RBD antikor tespit testi
- Protokolün bölüm 1.1'inde açıklandığı gibi HiBiT-RBD biyo-raporlayıcıyı hazırlayın.
NOT : Proteinin olgun glikosilatlı versiyonunu toplamak ve içermesi daha basit olduğu için aşağıdaki test için süpernatantın kullanılması önerilir. Ayrıca, lysate HiBiT-RBD-antikor etkileşimini etkileyebilecek birkaç proteine daha sahiptir. - HiBiT-RBD içeren süpernatant'ın 50 μL'sini 1,5 mL mikrotüpte 1 μg ticari SARS-CoV-2-RBD antikor ile birleştirin. Çözeltiye 20 μL immünoglobulin bağlayıcı protein (protein G) ekleyin. PBS ekleyerek toplam hacmi 300 μL'ye getirin.
NOT: Karışımın toplam hacmi 150 μL'ye düşürülebilir. - Tüpleri bir tüp çalkalayıcı veya rotator üzerinde 30 dakika kuluçkaya yatırın. 30 s için 12.000 × g'da santrifüj, süpernatantı atın ve PBS ile yıkayın. Ücretsiz HiBiT-RBD'yi kaldırmak için işlemi üç kez tekrarlayın. 50 μL PBS'de yeniden dirildi ve 96 kuyu plakasına aktarın.
- 50 μL 1x LgBiT ekleyin ve 5 dakika bekleyin. Ardından, 50 μL 1x NanoLuc substrat ekleyin. Işıklı işaretini hemen bir luminometre ile okuyun.
- Protokolün bölüm 1.1'inde açıklandığı gibi HiBiT-RBD biyo-raporlayıcıyı hazırlayın.
3. Hasta serum örneklerinden SARS-CoV-2 spesifik antikorların yüksek verimli tespiti
- Protokolün bölüm 1.1'ini izleyerek yüksek verimli bir test için daha büyük miktarlarda HiBiT-RBD biyo-raporlayıcı hazırlayın.
- 20 μL manyetik protein G ile 50 μL HiBiT-RBD süpernatantını her numune için 96 kuyu plakasında birleştirin. Her kuyuya 10 μL serum örneği ekleyin ve PBS ekleyerek toplam hacmi 150 μL'ye getirin.
NOT: Adım 2.1.2'de açıklandığı gibi 1 μg/mL konsantrasyonda hem spesifik olmayan IgG (negatif kontrol) hem de nötralize SARS-CoV-2 antikorunu (pozitif kontrol) kullanın. Ayrıca, aşılanmış farelerden alınan serum örnekleri de antikorlar için değerlendirilebilir. Bu testte, Serum örnekleri Ottawa Hastanesi Genel Kampüsü'nden onaylanmış bir prosedürle ve bireylerin bilgilendirilmiş rızası ile alınmıştır. - Oda sıcaklığında bir çalkalayıcıda 30 dakika kuluçkaya yatır. Protein G-antikor kompleksini çökeltmek için plakayı manyetik bir yıkayıcıya yerleştirin.
NOT: Manyetik yıkayıcının özel yapısı, kompleksi her kuyunun yan duvarlarına çökeltecektir. - Çözeltiyi her kuyunun orta bölümüne atın ve yıkama için PBS ekleyin. Fazla HiBiT-RBD'yi çıkarmak için yıkama adımını en az üç kez tekrarlayın. 50 μL 1x PBS ve 50 μL 1x LgBiT ekleyin. Oda sıcaklığında en az 5 dakika kuluçkaya yatır.
- Luminometre yazılımını hazırlayın ve ardından 50 μL 1x substrat ekleyin. Plakayı makineye yerleştirin, yazılımı çalıştırın ve sinyalleri kaydedin. Serum örneklerinden, kontrol örneklerinden ve arka plandan (boş kuyular) gelen sinyalleri karşılaştırın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Uygun protein kaynağını değerlendirmek için hem HiBit-RBD içeren hücre lysate hem de transfected hücrelerin süpernatantından gelen sinyaller kaydedildi (Şekil 2). HiBiT-RBD ve LgBit ayrı ayrı kontrol olarak kullanıldı ve veriler her iki parça birleştirildiğinde güçlü bir sinyale kıyasla düşük arka plan gösterdi. Bu nedenle, Substrat sindirimi ve biyolüminesans aktivitesi için aktif enzim üretmek için LgBiT ile HiBiT-RBD etkileşimi gereklidir (Şekil 1).
G proteininin eklenmesi antikor çökelttirir (Şekil 3). Test, ticari bir SARS-CoV-2 nötralize edici antikorun sinyalini kontrol igg ile karşılaştırmak için kullanıldı. Spesifik antikor sinyali sağlamken, kontrol antikorları parlak arka plan seviyesine yakındı (Şekil 4A). Fareleri aşılamak için eksojen RBD'yi ifade eden M proteininin (Δ51 ) 51 pozisyonunda mutasyona sahip rekombinant zayıflatılmış onkolitik veziküler stomatit virüsü (VSV) kullanıldı. Aşılanmış farelerden toplanan serum, kontrol VSV ile enjekte edilen farelerde sinyal olmamasına kıyasla sağlam bir sinyal üretti (Şekil 4B).
Şekil 1: RBD'ye bağlı HiBiT ile LGBiT etkileşimi. Nanoluseferazın küçük kısmı olan HiBiT'in enzimin büyük alt birim olan LgBiT ile etkileşimi üzerine, aktif enzim kompleksi substrat tüketiminden sonra parlak bir sinyal üretebilir. RBD bu işleme müdahale etmez. Kısaltmalar: RBD = reseptör bağlama etki alanı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Transfected hücrelerin hem lysate hem de üstnatant sağlam muhabir aktivitesi. Protein hem süpernatant hem de lisate bulunur ve güçlü bir sinyal üretir. Kontrol gruplarının parlak sinyalleri arka plana yakındı. Hata çubukları Standart Sapma'ı (SD) temsil eder. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Protein G'ye bağlı antikorlarla HiBiT-RBD etkileşiminin şeması. Şematik, protein G ve HiBiT-RBD ile etkileşime göre antikor çökeltme gösterir. LgBit'in karışıma eklenmesi, antikor RBD'ye özgü olduğunda sağlam bir sinyal üretecektir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: HiBiT-RBD biyo-raporlayıcı, saflaştırılmış nötralize edici antikorlar, aşılanmış fare serumu ve hasta serum örnekleri ile güçlü biyolüminesans üretir. (A) HiBiT-RBD, RBD'ye özgü nötralize edici antikor ile etkileşime girer ve spesifik olmayan IgG için ihmal edilebilir sinyale kıyasla önemli ölçüde yüksek sinyal üretir. (B) Biyoreporter, aşılanmış fare serumunda SARS-CoV-2 antikorlarını tespit edebilir. Kısaltmalar: RBD = reseptör bağlama etki alanı; IgG = immünoglobulin G; Ab = antikor; VSV = veziküler stomatit virüsü; Fluc = ateş böceği luciferase. (C) Hasta serum örneklerinde SARS-CoV-2 antikorlarının tespiti, Azad ve ark.22'den çoğaltıldı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
SARS-CoV-2 ile enfekte olan insan sayısının artması ve küresel aşılama için devam eden çaba, büyük ölçekli serosurveylerde kullanılabilecek hassas ve hızlı serolojik testler gerektirmektedir. Son araştırmalar, bölünmüş nanoluseferaz bazlı biyo-raporlayıcıların bu tür tahlilleri geliştirmek için kullanılabileceğini göstermektedir. Yakın zamanda hasta serumunda SARS-CoV-2'ye özgü antikorları hızlı ve güvenilir bir şekilde tespit etmek için kullanılabilecek bir test tasarlamak için HiBiT-RBD biyoreporterini geliştirdik (Şekil 4C).
Bu tahlilde birkaç kritik adım vardır. Sistemin verimliliği RBD protein ekspresyonuna bağlı olduğundan, protein seviyeleri batı şişkinliği ile doğrulanmalıdır. Ayrıca, RBD'ye karşı ticari bir antikor ve negatif kontrol antikorı gibi pozitif bir kontrol kullanmak gerekir. Nanolüsferaz proteininin eklenmesinin biyolüminesans tespiti için pozitif kontrol olarak kullanılması önerilir. Protein ürünü ayrıca çok sayıda serum örneği için saflaştırma için kullanılabilecek bir His etiketi içerir.
Bu biyo-raporlayıcıyı kullanmanın diğer rakip yöntemlere kıyasla çeşitli avantajları vardır. İlk olarak, deneyimli bir kullanıcı, ELISA gibi mevcut testlerden önemli ölçüde daha hızlı olan tam test prosedürünü bir saatten daha kısa bir sürede gerçekleştirebilir. İkincisi, minimum hazırlık ve test gereksinimleri, bu testi düşük maliyetle büyük ölçekli üretim için son derece değerli hale getirir. Ayrıca, testin algılama sınırı Azad ve ark.22 tarafından tanımlandığı gibi SARS-CoV-2 nötralize edici antikorun 1 ng kadar düşüktür. Bu yaklaşımın bir dezavantajı, farklı antikor izotipleri arasında ayrım yapamamadır. İleriye doğru, testin hassasiyeti rutin olarak kullanılan diğer serolojik testlerle karşılaştırılmalıdır.
Azad ve ark. 22'si testlerin uygulanabilirliğini değerlendirmek için hastalardan serum örnekleri kullanmıştı. Sistemin hastalardan alınan kan örneklerinde antikor tespiti için test edilmesi de şarttır. Bu araç, COVID-19'un şiddeti ile SARS-CoV-2 spesifik antikorların varlığı arasındaki korelasyonun değerlendirilmesinde de çok etkili olabilir. Genel olarak, bu tür serolojik testler SARS-CoV-2'nin epidemiyolojik etkisini tahmin etmede önemli bir etkiye sahip olabilir ve zaman alıcı ve daha az hassas algılama yöntemleri için uygun bir alternatif olabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyanda bulunun.
Acknowledgments
Xiaohong He, Ricardo Marius, Julia Petryk, Bradley Austin ve Christiano Tanese De Souza'nın teknik yardımlarını takdir ve teşekkür ederiz. Mina Ghahremani'ye grafik tasarım için de teşekkür ederiz. Bu çalışma için katılan ve kan örneklerini bağışlayan tüm bireylere de teşekkür ederiz. DWC kısmen uOttawa Fakültesi ve Tıp Bölümü tarafından desteklenmektedir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5x Passive Lysis Buffer | Promega | E194A | 30 mL |
| Bio-Plex Handheld Magnetic Washer | Bio-Rad | 171020100 | |
| DMEM | Sigma | D6429-500ml | |
| Dual-Glo luciferase Assay System | Promega | E2940 | 100 mL kit |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma | F1051 | |
| HiBiT-RBD Plasmid | gacggatcgggagatctcccgatcccctatggt gcactctcagtacaatctgctctgatgccgcata gttaagccagtatctgctccctgcttgtgtgttgg aggtcgctgagtagtgcgcgagcaaaattta agctacaacaaggcaaggcttgaccgacaa ttgcatgaagaatctgcttagggttaggcgttttg cgctgcttcgcgatgtacgggccagatatacgc gttgacattgattattgactagttattaatagt aatcaattacggggtcattagttcatagcccat atatggagttccgcgttacataacttacggtaa atggcccgcctggctgaccgcccaacgaccc ccgcccattgacgtcaataatgacgtatgttccc atagtaacgccaatagggactttccattgacgtc aatgggtggagtatttacggtaaactgcccact tggcagtacatcaagtgtatcatatgccaagta cgccccctattgacgtcaatgacggtaaatgg cccgcctggcattatgcccagtacatgaccttat gggactttcctacttggcagtacatctacgtat tagtcatcgctattaccatggtgatgcggtttt ggcagtacatcaatgggcgtggatagcggtttg actcacggggatttccaagtctccaccccattg acgtcaatgggagtttgttttggcaccaaaatc aacgggactttccaaaatgtcgtaacaactccg ccccattgacgcaaatgggcggtaggcgtgta cggtgggaggtctatataagcagagctctctgg ctaactagagaacccactgcttactggcttatcg aaattaatacgactcactatagggagacccaa gctggctagcgtttaaacttaagcttggtaccga gctcggatccgccaccATGGAGACAGA CACACTCCTGCTATGGGTACTGC TGCTCTGGGTTCCAGGTTCCAC TGGTGACtctggctctagcggctctggctct agcggcggcATGGTGAGCGGCTG GCGGCTGTTCAAGAAGATTAGC tctagcggcGACTACAAGGACC ACGACGGTGACTACAAGGACCA CGACATCGACTACAAGGACGAC GACGACAAGggcagcggctccggca gcagcggaggaggaggctctggaggagga ggctctagcggcggcaacatcacaaatctgtg cccattcggcgaggtgtttaacgccaccagat ttgccagcgtgtatgcctggaaccggaagaga atctctaattgcgtggccgactatagcgtgct gtacaatagcgcctccttctctacctttaagt gctatggcgtgtcccccacaaagctgaacgac ctgtgcttcaccaacgtgtacgccgactcttttgt gatcaggggcgatgaggtgcgccagatcgc acctggacagacaggcaagatcgccgactac aactataagctgccagacgatttcaccggct gcgtgatcgcctggaatagcaacaatctggatt ccaaagtgggcggcaactacaattatctgtac cggctgttcagaaagagcaacctgaagccctt tgagcgggatatcagcacagagatctaccag gcaggctccaccccttgcaacggagtggagg gcttcaattgttattttcccctgcagagctacggc ttccagcctacaaatggcgtgggctatcagcca tacagggtggtggtgctgtcctttgagctgctg cacgcacctgcaaccgtgtcctctggacacatc gagggccgccacatgctggagatgggccatc atcaccatcatcaccaccaccaccactgatag cggccgctcgagtctagagggcccgtttaaac ccgctgatcagcctcgactgtgccttctagtt gccagccatctgttgtttgcccctcccccgtg ccttccttgaccctggaaggtgccactcccac tgtcctttcctaataaaatgaggaaattgcat cgcattgtctgagtaggtgtcattctattctgggg ggtggggtggggcaggacagcaaggggga ggattgggaagacaatagcaggcatgctggg gatgcggtgggctctatggcttctgaggcggaa agaaccagctggggctctagggggtatcccca cgcgccctgtagcggcgcattaagcgcggcg ggtgtggtggttacgcgcagcgtgaccgctac acttgccagcgccctagcgcccgctcctttcg ctttcttcccttcctttctcgccacgttcgccggctt tccccgtcaagctctaaatcgggggctcccttta gggttccgatttagtgctttacggcacctcgacc ccaaaaaacttgattagggtgatggttcacgta gtgggccatcgccctgatagacggtttttcgcc ctttgacgttggagtccacgttctttaatagtg gactcttgttccaaactggaacaacactcaacc ctatctcggtctattcttttgatttataagggatttt gccgatttcggcctattggttaaaaaatgagctg atttaacaaaaatttaacgcgaattaattctgt ggaatgtgtgtcagttagggtgtggaaagtccc caggctccccagcaggcagaagtatgcaaag catgcatctcaattagtcagcaaccaggtgtgg aaagtccccaggctccccagcaggcagaagt atgcaaagcatgcatctcaattagtcagcaac catagtcccgcccctaactccgcccatcccgc ccctaactccgcccagttccgcccattctccgcc ccatggctgactaattttttttatttatgcagaggc cgaggccgcctctgcctctgagctattccagaa gtagtgaggaggcttttttggaggcctaggcttttg caaaaagctcccgggagcttgtatatccattttc ggatctgatcaagagacaggatgaggatcgttt cgcatgattgaacaagatggattgcacgcagg ttctccggccgcttgggtggagaggctattcggc tatgactgggcacaacagacaatcggctgctct gatgccgccgtgttccggctgtcagcgcagggg cgcccggttctttttgtcaagaccgacctgtccgg tgccctgaatgaactgcaggacgaggcagcg cggctatcgtggctggccacgacgggcgttcct tgcgcagctgtgctcgacgttgtcactgaagcg ggaagggactggctgctattgggcgaagtgcc ggggcaggatctcctgtcatctcaccttgctcctg ccgagaaagtatccatcatggctgatgcaatg cggcggctgcatacgcttgatccggctacctgc ccattcgaccaccaagcgaaacatcgcatcg agcgagcacgtactcggatggaagccggtct tgtcgatcaggatgatctggacgaagagcat caggggctcgcgccagccgaactgttcgcca ggctcaaggcgcgcatgcccgacggcgagg atctcgtcgtgacccatggcgatgcctgcttg ccgaatatcatggtggaaaatggccgctttt ctggattcatcgactgtggccggctgggtgt ggcggaccgctatcaggacatagcgttggct acccgtgatattgctgaagagcttggcggcg aatgggctgaccgcttcctcgtgctttacgg tatcgccgctcccgattcgcagcgcatcgcc ttctatcgccttcttgacgagttcttctgagcg ggactctggggttcgaaatgaccgaccaag cgacgcccaacctgccatcacgagatttcgat tccaccgccgccttctatgaaaggttgggctt cggaatcgttttccgggacgccggctggatga tcctccagcgcggggatctcatgctggagt tcttcgcccaccccaacttgtttattgcagctta taatggttacaaataaagcaatagcatcacaa atttcacaaataaagcatttttttcactgcatt ctagttgtggtttgtccaaactcatcaatgtat cttatcatgtctgtataccgtcgacctctagct agagcttggcgtaatcatggtcatagctgtttc ctgtgtgaaattgttatccgctcacaattccacac aacatacgagccggaagcataaagtgtaaag cctggggtgcctaatgagtgagctaactcacat taattgcgttgcgctcactgcccgctttccagtc gggaaacctgtcgtgccagctgcattaatgaa tcggccaacgcgcggggagaggcggtttgcg tattgggcgctcttccgcttcctcgctcactgactc gctgcgctcggtcgttcggctgcggcgagcggt atcagctcactcaaaggcggtaatacggttatc cacagaatcaggggataacgcaggaaagaa catgtgagcaaaaggccagcaaaaggccag gaaccgtaaaaaggccgcgttgctggcgtttt tccataggctccgcccccctgacgagcatcac aaaaatcgacgctcaagtcagaggtggcgaa acccgacaggactataaagataccaggcgtt tccccctggaagctccctcgtgcgctctcctgtt ccgaccctgccgcttaccggatacctgtccgcc tttctcccttcgggaagcgtggcgctttctcat agctcacgctgtaggtatctcagttcggtgtag gtcgttcgctccaagctgggctgtgtgcacgaa ccccccgttcagcccgaccgctgcgccttatcc ggtaactatcgtcttgagtccaacccggtaag acacgacttatcgccactggcagcagccactg gtaacaggattagcagagcgaggtatgtaggc ggtgctacagagttcttgaagtggtggcctaact acggctacactagaagaacagtatttggtatc tgcgctctgctgaagccagttaccttcggaaa aagagttggtagctcttgatccggcaaacaaa ccaccgctggtagcggtggtttttttgtttgca agcagcagattacgcgcagaaaaaaaggat ctcaagaagatcctttgatcttttctacggggt ctgacgctcagtggaacgaaaactcacgttaa gggattttggtcatgagattatcaaaaaggatct tcacctagatccttttaaattaaaaatgaagtt ttaaatcaatctaaagtatatatgagtaaactt ggtctgacagttaccaatgcttaatcagtgagg cacctatctcagcgatctgtctatttcgttcatcca tagttgcctgactccccgtcgtgtagataactac gatacgggagggcttaccatctggccccagtg ctgcaatgataccgcgagacccacgctcacc ggctccagatttatcagcaataaaccagccag ccggaagggccgagcgcagaagtggtcctg caactttatccgcctccatccagtctattaattgtt gccgggaagctagagtaagtagttcgccagtt aatagtttgcgcaacgttgttgccattgctacag gcatcgtggtgtcacgctcgtcgtttggtatgg cttcattcagctccggttcccaacgatcaaggc gagttacatgatcccccatgttgtgcaaaaaag cggttagctccttcggtcctccgatcgttgtca gaagtaagttggccgcagtgttatcactcatggt tatggcagcactgcataattctcttactgtcatg ccatccgtaagatgcttttctgtgactggtgagta ctcaaccaagtcattctgagaatagtgtatgcg gcgaccgagttgctcttgcccggcgtcaatacg ggataataccgcgccacatagcagaactttaa aagtgctcatcattggaaaacgttcttcggggc gaaaactctcaaggatcttaccgctgttgagat ccagttcgatgtaacccactcgtgcacccaact gatcttcagcatcttttactttcaccagcgtttc tgggtgagcaaaaacaggaaggcaaaatgc cgcaaaaaagggaataagggcgacacgga aatgttgaatactcatactcttcctttttcaat attattgaagcatttatcagggttattgtc tcatgagcggatacatatttgaatgtattt agaaaaataaacaaataggggttccgcgca catttccccgaaaagtgccacctgacgtc | ||
| LgBiT | Promega | N3030 | |
| penicillin Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Pierce Protein G Magnetic Beads | Thermo Fisher Scientific | 88848 | |
| PolyJet In Vitro DNA Transfection Reagent | Signagen | SL100688.5 | |
| SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Spike Neutralizing Antibody, Mouse Mab | SinoBiological | 40592-MM57 | |
| Synergy Mx Microplate Reader | BioTek | 96-well plate reader luminometer | |
| Trypsin-EDTA | Thermo Fisher Scientific | 2520056 | 0.25% |
References
- Ullah, H., Ullah, A., Gul, A., Mousavi, T., Khan, M. W. Novel coronavirus 2019 (COVID-19) pandemic outbreak: A comprehensive review of the current literature. Vacunas. , (2020).
- Coronavirus update (Live). Worldometer. , Available from: https://www.worldometers.info/coronavirus/ (2021).
- Cacciapaglia, G., Cot, C., Sannino, F. Second wave COVID-19 pandemics in Europe: a temporal playbook. Scientific Reports. 10 (1), 15514 (2020).
- World Health Organization. COVID-19 vaccines. World Health Organization. , Available from: https://www.who.int/emergencies/diseases/novel-coronavirus-2019/covid-19-vaccines (2021).
- Hueston, L., et al. The antibody response to SARS-CoV-2 infection. Open Forum Infectious Diseases. 7 (9), (2020).
- Lan, J., et al. Structure of the SARS-CoV-2 spike receptor-binding domain bound to the ACE2 receptor. Nature. 581 (7807), 215-220 (2020).
- Azad, T., et al. Implications for SARS-CoV-2 vaccine design: fusion of Spike glycoprotein transmembrane domain to receptor-binding domain induces trimerization. Membranes. 10 (9), 215 (2020).
- Piccoli, L., et al. Mapping neutralizing and immunodominant sites on the SARS-CoV-2 Spike receptor-binding domain by structure-guided high-resolution serology. Cell. 183 (4), 1024-1042 (2020).
- Premkumar, L., et al. The receptor-binding domain of the viral spike protein is an immunodominant and highly specific target of antibodies in SARS-CoV-2 patients. Science Immunology. 5 (48), (2020).
- Walls, A. C., et al. Elicitation of potent neutralizing antibody responses by designed protein nanoparticle vaccines for SARS-CoV-2. Cell. 183 (5), 1367-1382 (2020).
- Azad, T. Nanoluciferase complementation-based biosensor reveals the importance of N- linked glycosylation of SARS-CoV-2 Spike for viral entry. Mol Ther. , 0074-0075 (2021).
- Bastos, M. L., et al. Diagnostic accuracy of serological tests for covid-19: systematic review and meta-analysis. BMJ. 370, 2516 (2020).
- Bioluminescent Reporters | Reporter Gene Applications | An Introduction to Reporter Genes. Promega. , Available from: https://www.promega.ca/resources/guides/cell-biology/bioluminescent-reporters/#references-6d127eb8-eeae-40b7-86e9-fe300545e8fa (2021).
- Fleiss, A., Sarkisyan, K. S. A brief review of bioluminescent systems. Current Genetics. 65 (4), 877-882 (2019).
- Nouri, K., et al. A kinome-wide screen using a NanoLuc LATS luminescent biosensor identifies ALK as a novel regulator of the Hippo pathway in tumorigenesis and immune evasion. The FASEB Journal. 33 (11), 12487-12499 (2019).
- Boute, N., et al. NanoLuc Luciferase - a multifunctional tool for high throughput antibody screening. Frontiers in Pharmacology. 7, 27 (2016).
- Nouri, K., et al. Identification of celastrol as a novel YAP-TEAD inhibitor for cancer therapy by high throughput screening with ultrasensitive YAP/TAZ-TEAD biosensors. Cancers. 11 (10), 1596 (2019).
- Azad, T., et al. SARS-CoV-2 S1 NanoBiT: A nanoluciferase complementation-based biosensor to rapidly probe SARS-CoV-2 receptor recognition. Biosensors and Bioelectronics. 180, 113122 (2021).
- Brown, E. E. F., et al. Characterization of critical determinants of ACE2-SARS CoV-2 RBD interaction. International Journal of Molecular Sciences. 22 (5), 2268 (2021).
- Azad, T., et al. A gain-of-functional screen identifies the Hippo pathway as a central mediator of receptor tyrosine kinases during tumorigenesis. Oncogene. 39 (2), 334-355 (2020).
- Schwinn, M. K., et al. CRISPR-Mediated tagging of endogenous proteins with a luminescent peptide. ACS Chemical Biology. 13 (2), 467-474 (2018).
- Azad, T., et al. A high-throughput NanoBiT-based serological assay detects SARS-CoV-2 seroconversion. Nanomaterials. 11 (3), 807 (2021).
