Escape Response Assay: En metode for å studere responsen til sebrafisk larve å berøre stimuli

Overview

Denne videoen beskriver den berørings-fremkallende responsanalysen, som måler responsen til sebrafisklarven for å berøre stimuli.

Protocol

1. Berørings-fremkalt Respons Analyse

1. Tilberedning av 2 dpf embryoer for touch-evoked responsanalyse
   1. Forsikre deg om at tidspunktet på dagen testen utføres er konsistent mellom eksperimenter fordi aktiviteten kan variere dramatisk gjennom dagen.
      MERK:Eksperimentet bør utføres blindet og rekkefølgen av testing randomisert for å minimere eksperimentelle artefakter.
   2. Tilordne fisken stammer et tall, som er ukjent for den enkelte som utfører eksperimentet. Etter dette genererer bruk av fritt tilgjengelige online verktøy en tilfeldig liste som dikterer testrekkefølgen.
   3. Minst en time før testing, dechorionate embryoer ved å rive et hull i koret og forsiktig trekke chorion fra hverandre ved hjelp av et par fine pinsett. Fjern eventuelt rusk fra petriskålen før du går tilbake til inkubatoren på 28 °C.
2. Utføre berørings-fremkalt responsanalyse
   1. Varmetrinn til 28 °C minst 15 min før testingen påbegynnes.
      MERK:Dette stadiet er temperaturkontrollert og vil forbli ved 28 °C så lenge testingen varer. Temperaturen vil påvirke aktiviteten, og det er derfor viktig å opprettholde en konstant temperatur. Hvis et oppvarmet stadium ikke er tilgjengelig, bør temperaturen på vannet overvåkes og alle eksperimenter skal utføres ved samme temperatur.
   2. Plasser en petriskål fylt med embryomedium (5 mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0,33 mM CaCl_2,0,33 mM MgSO₄ i vann) på et opplyst stadium og monter høyhastighetskameraet over petriskålen.
   3. Start videoopptaksprogramvaren (for eksempel Stream Pix 5, beskrevet her) og under "arbeidsområde" -fanen velger du 1000 bilder per sekund (1000 fps) som fangsthastighet for å sikre at rask svømmehandling av fisken registreres.
   4. Arbeid med ett embryo om gangen, plasser embryoet midt i petriskålen med sebrafisken tydelig synlig innen synsfeltet.
      MERK:Hvis embryoet svømmer bort før eksperimentet begynner, erstatt det med et annet, da recapturing og posisjonering av embryoet kan føre til at det blir desensibilisert til stimulansen og gjentatte bristeresponser kan fremme muskelsvakhet i noen sykdomsmodeller.
   5. Begynn innspillingen ved å klikke på "record" -knappen, og lever den mekanosensoriske stimulansen til embryoet ved å berøre den forsiktig med en stump nål på toppen av hodet.
   6. Stopp opptaket etter at embryoet har svømt ut av synsfeltet eller returnert til hvile.
      MERK:Akselerasjonen topper seg i løpet av de første 0,2 sekundene av rømningsresponsen etter den mekaniske stimulansen. Derfor må du sørge for at fisken i det minste i løpet av de første 0,2 sekundene av rømningsresponsen er innen synsfeltet. Ved hjelp av programvaren Stream Pix 5 blir dataene automatisk lagret som en .avi videofil. Alternativ videoopptaksprogramvare som Free Video Capture eller Softonic, som begge er fritt tilgjengelige for nedlasting, kan også brukes.
   7. Returner embryoet til en ny petriskål og velg et annet embryo for testing. Utfør testing på minst 15 fisk.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
90 mm Petri Dishes	Pacific Laboratory Products	PT S90001
Tweezers, style 8	ProSciTech	T04-821
Incubator	Thermoline Scientific	TEI-43L
High Speed Camera	Baumer	HXC20
StreamPix5	NorPix		Step 1.2.3
Temperature Control Unit	Viewpoint
http://www.randomization.com	N/A		Steps 1.1.2