Summary
Transporte mitocondrial prejudicado e morfologia estão envolvidos em várias doenças neurodegenerativas. O protocolo apresentado usa neurônios cerebrais derivados de células-tronco pluripotentes induzidas para avaliar o transporte mitocondrial e a morfologia em paraplegia espástica hereditária. Este protocolo permite a caracterização do tráfico mitocondrial ao longo de axônios e análise de sua morfologia, o que facilitará o estudo de doenças neurodegenerativas.
Abstract
Os neurônios têm intensas demandas por alta energia para apoiar suas funções. O transporte mitocondrial prejudicado ao longo de axônons tem sido observado em neurônios humanos, o que pode contribuir para a neurodegeneração em vários estados da doença. Embora seja desafiador examinar a dinâmica mitocondrial nos nervos humanos vivos, tais paradigmas são fundamentais para estudar o papel das mitocôndrias na neurodegeneração. Descrito aqui está um protocolo para analisar o transporte mitocondrial e a morfologia mitocondrial em axônios de neurônios cerebrais provém derivados de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos (iPSCs). Os iPSCs são diferenciados em neurônios glutamatergicos telencefálicos usando métodos bem estabelecidos. Mitocôndrias dos neurônios estão manchadas com MitoTracker CMXRos, e o movimento mitocondrial dentro dos axônons os axônolos são capturados usando um microscópio de imagem de células ao vivo equipado com uma incubadora para a cultura celular. Imagens de lapso de tempo são analisadas usando software com plugins "MultiKymograph", "Bioformat importer" e "Macros". Kymographs do transporte mitocondrial são gerados, e velocidade mitocondrial média nas direções anteroras e retrógradas é lida a partir do kymograph. Em relação à análise mitocondrial de morfologia, o comprimento mitocondrial, a área e a proporção são obtidos usando o ImageJ. Em resumo, este protocolo permite a caracterização do tráfico mitocondrial ao longo de axônios e análise de sua morfologia para facilitar estudos de doenças neurodegenerativas.
Introduction
A motilidade mitocondrial e a distribuição desempenham um papel vital no cumprimento de demandas energéticas variáveis e especializadas em neurônios polarizados. Os neurônios podem estender axônhons extremamente longos para se conectar com metas através da formação de sinapses, que exigem altos níveis de energia para correntes ca2+ e íons. O transporte de mitocôndrias de soma para axônomon é fundamental para suportar a função axonal e sináptica dos neurônios. O movimento mitocondrial espacial e temporalmente dinâmico é conduzido pelo transporte axonal rápido a taxas de vários micrômetros por segundo1.
Especificamente, proteínas motoras ou adaptantes, como cinesesina e dynein, participam do transporte rápido de organela ao longo de microtúbulos para controlar o movimento das mitocôndrias2,3. A atividade neuronal normal requer transporte adequado de mitocôndrias recém-montadas da soma neuronal ao axôlo distal (transporte axonal anterogrado) e transporte reverso de mitocôndrias do axôlo distal de volta ao corpo celular (transporte retrógrado). Estudos recentes indicaram que a alocação mitocondrial inadequada está fortemente associada a defeitos neuronais e doenças degenerativas do neurônio motor4,5. Portanto, para dissecar o papel das mitocôndrias na neurodegeneração, é importante estabelecer métodos para examinar o movimento mitocondrial ao longo de axôlos nas culturas vivas.
Existem dois desafios principais na análise e análise do rastreamento das mitocôndrias: (1) identificar mitocôndrias do fundo em cada quadro, e (2) analisar e gerar as conexões entre cada quadro. Na resolução do primeiro desafio, uma abordagem de rotulagem de fluorescência é amplamente utilizada para distinguir mitocôndrias do fundo, como o tinante MitoTracker ou transfecção de proteína mitocondrial com fluorescência (por exemplo, mito-GFP)6,7,8. Para analisar a associação entre quadros, vários algoritmos e ferramentas de software foram descritos em estudos anteriores9. Em um artigo recente, os pesquisadores compararam quatro ferramentas automatizadas diferentes (por exemplo, Volocity, Imaris, wrMTrck e Difference Tracker) para quantificar o transporte mitocondrial. Os resultados mostraram que, apesar das discrepâncias no comprimento da pista, do deslocamento mitocondrial, da duração do movimento e da velocidade, essas ferramentas automatizadas são adequadas para avaliar a diferença de transporte após o tratamento10. Além dessas ferramentas, um plugin integrado "Macros" para ImageJ (escrito por Rietdorf e Seitz) tem sido amplamente utilizado para analisar o transporte mitocondrial11. Este método gera kymogramas que podem ser usados para analisar o movimento mitocondrial, incluindo velocidade em direções anteroras e retrógradas.
Mitocôndrias são organelas altamente dinâmicas que mudam constantemente de número e morfologia em resposta a condições fisiológicas e patológicas. Fissão mitocondrial e fusão regulam firmemente a morfologia mitocondrial e a homeostase. O desequilíbrio entre fissão mitocondrial e fusão pode induzir redes mitocondriais extremamente curtas ou longas, que podem prejudicar a função mitocondrial e resultar em atividades neuronais anormais e neurodegeneração. Transporte mitocondrial prejudicado e morfologia estão envolvidos em várias doenças neurodegenerativas, como doença de Alzheimer, doença de Parkinson, doença de Huntington e paraplegia espástica hereditária (HSP)12,13,14,15. HSP é um grupo heterogêneo de distúrbios neurológicos herdados caracterizados pela degeneração do trato corticorrâmdia e subsequente falha no controle dos músculos dos membros inferiores16,17. Neste estudo, neurônios cerebrais derivados do IPSC são usados para avaliar transporte mitocondrial e morfologia em HSP. Este método fornece um paradigma único para examinar a dinâmica mitocondrial de axônsão neuronal em culturas vivas.
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Protocol
1. Geração de neurônios glutamatergicos telencefálicos de iPSCs
NOTA: O protocolo detalhado para a manutenção dos iPSCs e sua diferenciação em neurônios glutalicos telencefálicos são semelhantes aos descritos anteriormente18. Aqui, o processo crítico durante a diferenciação de células-tronco pluripotentes humanas é introduzido e destacado.
- IPSCs culturais em alimentadores de fibroblasto embrionário de camundongos (MEF) em meio de células-tronco embrionárias humanas (hESC) suplementadas com fator de crescimento do fibroblasto (bFGF, 4 ng/mL).
- Após a incubação com dispase (1 mg/mL) por 3 min, dissociam os iPSCs em pequenos aglomerados. Em seguida, a cultura do IPSC agrega em suspensão no meio do HESC por 4 dias. Consulte este ponto de tempo, quando as iPSCs começam como a cultura de suspensão, como dia 1 (D1). Troque o meio-dia por 4 dias.
- Na D5, colete os agregados do IPSC após centrífuga em 200 x g por 2 min e cultura em mídia de indução neural (NIM) por 3 dias. Cultura a célula agrega em suspensão por 3 dias mudando metade da mídia a cada 2 dias. Adicione DMH-1 (2 μM) e SB431542 (2 μM) ao meio NIM para aumentar a eficiência da indução neural.
- Na D8, colete os agregados do iPSC após centrífuga em 200 x g por 2 min e deixe-os aderir a 6 placas de poço (cerca de 20-30 agregados por poço da placa) culturing em NIM com 10% FBS (ou com placas revestidas de laminin) durante a noite. No dia seguinte, remova o velho meio e mude para NIM a cada 2 dias até d17.
NOTA: Observa-se neste período a geração de células neuroepiteliais, indicadas pela formação de células colunas com estruturas de roseta. - Na D17, isolar mecanicamente as células neuroepiteliais no centro das colônias (decolando diretamente aplicando uma pequena pressão ao centro das colônias) ou enzimáticamente (tratadas com dispase). Transfira as células neuroepiteliais isoladas para o frasco t25 de cultura tecidual não tratada contendo 8 mL de NIM com adição de B27 (1x), cAMP (1 μM) e IGF (10 ng/mL).
NOTA: A cultura de suspensão permite que as células formem neuroesferas enriquecidas com progenitores neurais de projeção cortical. - Após o D35, coloque as neuroferas na poli-ornithine e sem LDEV fator de crescimento reduzido matriz de membrana de porão(Tabela de Materiais) revestido de 35 mm pratos inferiores de vidro de 35 mm para gerar neurônios glutamatergicos telencefalilicos (neurônios de projeção cortical). Antes de chapeamento, dissociar as neuroesferas a pequenos aglomerados incubando com 1 mg/mL solução de desprendimento celular por 2 min a 37 °C.
- Remova a solução de desprendimento celular por centrífuga e resuspenda em 1 mL de meio de diferenciação neural (NDM). As células da placa no prato inferior do vidro (cerca de cinco clusters em 100 μL de média por prato) para deixá-las anexá-las. Em seguida, adicione NDM (1 mL por prato) e cultura as células em NDM contendo B27 (1x), cAMP (1 μM), IGF (10 ng/mL), hBDNF (10 ng/mL) e GDNF (10 ng/mL).
NOTA: Pequenos aglomerados são banhados porque sobrevivem bem e dão origem a neurônios de projeção longas. Alternativamente, as células podem ser dissociadas e banhadas a uma densidade em torno de 20.000 células por prato para melhor separação. - Caracterize os neurônios glutamatergicos telencefálicos, imunostainando os marcadores Tbr1 e βIII-tubulina.
2. Exame do transporte mitocondrial ao longo de axôngulas de neurônios glutalicostel
- Aqueça o NDM e ligue a incubadora para o microscópio de fluorescência fixado a 37 °C e 5% de CO2.
- Para visualizar mitocôndrias ao longo dos axônios de neurônios cérebros, incubar os neurônios com corante fluorescente vermelho de 50 nM para manchar mitocôndrias em células vivas (por exemplo, MitoTracker CMXRos) em NDM por 3 min a 37 °C. Em seguida, lave células 2x com NDM aquecido. Os neurônios são incubados no NDM.
- A fim de registrar o transporte mitocondrial ao longo dos axônses, tire imagens de lapso de tempo do movimento mitocondrial usando o objetivo de 40x com um microscópio de fluorescência.
NOTA: Para estabilizar a cultura, realize a imagem de células vivas quando as células forem incubadas na incubadora por 20 min após a coloração mitocondrial. - Em campo de fase, identifique os axôons com base em características morfológicas (emergem diretamente do corpo celular neuronal, neuritas longas constantes constantes constantes sem ramificação). Mitocôndrias se movem em anterogrados (do corpo celular ao axôlo distal) e direções retrógradas (do terminal axonal ao corpo celular). Para distinguir a direção do movimento mitocondrial ao longo dos axôngos, identifique claramente os corpos celulares dos neurônios. Nesta etapa, concentre-se axons em campo de fase para reduzir o fotobranqueamento.
- Depois de distinguir o corpo celular e o axôlo, ajuste o tempo de exposição e o foco das mitocôndrias em axôngos. Em seguida, capture o transporte de mitocôndrias dentro de axônons a cada 5 s por uma duração total de 5 minutos, rendendo 60 quadros. Capturar aleatoriamente pelo menos cinco locais para cada prato e repetir 3x para cada grupo.
3. Análise de dados do transporte mitocondrial e morfologia em neurônios corticais
NOTA: Analise os dados coletados sobre o transporte mitocondrial usando um software de análise de imagem (por exemplo, ImageJ ou MetMorph19). Como o ImageJ está prontamente disponível, realize a análise do transporte mitocondrial e da morfologia usando ImageJ com o MultiKymograph, Macrose Analisar plugins de partículas.
- Analisando o transporte mitocondrial usando ImageJ
- Depois de capturar as imagens de lapso de tempo da motilidade mitocondrial, analise a velocidade e o movimento das mitocôndrias usando o plugin MultiKymograph. As imagens são salvas como arquivos de formato .tiff, que são analisados pelo software Fiji seguindo um método relatado anteriormente20.
- Baixe o software Fiji. Baixe plugins que serão necessários para analisar a velocidade de movimento mitocondrial a partir de kymographs. Baixe o Pacote de Bioformatos e o Plugin Kymograph junto com estes quatro plugins de classe ., incluindo: MultipleKymograph.class, MultipleOverlay.class, StackDifference.class e WalkingAverage.class (Tabela de Materiais). Mova esses arquivos para a pasta de plugins Fiji. Baixe plugins "tsp050706.txt" para a pasta plugins. Reinicie o software Fiji quando os arquivos forem movidos para a pasta plugins.
- Abra o software Fiji. Escolha pluginse, em seguida, importe imagens da série .tiff através do Importador de Bioformatos em Bioformatos. Certifique-se de escolher o Standard ImageJ na visualização stack,escolha Abrir todas as séries,verificar a escala automática,e clique em OK. Anote o número do quadro e o tamanho das imagens em pixels, que são exibidos na parte superior da imagem.
NOTA: Pegue 60 quadros por imagem. - Considere tornar as imagens mais claras ajustando brilho/contraste o menu Image para todos os 60 quadros.
- Clique com o botão direito de escolher a linha segmentada e desenhar uma linha segmentada a partir do corpo celular e terminando no axôlo terminal. Gere o kymograph escolhendo multiplekymograph plugins. A seleção da largura da linha é solicitada após a escolha do MultipleKymograph. Certifique-se de que este é um número estranho. Escolha 1 para a largura da linha. Um kymograph é gerado após esta etapa.
NOTA: Várias informações importantes podem ser lidas a partir do kymograph. O eixo Y do kymograph é o tempo de duração (5 min) para os 60 quadros. O eixo X representa a posição dos axônses selecionados. - Use uma linha diagonal no kymograph para determinar a direção de movimento das mitocôndrias (anterogrados, retrógradas ou estáveis). Por exemplo, uma linha descendo para a direita ao longo do eixo Y indica movimento anterogrado, e uma linha descendo para a esquerda ao longo do eixo Y indica movimento retrógrado. Uma linha vertical indica que não houve movimento na mitocôndria.
- Meça a distância, os valores de tempo e a velocidade para as mitocôndrias em movimento usando o plugin Macros no software Fiji. Vá para Plugins | Macros | Instalação | tsp050607.txt. Desenhe uma linha segmentada sobre o traço do movimento mitocondrial no kymograph, e sempre desenhe a linha da região superior para inferior (eixo y).
- Depois de desenhar a linha, vá para Plugins | Macros | ler velocidades de tsp. Uma vez que uma linha segmentada ao longo do traço é traçada, o plugin lê velocidades segmentadas correspondentes à linha.
NOTA: A unidade para todos os dados são pixels. soma dy é o tempo consumido a partir do ponto de partida, e a soma dx indica a distância da mitocôndria movendo-se no eixo x. dy agora e dx agora mostra o tempo de período e distância de movimento para cada segmento, respectivamente. velocidade real mostra a velocidade para cada segmento (dx agora/dy agora). velocidade média indica a velocidade média para o movimento mitocondrial (soma dx/soma dy). - Altere a unidade do dx agora de pixel para μm como a razão de pixel em μm medindo a barra de escala. Converta a unidade para distância de pixel para μm medindo barras de escala em imagens. Use a ferramenta de linha para desenhar uma linha ao longo da barra de escala e medir o comprimento da linha, opte por Medir" em "Analisar. Mude o tempo de pixel para segundos, como 1 pixel = 5 segundos neste experimento.
- No arquivo de planilha, calcule a velocidade média e rotule correspondentemente o movimento retrógrado ou anterogrado. Média da velocidade de movimento anterogrado ou retrógrada.
- Determine a porcentagem de mitocôndrias estacionárias e motiladas do kymograph. As mitocôndrias móveis anterores ou retrógradas são definidas como movendo 5 μm para frente ou para trás da origem durante todo o período21. Mitocôndrias são consideradas estacionárias se não se moverem mais de 5 μm durante os 5 min.
- Análise da morfologia mitocondrial usando ImageJ
NOTA: Determine a morfologia mitocondrial medindo o comprimento, área e a proporção usando imageJ. Para isso, siga os passos abaixo.- Para analisar o comprimento e a área mitocondriais dentro dos axônhons, baixe o plugin Straighten_.jar do site ImageJ (ver Tabela de Materiais)e mova-o para a pasta de plugins. Reiniciar o software ImageJ.
- Abra a imagem através da função aberta em Arquivo e converta a imagem de 32 bits em 8 bits usando Type under Image.
- Desenhe uma linha segmentada ao longo dos axônhons. Escolha endireitar plugins e definir 50 pixels para largura de filamento/linha wide. Isso vai gerar um axôlo endireito.
- Ajuste o limiar imagem e defina a medida em Analisar escolhendoÁrea | Perímetro | Fit elipse | Descritores de forma.
- Meça a barra de escala usando a função da linha e defina a escala em Analisar preenchendo a distância em pixel, saiba distânciae a unidade de comprimento. Em seguida, escolha a Global para definir essa configuração de escala.
- Use analisar partículas em Análise para determinar a área. Os parâmetros imediatos são tamanho (pixel^2) = 0,20-infinito, circularidade = 0,00-1,00, e mostram = elipses. Escolha os resultados do Display.
NOTA: A medição produzirá os resultados de múltiplos parâmetros de morfologia mitocondrial, incluindo área, perímetros, comprimento (maior), largura (menor) e proporção (AR). O número mitocondrial correspondente também está listado. - Calcule o número mitocondrial por axôlo (μm) usando o número mitocondrial dividido pelo comprimento axonal.
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Representative Results
Aqui, os iPSCs humanos foram diferenciados em neurônios glutamatergicos telencefálicos, caracterizados por imunomanchas com marcadores tbr1 e βIII de tubulina(Figura 1A). Para examinar o transporte axonal de mitocôndrias, essas células foram manchadas com corante fluorescente vermelho, e a imagem de lapso de tempo foi realizada. Como o ImageJ está prontamente disponível e mais fácil de obter, o transporte mitocondrial foi ainda mais analisado com os plugins ImageJ "MultiKymograph" e "Macros", mostrados na Figura 1.
Existem três respectivos estados de movimento mitocondrial, incluindo movimento estático, anterogrado e retrógrado (Figura 1B,C). Uma única mitocôndria pode permanecer estática ou mover-se em direção anterograda ou retrógrada dentro de um axôlo, e aqui, uma linha segmentada foi traçada ao longo da trilha do movimento mitocondrial para determinar a velocidade(Figura 1D). A velocidade do movimento mitocondrial ao longo do axôlo é mostrada na Figura 1E e corresponde às linhas segmentadas na Figura 1D após a leitura de "Macros" no ImageJ. Semelhante ao software Metamorfo, o ImageJ pode ser usado para determinar a velocidade mitocondrial e a porcentagem de mitocôndrias motileais baseadas no kymograph gerado pela ImageJ(Figura 1F). Usando software de análise comercialmente disponível (por exemplo, MetMorph), dados anteriores mostraram que a porcentagem de mitocôndrias motile foi significativamente reduzida nos neurônios SPG3A em comparação com os neurônios normais, enquanto a velocidade não foi alteradaem 19. Para avaliar o software ImageJ, foi examinada a porcentagem de mitocôndrias motile , e uma redução semelhante no percentual de mitocôndrias motile em neurônios SPG3A em comparação com o controle de neurônios do tipo selvagem (WT)(Figura 1G).
Quanto à análise da morfologia mitocondrial, a área mitocondrial, o comprimento e o AR foram analisados usando a função "analisar partículas" no ImageJ. Os axôndeitos foram endireitados usando o plugin "endireitado"(Figura 2A,B). Mitocôndrias foram escolhidas claramente ajustando o limiar (Figura 2C,D). Finalmente, a área mitocondrial, comprimento (maior), largura (menor), proporção e perímetro foram obtidos a partir do axôlo endireito usando o plugin "Analisar Partículas"(Figura 2E,F). A morfologia mitocondrial anormal foi (e já foi) observada em neurônios glutalicos telencefalicoderivados derivados do HSP iPSC, incluindo células SPG15 (Figura 2G,H,I)13,22. Tanto o comprimento mitocondrial quanto a proporção foram significativamente reduzidos em axôndeiros de neurônios SPG15 em comparação com os axôlos de neurônios WT(Figura 2G,H,I).
Figura 1: Análise do transporte mitocondrial usando ImageJ. (A)Imunocoloração mostrando a geração de neurônios glutalicostel. Tbr1 (vermelho), βIII tubulina (verde) e Hoechst (azul). Barras de escala = 50 μm. Esse número foi modificado de um estudo anterior19. (B)Transporte mitocondrial dentro de axônticos de neurônios. O movimento mitocondrial anterorérico é definido como as mitocôndrias movendo-se do corpo celular para axôlo distal, e o movimento mitocondrial retrógrado origina-se do axôlo distal e estende-se ao corpo celular neuronal. A linha do segmento é desenhada ao longo de axônticos do corpo celular neuronal ao terminal axonal distal, a fim de gerar kymographs. (C) O kymograph é gerado usando ImageJ; eixo x é a posição axonal e eixo y é tempo. Uma linha branca contínua é a mitocôndria movendo-se em direção anterograda (ponta de flecha rosa), direção retrógrada (seta azul) ou estado estático (cabeça de flecha amarela). (D)A linha segmentada é traçada para ler a velocidade usando o plugin Macros. Os números 1-8 descrevem o segmento da linha. O movimento anterogrado (1-4, 6, 8) e o estado estático (5, 7) podem ser distinguidos deste kymograph ampliado. (E)Tempo e distância móvel para cada segmento, velocidade real e média (em pixels). (F)Kymograph do transporte mitocondrial para PNs cortical WT e SPG3A usando ImageJ. Barra de escala = 10 μm. (G) Relação mitocondrial motile em WT e SPG3A PNs cortical usando ImageJ (*p < 0,05). Clique aqui para ver uma versão maior deste valor.
Figura 2: Analisando morfologia mitocondrial usando ImageJ. (A)Parâmetros para endireitar o axôlo. (B)O representante endireitou o axon. (C,D) Ajuste de limiar para escolher mitocôndrias. (E,F) A área mitocondrial medida, perímetro, comprimento (maior), largura (menor) e proporção (AR) correspondente às mitocôndrias selecionadas (E). (G) Imagens representativas de mitocôndrias em wt e sPG15 neurônios glutalicogicos. Barras de escala = 20 μm.(H) comprimento mitocondrial em neurônios WT e SPG15. (I) Proporção das mitocôndrias nos neurônios WT e SPG15. **p < 0,01 vs. WT. (G), (H) e (I) são modificados de um estudo anterior13. Clique aqui para ver uma versão maior deste valor.
| Ferramentas fluorescentes | Vantagens | Desvantagens | Referências |
| MitoTracker | MitoTracker é mitocondrial potencial-independente e pode ser usado para analisar a colocalização das mitocôndrias com autofôfago ou lisosome. | MitoTracker não é fotosquetable o suficiente para pesquisa de longo prazo. | 35 |
| NPA-TPP | Este tinante é um novo reagente de rotulagem mitocondrial fotoscável. | O processo de síntese e purificação deste tinante é demorado e caro. | 23 |
| MitoBADY | Este tintura pode ser usado para visualização mitocondrial usando microscopia raman com alta sensibilidade e especificidade. | Usar este dine requer microscópio Raman. | 25 |
| TMRE | Este tintura é um tintura mitocondrial não tóxico e específico com baixa concentração e sem efeito saciador. | A rotulagem tMRE das mitocôndrias depende do potencial da membrana mitocondrial. | 36, 37 |
| Proteínas fluorescentes direcionadas à mitocôndria | As proteínas fluorescentes voltadas para mitocôndrias são mais específicas e estáveis. | Este método precisa de transfecção e eficiência de transfecção é diferente para diferentes tipos de células. | 38, 39 |
Tabela 1: Vantagens e desvantagens de algumas ferramentas fluorescentes para rotulagem mitocondrial.
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Discussion
Este artigo descreve um método para analisar o transporte mitocondrial e a morfologia em axônios neuronais usando corante fluorescente vermelho e software ImageJ, ambos fornecem uma plataforma única para estudar degeneração axonal e morfologia mitocondrial em doenças neurodegenerativas. Existem vários passos críticos no protocolo, incluindo a coloração de mitocôndrias, imagens de células ao vivo e análise das imagens. Neste método, um corante fluorescente foi usado para manchar mitocôndrias. Uma vez que os neurônios humanos derivados do iPSC são facilmente separados do prato, é importante deixar alguma solução no prato e adicionar suavemente meio neurobásal. A lavagem pode ser realizada três ou quatro vezes para remover o tinéte. Além disso, mitocôndrias podem ser rotuladas com outros repórteres para medir seu transporte ao longo de axônses, como proteínas fluorescentes fundidas mitocôndrias visando proteínas6. No rastreamento de longo prazo, várias sondas (ou seja, NPA-TPP, 2,1,3 benzothiadiazol [BTD] derivativos fluorescentes e uma sonda raman específica) mostraram grande potencial no rastreamento mitocondrial de longo prazo e na análise de dinâmica mitocondrial23,24,25. As vantagens e desvantagens de várias sondas podem ser encontradas na Tabela 1.
Após a coloração mitocondrial, a imagem de células vivas é realizada usando um microscópio equipado com uma incubadora. Para efetivamente concentrar os neurônios durante a imagem, as amostras neurais devem ser mantidas na incubadora de 37 °C com 5% de CO2 e em um ambiente úmido por pelo menos 15 min. Para minimizar os efeitos fora de foco, imagens em diferentes posições Z podem ser tomadas para fazer uma pilha Z, ou a função de foco automático pode ser utilizada. É importante ressaltar que, para identificar a direção do transporte mitocondrial (anterogrado ou retrógrado), imagens de fase são tomadas para distinguir o corpo e os axôlos neuronais. Outra questão crítica é o fotobranqueamento de amostras fluorescentes, que devem ser evitadas para obter imagens eficientes de lapso de tempo de transporte mitocondrial. Um método eficaz para minimizar o fotobranqueamento é focar amostras através da ocular e definir todos os parâmetros de imagem o canal de fase, exceto o tempo de exposição. Além disso, o padrão de dimensionamento automático pode diminuir o fotobranqueamento da fluorescência.
Mitocôndrias são organelas altamente dinâmicas e podem se mover em direções anteroras e retrógradas. Nos neurônios, algumas mitocôndrias dentro de axônons permanecem estacionárias durante a gravação. Entre as mitocôndrias em movimento, o status de movimento pode variar ao longo do tempo. Esse fenômeno levanta a importante questão de qual tipo mitocôndriaé é considerado estacionário ou em movimento. Isso pode ser resolvido definindo o limiar durante a análise do transporte axonal mitocondrial. Para distinguir as mitocôndrias estáticas, Neumann et al. utilizaram o centro de pista mitocondrial, que é definido como a média de suas coordenadas de posição ao longo do tempo, em seguida, definir o limiar para 350 nm/s para que a distância máxima de desvio do centro de trilha sibilou no primeiro quadro26. Em outro estudo, os autores estabelecem 50 nm/s como o limiar para distinguir o status estacionário do statusmóvel 27. Um limiar de 300 nm/s foi usado aqui para distinguir o transporte baseado em microtúbulo, como feito nos relatórios anteriores28,29. Embora o limiar para mitocôndrias estacionárias e móveis seja diferente, definir o limiar pode fornecer informações relativas importantes sobre o movimento mitocondrial dentro de axôlos entre neurônios selvagens e degenerativos.
A maioria dos protocolos envolvendo análise de transporte mitocondrial tem usado kymogramas, que são representação bidimensional de posições versus tempo. Várias ferramentas automatizadas foram desenvolvidas para análise do rastreamento de partículas26,30,31,32,33,34. Estes podem separar com precisão cada quadro. Além da velocidade e percentual motile que o ImageJ pode medir, este método pode medir os eventos motile com precisão. No entanto, estes não são livres para usar. Aqui, a análise do transporte mitocondrial foi realizada utilizando imageJ com os plugins "Multikymograph" e "Macros". Esses plugins podem efetivamente medir o movimento mitocondrial. A vantagem desses plugins é sua facilidade de uso e capacidade de indicar alterações no transporte axonal mitocondrial na forma de kymographs e velocidade ao longo do tempo.
Mitocôndrias motile foram analisadas em SPG3A e neurônios de controle. Observou-se uma redução semelhante no percentual de mitocôndrias motiles utilizando dois métodos de análise diferentes, confirmando a utilidade do ImageJ para analisar o transporte axonal. Além disso, a morfologia mitocondrial pode ser analisada usando o mesmo conjunto de imagens, o que fornece leituras importantes para estudar disfunção mitocondrial em várias doenças neurológicas. Uma vez que a degeneração axonal e a disfunção mitocondrial geralmente ocorrem durante estágios anteriores, antes da morte dos neurônios, este método pode ser usado para examinar mudanças patológicas precoces para ajudar a identificar caminhos moleculares e terapêutica de tela para resgatar neurodegeneração.
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Disclosures
Os autores não declaram interesses financeiros concorrentes.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado pela Fundação Paraplegia Spastic, fundação Blazer e o NIH (R21NS109837).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Accutase Cell Detachment Solution | Innovative Cell Technologies | AT104 | |
| Biosafety hood | Thermo Scientific | 1300 SERIES A2 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A-7906 | |
| Brain derived neurotrophic factor (BDNF) | Peprotech | 450-02 | |
| Centrifuge | Thermo Scientific | Sorvall Legend X1R/ 75004261 | |
| Coverslips | Chemiglass Life Sciences | 1760-012 | |
| Cyclic AMP (cAMP) | Sigma-Aldrich | D0627 | |
| Dispase | Gibco | 17105-041 | |
| Dorsomorphin | Selleckchem | S7146 | |
| Dulbecco's modified eagle medium with F12 nutrient mixture (DMEM/F12) | Corning | 10-092-CV | |
| FBS | Gibco | 16141-002 | |
| Fibroblast growth factor 2 (FGF2, bFGF) | Peprotech | 100-18B | |
| Geltrex LDEV-Free Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix | Gibco | A1413201 | |
| Gem21 NeuroPlex Serum-Free Supplement | Gemini | 400-160 | |
| Glass Bottom Dishes | MatTek | P35G-0.170-14-C | |
| 9'' glass pipetes | VWR | 14673-043 | |
| Glial derived neurotrophic factor (BDNF) | Sigma-Aldrich | D0627 | |
| GlutaMAX-I | Gibco | 35050-061 | |
| Heparin | Sigma | H3149 | |
| Insulin growth factor 1 (IGF1) | Invitrogen | M7512 | |
| Knockout Serum Replacer | Gibco | A31815 | |
| Laminin | Sigma | L-6274 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma | M3148-100ML | |
| MitoTracker CMXRos | Invitrogen | M7512 | |
| Neurobasal medium | Gibco | 21103-049 | |
| Non Essential Amino Acids | Gibco | 11140-050 | |
| N2 NeuroPle Serum-Free Supplement | Gemini | 400-163 | |
| Olympus microscope IX83 | Olympus | IX83-ZDC2 | |
| PBS | Corning | 21-031-CV | |
| Phase contrast microscope | Olympus | CKX41/ IX2-SLP | |
| 6 well plates | Corning | 353046 | |
| 24 well plates | Corning | 353047 | |
| Poly-L-ornithine hydrobromide (polyornithine)) | Sigma-Aldrich | P3655 | |
| SB431542 | Stemgent | 04-0010 | |
| Sterile 50ml Disposable Vacuum Filtration System 0.22 μm Millipore Express® Plus Membrane | Millipore | SCGP00525 | |
| Stericup 500/1000 ml Durapore 0.22 μM PVDF | Millipore | SCGVU10RE | |
| Tbr1 antibody (1:2000) | Chemicon | AB9616 | |
| Trypsin inhibitor | Gibco | 17075029 | |
| 50 ml tubes | Phenix | SS-PH50R | |
| 15 ml tubes | Phenix | SS-PH15R | |
| T25 flasks (untreated) | VWR | 10861-572 | |
| Plugins for softwares | |||
| Bio-formats Package | http://downloads.openmicroscopy.org/bio-formats/5.1.0/ | ||
| Fiji software | https://fiji.sc/ | ||
| Kymograph Plugin | https://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html | ||
| MultipleKymograph.class | https://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html | ||
| MultipleOverlay.class | https://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html | ||
| WalkingAverage.class | https://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html | ||
| StackDifference.class | https://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html | ||
| Straighten_.jar | https://imagej.nih.gov/ij/plugins/straighten.html | ||
| tsp050706.txt | https://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html |
References
- Brown, A. Axonal transport of membranous and nonmembranous cargoes: a unified perspective. Journal of Cell Biology. 160 (6), 817-821 (2003).
- Morris, R. L., Hollenbeck, P. J. Axonal transport of mitochondria along microtubules and F-actin in living vertebrate neurons. The Journal of Cell Biology. 131 (5), 1315-1326 (1995).
- Schwarz, T. L.
- Magrane, J., Cortez, C., Gan, W. B., Manfredi, G. Abnormal mitochondrial transport and morphology are common pathological denominators in SOD1 and TDP43 ALS mouse models. Human Molecular Genetics. 23 (6), 1413-1424 (2014).
- Alami, N. H., et al. Axonal transport of TDP-43 mRNA granules is impaired by ALS-causing mutations. Neuron. 81 (3), 536-543 (2014).
- Wang, X., Schwarz, T. L.
- Course, M. M., et al. Live Imaging Mitochondrial Transport in Neurons. Neuromethods. 123, 49-66 (2017).
- Chazotte, B. Labeling mitochondria with fluorescent dyes for imaging. Cold Spring Harbor Protocols. 2009 (6), 4948 (2009).
- Meijering, E., Dzyubachyk, O., Smal, I. Methods for cell and particle tracking. Methods in Enzymology. 504, 183-200 (2012).
- Bros, H., Hauser, A., Paul, F., Niesner, R., Infante-Duarte, C. Assessing Mitochondrial Movement Within Neurons: Manual Versus Automated Tracking Methods. Traffic. 16 (8), 906-917 (2015).
- Rietdorf, J. http://www.embl.de/eamnet/html/kymograph.html. , Available from: http://www.embl.de/eamnet/html/kymograph.html (2015).
- Calkins, M. J., Manczak, M., Mao, P., Shirendeb, U., Reddy, P. H. Impaired mitochondrial biogenesis, defective axonal transport of mitochondria, abnormal mitochondrial dynamics and synaptic degeneration in a mouse model of Alzheimer's disease. Human Molecular Genetics. 20 (23), 4515-4529 (2011).
- Denton, K., et al. Impaired mitochondrial dynamics underlie axonal defects in hereditary spastic paraplegias. Human Molecular Genetics. 27 (14), 2517-2530 (2018).
- Kim-Han, J. S., Antenor-Dorsey, J. A., O'Malley, K. L. The parkinsonian mimetic, MPP+, specifically impairs mitochondrial transport in dopamine axons. Journal of Neuroscience. 31 (19), 7212-7221 (2011).
- Shirendeb, U. P., et al. Mutant huntingtin's interaction with mitochondrial protein Drp1 impairs mitochondrial biogenesis and causes defective axonal transport and synaptic degeneration in Huntington's disease. Human Molecular Genetics. 21 (2), 406-420 (2012).
- Lo Giudice, T., Lombardi, F., Santorelli, F. M., Kawarai, T., Orlacchio, A. Hereditary spastic paraplegia: clinical-genetic characteristics and evolving molecular mechanisms. Experimental Neurology. 261, 518-539 (2014).
- Blackstone, C. Cellular pathways of hereditary spastic paraplegia. Annual Review of Neuroscience. 35, 25-47 (2012).
- Boisvert, E. M., Denton, K., Lei, L., Li, X. J. The specification of telencephalic glutamatergic neurons from human pluripotent stem cells. Journal of Visualized Experiments. (74), e50321 (2013).
- Zhu, P. P., Denton, K. R., Pierson, T. M., Li, X. J., Blackstone, C. Pharmacologic rescue of axon growth defects in a human iPSC model of hereditary spastic paraplegia SPG3A. Human Molecular Genetics. 23 (21), 5638-5648 (2014).
- Marra, M. H., Tobias, Z. J., Cohen, H. R., Glover, G., Weissman, T. A. In Vivo Time-Lapse Imaging in the Zebrafish Lateral Line: A Flexible, Open-Ended Research Project for an Undergraduate Neurobiology Laboratory Course. Journal of Undergraduate Neuroscience Education. 13 (3), 215-224 (2015).
- Kang, J. S., et al. Docking of axonal mitochondria by syntaphilin controls their mobility and affects short-term facilitation. Cell. 132 (1), 137-148 (2008).
- Mou, Y., Li, X. J. Rescue axonal defects by targeting mitochondrial dynamics in hereditary spastic paraplegias. Neural Regeneration Research. 14 (4), 574-577 (2019).
- Huang, S., et al. New photostable naphthalimide-based fluorescent probe for mitochondrial imaging and tracking. Biosensors & Bioelectronics. 71, 313-321 (2015).
- Carvalho, P. H., et al. Designed benzothiadiazole fluorophores for selective mitochondrial imaging and dynamics. Chemistry. 20 (47), 15360-15374 (2014).
- Yamakoshi, H., et al. A sensitive and specific Raman probe based on bisarylbutadiyne for live cell imaging of mitochondria. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 25 (3), 664-667 (2015).
- Neumann, S., Chassefeyre, R., Campbell, G. E., Encalada, S. E. KymoAnalyzer: a software tool for the quantitative analysis of intracellular transport in neurons. Traffic. 18 (1), 71-88 (2017).
- Chen, M., et al. A new method for quantifying mitochondrial axonal transport. Protein & Cell. 7 (11), 804-819 (2016).
- De Vos, K. J., Sheetz, M. P. Visualization and quantification of mitochondrial dynamics in living animal cells. Methods in Cell Biology. 80, 627-682 (2007).
- Denton, K. R., Xu, C. C., Li, X. J. Modeling Axonal Phenotypes with Human Pluripotent Stem Cells. Methods in Molecular Biology. 1353, 309-321 (2016).
- Andrews, S., Gilley, J., Coleman, M. P. Difference Tracker: ImageJ plugins for fully automated analysis of multiple axonal transport parameters. Journal of Neuroscience Methods. 193 (2), 281-287 (2010).
- Reis, G. F., et al. Molecular motor function in axonal transport in vivo probed by genetic and computational analysis in Drosophila. Molecular Biology of the Cell. 23 (9), 1700-1714 (2012).
- Broeke, J. H., et al. Automated quantification of cellular traffic in living cells. Journal of Neuroscience Methods. 178 (2), 378-384 (2009).
- Welzel, O., Knorr, J., Stroebel, A. M., Kornhuber, J., Groemer, T. W. A fast and robust method for automated analysis of axonal transport. European Biophysics Journal : EBJ. 40 (9), 1061-1069 (2011).
- Mukherjee, A., et al. Automated kymograph analysis for profiling axonal transport of secretory granules. Medical Image Analysis. 15 (3), 354-367 (2011).
- Klionsky, D. J., et al. Guidelines for the use and interpretation of assays monitoring autophagy. Autophagy. 12, 1 (2016).
- Metivier, D., et al. Cytofluorometric detection of mitochondrial alterations in early CD95/Fas/APO-1-triggered apoptosis of Jurkat T lymphoma cells. Comparison of seven mitochondrion-specific fluorochromes. Immunology Letters. 61 (2-3), 157-163 (1998).
- Scaduto, R. C., Grotyohann, L. W. Measurement of mitochondrial membrane potential using fluorescent rhodamine derivatives. Biophysical Journal. 76, Pt 1 469-477 (1999).
- Liu, X., Yang, L., Long, Q., Weaver, D., Hajnoczky, G. Choosing proper fluorescent dyes, proteins, and imaging techniques to study mitochondrial dynamics in mammalian cells. Biophysics Reports. 3 (4), 64-72 (2017).
- Zhou, B., Lin, M. Y., Sun, T., Knight, A. L., Sheng, Z. H.
