Nedsatt mitokondriell transport och morfologi är involverade i olika neurodegenerativa sjukdomar. Det presenterade protokollet använder inducerad pluripotent stamcellshärledda förhjärnnervceller för att bedöma mitokondriell transport och morfologi i ärftliga spastic paraplegi. Detta protokoll möjliggör karakterisering av mitokondriell handel längs axoner och analys av deras morfologi, vilket kommer att underlätta studiet av neurodegenerativsjukdom.
Nervceller har intensiva krav på hög energi för att stödja deras funktioner. Nedsatt mitokondriell transport längs axoner har observerats i mänskliga nervceller, vilket kan bidra till neurodegeneration i olika sjukdomstillstånd. Även om det är utmanande att undersöka mitokondriell dynamik i levande mänskliga nerver, sådana paradigm är avgörande för att studera den roll som mitokondrierna i neurodegeneration. Beskrivs här är ett protokoll för att analysera mitokondriell transport och mitokondriell morfologi i framhjärnan neuron axons härrör från mänskliga inducerad pluripotenta stamceller (iPSCs). IPSCs är differentierade till telencephalic glutamatergic nervceller med hjälp av väletablerade metoder. Mitokondrierna av nervcellerna är färgade med MitoTracker CMXRos, och mitokondriell rörelse inom axonerna fångas med hjälp av en levande cell imaging mikroskop utrustad med en inkubator för cellkultur. Time-lapse bilder analyseras med hjälp av programvara med “MultiKymograph”, “Bioformat importör” och “Makron” plugins. Kymografier av mitokondriell transport genereras, och genomsnittlig mitokondriell hastighet i anterograde och bakåtsträvande riktningar läses från kymgrafen. När det gäller mitokondriell morfologi analys, mitokondriell längd, område och bildförhållande erhålls med hjälp av ImageJ. Sammanfattningsvis tillåter detta protokoll karakterisering av mitokondriell handel längs axoner och analys av deras morfologi för att underlätta studier av neurodegenerativa sjukdomar.
Mitokondriellt motilitet och distribution spelar en viktig roll för att uppfylla varierande och specialiserade energiska krav i polariserade nervceller. Nervceller kan förlänga extremt långa axoner för att ansluta med mål genom bildandet av synapser, som kräver höga nivåer av energi för Ca2 + buffring och jonströmmar. Transport av mitokondrierna från soma till axon är avgörande för att stödja axonal och synaptisk funktion av nervceller. Rumsligt och tidsmässigt dynamisk mitokondriell rörelse utförs av snabb axonal transport till priser på flera mikrometer per sekund1.
Specifikt, motor eller adapter proteiner, såsom kinesin och dynein, delta i snabb organell transport längs mikrotubuli för att kontrollera förflyttning av mitokondrierna2,3. Normal neuronal aktivitet kräver korrekt transport av nymonterade mitokondrierna från neuronal soma till distala axon (anterograde axonal transport) och omvänd transport av mitokondrierna från distala axon tillbaka till cellkroppen (bakåtsträvande transport). Nyligen genomförda studier har visat att felaktig mitokondriell tilldelning är starkt förknippad med neuronala defekter och motor neuron degenerativa sjukdomar4,5. Därför, att dissekera rollen som mitokondrierna i neurodegeneration, är det viktigt att fastställa metoder för att undersöka mitokondriell rörelse längs axoner i levande kulturer.
Det finns två huvudsakliga utmaningar i att undersöka och analysera spårning av mitokondrierna: (1) identifiera mitokondrierna från bakgrunden i varje ram, och (2) analysera och generera anslutningar mellan varje ram. För att lösa den första utmaningen används en fluorescensmärkning sett till att skilja mitokondrierna från bakgrunden, såsom MitoTracker färgämne eller transfection av fluorescens-smält mitokondriellt inriktning protein (t.ex. mito-GFP)6,7,8. För att analysera sambandet mellan ramar har flera algoritmer och programvaruverktyg beskrivits i tidigare studier9. I en nyligen publicerad uppsats jämförde forskarna fyra olika automatiserade verktyg (t.ex. Volocity, Imaris, wrMTrck och Difference Tracker) med att kvantifiera mitokondriell transport. Resultaten visade att trots avvikelser i spårlängd, mitokondriell förskjutning, rörelselängd och hastighet, dessa automatiserade verktyg är lämpliga för utvärdering av transportskillnad efter behandling10. Förutom dessa verktyg, en integrerad plugin “Macros” för ImageJ (skriven av Rietdorf och Seitz) har använts ofta för att analysera mitokondriell transport11. Denna metod genererar kymografier som kan användas för att analysera mitokondriell rörelse, inklusive hastighet i både anterograde och bakåtsträvande riktningar.
Mitokondrierna är mycket dynamiska organeller som ständigt förändras i antal och morfologi som svar på både fysiologiska och patologiska tillstånd. Mitokondriell fission och fusion reglerar noggrant mitokondriell morfologi och homeostas. Obalansen mellan mitokondriell fission och fusion kan framkalla extremt korta eller långa mitokondriella nätverk, vilket kan försämra mitokondriell funktion och resultera i onormala neuronala aktiviteter och neurodegeneration. Nedsatt mitokondriell transport och morfologi är involverade i olika neurodegenerativa sjukdomar, såsom Alzheimers sjukdom, Parkinsons sjukdom, Huntingtons sjukdom och ärftliga spastic paraplegi (HSP)12,13,14,15. HSP är en heterogen grupp av ärftliga neurologiska sjukdomar som kännetecknas av degeneration av kortikospinal tarmkanalen och efterföljande underlåtenhet att kontrollera nedre extremitetsmusklerna16,17. I denna studie används iPSC-härledda förhjärnnervceller för att bedöma mitokondriell transport och morfologi i HSP. Denna metod ger ett unikt paradigm för att undersöka mitokondriell dynamik neuronal axons i levande kulturer.
Denna artikel beskriver en metod för att analysera mitokondriell transport och morfologi i neuronal axons med hjälp av rött fluorescerande färgämne och ImageJ programvara, som båda ger en unik plattform för att studera axonal degeneration och mitokondriell morfologi i neurodegenerativa sjukdomar. Det finns flera kritiska steg i protokollet, inklusive färgning av mitokondrierna, levande cell avbildning, och analysera bilderna. I denna metod användes ett fluorescerande färgämne för att färga mitokondrierna. Ef…
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöddes av Spastic Parplegia Foundation, Blazer Foundation och NIH (R21NS109837).
Accutase Cell Detachment Solution | Innovative Cell Technologies | AT104 | |
Biosafety hood | Thermo Scientific | 1300 SERIES A2 | |
Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A-7906 | |
Brain derived neurotrophic factor (BDNF) | Peprotech | 450-02 | |
Centrifuge | Thermo Scientific | Sorvall Legend X1R/ 75004261 | |
Coverslips | Chemiglass Life Sciences | 1760-012 | |
Cyclic AMP (cAMP) | Sigma-Aldrich | D0627 | |
Dispase | Gibco | 17105-041 | |
Dorsomorphin | Selleckchem | S7146 | |
Dulbecco's modified eagle medium with F12 nutrient mixture (DMEM/F12) | Corning | 10-092-CV | |
FBS | Gibco | 16141-002 | |
Fibroblast growth factor 2 (FGF2, bFGF) | Peprotech | 100-18B | |
Geltrex LDEV-Free Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix | Gibco | A1413201 | |
Gem21 NeuroPlex Serum-Free Supplement | Gemini | 400-160 | |
Glass Bottom Dishes | MatTek | P35G-0.170-14-C | |
9'' glass pipetes | VWR | 14673-043 | |
Glial derived neurotrophic factor (BDNF) | Sigma-Aldrich | D0627 | |
GlutaMAX-I | Gibco | 35050-061 | |
Heparin | Sigma | H3149 | |
Insulin growth factor 1 (IGF1) | Invitrogen | M7512 | |
Knockout Serum Replacer | Gibco | A31815 | |
Laminin | Sigma | L-6274 | |
2-Mercaptoethanol | Sigma | M3148-100ML | |
MitoTracker CMXRos | Invitrogen | M7512 | |
Neurobasal medium | Gibco | 21103-049 | |
Non Essential Amino Acids | Gibco | 11140-050 | |
N2 NeuroPle Serum-Free Supplement | Gemini | 400-163 | |
Olympus microscope IX83 | Olympus | IX83-ZDC2 | |
PBS | Corning | 21-031-CV | |
Phase contrast microscope | Olympus | CKX41/ IX2-SLP | |
6 well plates | Corning | 353046 | |
24 well plates | Corning | 353047 | |
Poly-L-ornithine hydrobromide (polyornithine)) | Sigma-Aldrich | P3655 | |
SB431542 | Stemgent | 04-0010 | |
Sterile 50ml Disposable Vacuum Filtration System 0.22 μm Millipore Express® Plus Membrane | Millipore | SCGP00525 | |
Stericup 500/1000 ml Durapore 0.22 μM PVDF | Millipore | SCGVU10RE | |
Tbr1 antibody (1:2000) | Chemicon | AB9616 | |
Trypsin inhibitor | Gibco | 17075029 | |
50 ml tubes | Phenix | SS-PH50R | |
15 ml tubes | Phenix | SS-PH15R | |
T25 flasks (untreated) | VWR | 10861-572 | |
Plugins for softwares | |||
Bio-formats Package | http://downloads.openmicroscopy.org/bio-formats/5.1.0/ | ||
Fiji software | https://fiji.sc/ | ||
Kymograph Plugin | https://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html | ||
MultipleKymograph.class | https://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html | ||
MultipleOverlay.class | https://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html | ||
WalkingAverage.class | https://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html | ||
StackDifference.class | https://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html | ||
Straighten_.jar | https://imagej.nih.gov/ij/plugins/straighten.html | ||
tsp050706.txt | https://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html |