Summary
Bozulmuş mitokondriyal taşıma ve morfolojisi çeşitli nörodejeneratif hastalıklarda rol oynamaktadır. Sunulan protokol, kalıtsal spastik paraplejide mitokondriyal taşıma ve morfolojiyi değerlendirmek için indüklenmiş pluripotent kök hücre kaynaklı ön beyin nöronlarını kullanır. Bu protokol, aksonların boyunca mitokondriyal ticaretinin karakterizasyonuna ve nörodejeneratif hastalıkların incelenmesini kolaylaştıracak morfolojilerinin analizine olanak sağlamaktadır.
Abstract
Nöronlar işlevlerini desteklemek için yüksek enerji için yoğun talepleri var. Aksonları boyunca bozulmuş mitokondriyal taşıma insan nöronlarında gözlenmiştir, hangi çeşitli hastalık durumlarında nörodejenerasyon katkıda bulunabilir. Canlı insan sinirlerinde mitokondriyal dinamikleri incelemek zor olsa da, bu tür paradigmalar nörodejenerasyonda mitokondrinin rolünü incelemek için kritik öneme sahiptir. Burada açıklanan insan kaynaklı pluripotent kök hücrelerden (iPSCs) elde edilen ön beyin nöron aksonları mitokondriyal taşıma ve mitokondriyal morfoloji analiz etmek için bir protokoldür. IPSCs iyi kurulmuş yöntemler kullanılarak telensefalik glutamaterjik nöronlar ayrılır. Nöronların Mitokondrisi MitoTracker CMXRos ile boyanmış, ve aksonlar içinde mitokondriyal hareket hücre kültürü için bir kuluçka ile donatılmış bir canlı hücre görüntüleme mikroskobu kullanılarak yakalanır. Hızlandırılmış görüntüler "MultiKymograph", "Bioformat importer" ve "Macros" eklentileri içeren yazılımlar kullanılarak analiz edilir. Mitokondriyal taşımanın mitokondriyal taşımanın miyografları oluşturulur ve anterograd ve retrograd yönlerde ortalama mitokondriyal hız kymograflardan okunur. Mitokondriyal morfoloji analizi ile ilgili olarak, mitokondriyal uzunluk, alan ve en boy oranı ImageJ kullanılarak elde edilir. Özetle, bu protokol nörodejeneratif hastalıkların çalışmalarını kolaylaştırmak için akson boyunca mitokondriyal ticaretin karakterizasyonuve morfolojilerinin analizine olanak sağlamaktadır.
Introduction
Mitokondriyal hareketlilik ve dağılım polarize nöronlarda değişken ve özel enerjik taleplerin karşılanmasında hayati bir rol oynamaktadır. Nöronlar, Ca2+ tamponlama ve iyon akımları için yüksek düzeyde enerji gerektiren sinapsoluşumu yoluyla hedeflerle bağlantı kurmak için son derece uzun aksonları genişletebilirler. Mitokondrinin somadan aksona taşınması nöronların aksonal ve sinaptik fonksiyonunu desteklemek için çok önemlidir. Mekansal ve zamansal dinamik mitokondriyal hareket saniyede birkaç mikrometre hızlarda hızlı aksonal taşıma ile yapılır1.
Özellikle, motor veya adaptör proteinleri, kinesin ve dinin in gibi, mitokondri hareketini kontrol etmek için mikrotübüller boyunca hızlı organel taşıma katılmak2,3. Normal nöronal aktivite, nöronal somadan distal aksona (anterograd aksonal taşıma) ve mitokondrinin distal aksondan hücre gövdesine geri geri taşınmasına (retrograd taşıma) yeni monte edilmiş mitokondrinin uygun şekilde taşınmasını gerektirir. Son çalışmalar uygunsuz mitokondriyal ayırma kuvvetle nöronal defektler ve motor nöron dejeneratif hastalıklar ile ilişkili olduğunu göstermiştir4,5. Bu nedenle, nörodejenerasyon da mitokondri rolünü incelemek için, canlı kültürlerde akson boyunca mitokondriyal hareketi incelemek için yöntemler kurmak önemlidir.
Mitokondrinin izlenmesinin incelenmesi ve analiz edilmesinde iki temel zorluk vardır: (1) her çerçevede arka plandan mitokondrinin tanımlanması ve (2) her kare arasındaki bağlantıların analiz edilmesi ve üretilmesi. İlk zorluğun çözümünde, mitokondriyi arka plandan ayırt etmek için yaygın olarak bir floresan etiketleme yaklaşımı kullanılır, örneğin MitoTracker boya veya floresan erimiş mitokondriyal hedefleme proteininin transfeksiyonu (örn. mito-GFP)6,7,8. Çerçeveler arasındaki ilişkiyi analiz etmek için, çeşitli algoritmalar ve yazılım araçları önceki çalışmalarda tanımlanmıştır9. Yakın tarihli bir makalede, araştırmacılar mitokondriyal taşımayı ölçmek için dört farklı otomatik aracı (örneğin, Volocity, Imaris, wrMTrck ve Difference Tracker) karşılaştırdılar. Sonuçlar, pist uzunluğu, mitokondriyal deplasman, hareket süresi ve hız daki farklılıklara rağmen, bu otomatik araçların tedavi sonrası taşıma farkını değerlendirmek için uygun olduğunu gösterdi10. Bu araçlara ek olarak, ImageJ için entegre bir eklenti "Makrolar" (Rietdorf ve Seitz tarafından yazılmış) yaygın mitokondriyal taşıma analiz etmek için kullanılmıştır11. Bu yöntem, hem anterograd hem de retrograd yönlerde hız da dahil olmak üzere mitokondriyal hareketi analiz etmek için kullanılabilecek kymograflar oluşturur.
Mitokondri, hem fizyolojik hem de patolojik durumlara yanıt olarak sayı ve morfolojide sürekli olarak değişen son derece dinamik organellerdir. Mitokondriyal fizyon ve füzyon mitokondriyal morfolojive homeostazı sıkı bir şekilde düzenler. Mitokondriyal fizyon ve füzyon arasındaki dengesizlik son derece kısa veya uzun mitokondriyal ağları neden olabilir, hangi mitokondriyal fonksiyon bozabilir ve anormal nöronal aktiviteler ve nörodejenerasyon neden olabilir. Bozulmuş mitokondriyal ulaşım ve morfoloji alzheimer hastalığı, Parkinson hastalığı, Huntington hastalığı ve kalıtsal spastik parapleji (HSP)12,13,14,15gibi çeşitli nörodejeneratif hastalıklar, yer almaktadır. HSP, kortikospinal sistemin dejenerasyonu ve alt ekstremite kaslarının kontrol altına alınmaması ile karakterize kalıtsal nörolojik hastalıkların heterojen bir grubudur16,17. Bu çalışmada HSP'de mitokondriyal taşıma ve morfolojiyi değerlendirmek için iPSC kaynaklı ön beyin nöronlar kullanılmaktadır. Bu yöntem canlı kültürlerde nöronal aksonların mitokondriyal dinamikleri incelemek için benzersiz bir paradigma sağlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. IPSCs telencephalic glutamaterjik nöronların üretimi
NOT: iPSC'lerin korunması ve bunların telensefalik glutamaterjik nöronlara farklılaşması için ayrıntılı protokol daha önce18açıklananlara benzer. Burada, insan pluripotent kök hücrelerinin farklılaşması sırasında kritik süreç tanıtıldı ve vurgulanır.
- İnsan embriyonik kök hücre (hESC) orta fibroblast büyüme faktörü (bFGF, 4 ng / mL) ile desteklenen fare embriyonik fibroblast (MEF) besleyiciler üzerinde Kültür iPSCs.
- 3 dk dispase (1 mg/mL) ile kuluçkadan sonra, iPSC'leri küçük kümelere ayırın. Daha sonra, kültür iPSC 4 gün boyunca hESC ortamda süspansiyon toplar. Bu zaman noktasına bakın, iPSC'ler askıya alma kültürü olarak başlatıldığında, gün 1 (D1). 4 gün boyunca orta günlük değiştirin.
- D5'te, 2 dakika 2 00 x g'de santrifüj den sonra iPSC agregalarını ve nöral indüksiyon medyasında (NIM) 3 gün boyunca kültür toplayın. Kültür hücre her 2 günde bir medyanın yarısını değiştirerek 3 gün boyunca askıya toplanır. Nöral indüksiyon verimliliğini artırmak için NIM ortamına DMH-1 (2 μM) ve SB431542 (2 μM) ekleyin.
- D8'de, 2 000 x g'de santrifüjden sonra iPSC agregalarını toplayın ve nim'de %10 FBS (veya laminin kaplı plakalı) ile bir gecede culturing yaparak 6 kuyu plakasına (plaka başına yaklaşık 20-30 agrega) yapışmasını bekleyin. Ertesi gün, eski ortamı çıkarın ve D17'ye kadar her 2 günde bir NIM'e değiştirin.
NOT: Bu dönemde rozet yapılı columnar hücrelerin oluşumu ile endike olan nöroepitelyal hücrelerin oluşumu gözlenmektedir. - D17'de, kolonilerin merkezindeki nöroepitel hücreleri mekanik olarak izole edin (kolonilerin merkezine küçük bir basınç uygulayarak doğrudan havalanır) veya enzimatik olarak (dispase ile tedavi edilir). İzole nöroepitelyal hücreleri, B27 (1x), cAMP (1 μM) ve IGF (10 ng/mL) ilavesi ile 8 mL NIM içeren tedavi edilmeyen doku kültürü T25 şişesine aktarın.
NOT: Süspansiyon kültürü hücrelerin kortikal projeksiyon nöral ataları ile zenginleştirilmiş nörosferler oluşturmak için izin verir. - D35'ten sonra, nörosferleri poli-ornitin ve LDEV içermeyen azaltılmış büyüme faktörü bazal membran matrisi(Tablo Malzemeler) üzerine, telensefalik glutamaterjik nöronlar (kortikal projeksiyon nöronları) oluşturmak için kaplanmış 35 mm cam alt tabaklar. Kaplamadan önce, 37 °C'de 2 dakika boyunca 1 mg/mL hücre ayırma çözeltisi ile kuluçkaya yatarak nörosferleri küçük kümelere ayırın.
- Hücre ayırma çözeltisini santrifüj ile çıkarın ve 1 mL nöral farklılaşma ortamında (NDM) yeniden askıya alın. Cam alt çanak tabak hücreleri (çanak başına orta 100 μL yaklaşık beş kümeleri) onları takmak için. Daha sonra NDM (çanak başına 1 mL) ekleyin ve NDM'de B27 (1x), cAMP (1 μM), IGF (10 ng/mL), hBDNF (10 ng/mL) ve GDNF (10 ng/mL) içeren hücreleri kültüre geçirin.
NOT: Küçük kümeler iyi hayatta kalır lar ve uzun projeksiyon nöronlarına yol açarlar. Alternatif olarak, hücreler ayrıştırılabilir ve daha iyi ayırma için çanak başına yaklaşık 20.000 hücre yoğunluğunda kaplanabilir. - Tbr1 ve βIII-tubulin belirteçleri immünostaining ile telensefalik glutamaterjik nöronlar karakterize.
2. Telensefalik glutamaterjik nöronların aksonları boyunca mitokondriyal taşımanın incelenmesi
- NDM'yi ısıtın ve 37 °C ve %5 CO2olarak belirlenen floresan mikroskobu için kuvözde açın.
- Ön beyin nöronların aksonları boyunca mitokondriyi görselleştirmek için, ndm'deki canlı hücrelerdeki mitokondriyi (örneğin, MitoTracker CMXRos) 3 7 °C'de 3 dk boyunca lekelemek için 50 nM kırmızı floresan boya ile nöronları kuluçkaya yatırın. Daha sonra, ısıtılmış NDM ile hücreleri 2x yıkayın. Nöronlar NDM'de kuluçkaya yatmaktadır.
- Aksonlarla mitokondriyal taşımayı kaydetmek için, 40x hedefini floresan mikroskopla kullanarak mitokondriyal hareketin hızlandırılmış görüntülerini alın.
NOT: Kültürü stabilize etmek için, hücreler mitokondriyal boyama sonrasında 20 dakika boyunca kuvözde kuluçkaya yatırıldığında canlı hücre görüntülemesini gerçekleştirin. - Faz alanı altında, morfolojik özelliklere dayalı aksonları tanımlayın (doğrudan nöronal hücre gövdesinden ortaya, dallanma olmadan sabit ince uzun nöritler). Mitokondri anterograd hareket (hücre gövdesinden distal akson) ve retrograd yönde (aksonal terminalhücre gövdesi). Aksonları boyunca mitokondriyal hareketin yönünü ayırt etmek için, açıkça nöronların hücre organları belirlemek. Bu adımda, fotobeyaztlama azaltmak için faz alanı altında aksonları odak.
- Hücre gövdesi ve akson ayırt ettikten sonra, maruz kalma süresi ve akson mitokondri odak ayarlayın. Daha sonra, aksonlar içinde mitokondri taşıma yakalamak her 5 sin toplam süresi için 5 dakika, 60 kare verimli. Rastgele her yemek için en az beş konumları yakalamak ve her grup için 3x tekrarlayın.
3. Kortikal nöronlarda mitokondriyal taşıma ve morfolojiveri analizi
NOT: Bir görüntü analizi yazılımı (örneğin, ImageJ veya MetaMorph19)kullanarak mitokondriyal taşıma üzerinde toplanan verileri analiz edin. ImageJ hazır olduğundan, MultiKymographile ImageJ kullanarak mitokondriyal taşıma ve morfoloji analizi yapmak , Makrolar, ve parçacıklar eklentileri analiz.
- ImageJ kullanarak mitokondriyal taşıma analiz
- Mitokondriyal hareketliliğin hızlandırılmış görüntülerini yakaladıktan sonra MultiKymograph eklentisini kullanarak mitokondrinin hızını ve hareketini analiz edin. Görüntüler, daha önce bildirilen bir yöntem20'densonra Fiji yazılımı tarafından analiz edilen .tiff formatında dosyalar olarak kaydedilir.
- Fiji yazılımını indirin. Kymographs gelen mitokondriyal hareketli hızı analiz etmek için gerekli olacak eklentileri indirin. Bu dört .class eklentileri ile birlikte Bio-formatları Paketi ve Kymograph Eklentisi indirin: MultipleKymograph.class, MultipleOverlay.class, StackDifference.class ve WalkingAverage.class (Malzeme Tablosu). Bu dosyaları Fiji eklentileri klasörüne taşıyın. Eklentiler klasörüne "tsp050706.txt" eklentilerini indirin. Dosyalar eklentiler klasörüne taşındığında Fiji yazılımını yeniden başlatın.
- Fiji yazılımLarını açın. Eklentileriseçin, sonra Biyo-Formatlar İthalatçı ile .tiff serisinin görüntüleri almak Bio-Formatsaltında. Stack görüntülemede Standart ImageJ'i seçtiğinizden emin olun, tüm serileri açseçeneğini seçin, Otomatik Ölçek'iişaretleyin, ardından Tamam'ıtıklatın. Görüntünün üst kısmında görüntülenen piksellerde görüntünün kare numarasına ve boyutuna dikkat edin.
NOT: Görüntü başına 60 kare alın. - Tüm 60 kare için Görüntü menüsü altında parlaklığı/kontrastı ayarlayarak görüntüleri daha net hale getirin.
- Parçalı çizgiyi seçmek ve hücre gövdesinden başlayıp terminal akson'da biten parçalı bir çizgi çizmek için çizgi aracını sağ tıklatın. Eklentileraltında MultipleKymograph seçerek kymograph oluşturun. ÇokLİkOlarak seçildikten sonra çizgi genişliği seçimi istenir. Bunun tek bir sayı olduğundan emin olun. Çizgi genişliği için 1'i seçin. Bu adımdan sonra bir kymograph oluşturulur.
NOT: Kymograph'tan birkaç önemli bilgi okunabilir. Kymograph y ekseni 60 kare için süre (5 dk) süresidir. X ekseni seçili aksonun konumunu temsil eder. - Mitokondrinin hareket yönünü belirlemek için mimografta çapraz bir çizgi kullanın (anterograd, retrograd veya kararlı). Örneğin, y ekseni boyunca sağa inen bir çizgi anterograd hareketini, y ekseni boyunca sola inen bir çizgi ise retrograd hareketi gösterir. Dikey bir çizgi mitokondride hareket olmadığını gösterir.
- Fiji yazılımındaki Makrolar eklentisini kullanarak hareketli mitokondrinin uzaklıklarını, zaman değerlerini ve hızını ölçün. Eklentilere Git | Makrolar | Yükle | tsp050607.txt. Mitokondriyal hareketin iz üzerinde parçalanmış bir çizgi çizin ve her zaman alt bölgeye (y ekseni) çizgiyi çizin.
- Çizgiyi çizdikten sonra Eklentiler | Makrolar | tsp gelen hızları okuyun. İzleme boyunca bölümlenmiş bir çizgi çizildiğinden, eklenti çizgiye karşılık gelen parçalı hızları okur.
NOT: Tüm verilerin birimi pikseldir. dy toplamı başlangıç noktasından tüketilen süredir ve dx toplamı x ekseninde hareket eden mitokondrinin uzaklığı gösterir. dy şimdi ve dx şimdi sırasıyla her segment için dönem zaman ve hareket mesafesini gösterir. gerçek hız her segment için hızı gösterir (dx şimdi / dy şimdi). ortalama hız mitokondriyal hareketli (dx toplamı/dy toplamı) için ortalama hızı gösterir. - Ölçek çubuğunu ölçerek dx birimini şimdi pikselden μm'ye çevirin. Görüntülerdeki ölçek çubuklarını ölçerek birimi pikselden μm'ye dönüştürün. Ölçek çubuğu boyunca bir çizgi çizmek için çizgi aracını kullanın ve "Analiz et" altında Ölçü'üseçerek çizginin uzunluğunu ölçün. Bu denemede 1 piksel = 5 saniye olarak pikselden saniyeye kadar olan süreyi değiştirin.
- Elektronik tablo dosyasında, ortalama hızı hesaplayın ve buna karşılık geriye doğru veya anterograd hareketini etiketlendirin. Ortalama anterograd veya retrograd hareket hızı.
- Kymograph dan sabit ve hareketli mitokondri yüzdesini belirleyin. Anterograd veya retrograd hareketli mitokondri tüm periyot21boyunca kökeninden 5 μm ileri veya geri hareket olarak tanımlanır. Mitokondri, 5 dakika boyunca 5 μm'den fazla hareket etmedikleri takdirde sabit olarak kabul edilir.
- ImageJ kullanarak mitokondriyal morfolojianalizi
NOT: ImageJ kullanarak mitokondriyal uzunluk, alan ve en boy oranını ölçerek mitokondriyal morfolojiyi belirleyin. Bunu yapmak için aşağıdaki adımları izleyin.- Aksoniçindeki mitokondriyal uzunluk ve alanı analiz etmek için ImageJ web sitesinden Straighten_.jar eklentisini indirin (Bkz. Malzeme Tablosu)ve eklentilerklasörüne taşıyın. ImageJ yazılımLarını yeniden başlatın.
- Dosya altındaki açık işlev aracılığıyla resmi açın ve Resimaltındaki Yazı'yı kullanarak 32 bit lik görüntüyü 8 bit'e dönüştürün.
- Aksonlar boyunca parçalı bir çizgi çizin. Eklentilerin altında Düzleştir'i seçin ve Filament/Geniş Çizgi Genişliğiiçin 50 piksel ayarlayın. Bu düzleştirilmiş bir akson üretecektir.
- Image altındaki eşiği ayarlayın ve " Alan| Çevre | Fit elips | Şekil tanımlayıcıları.
- Çizgi işlevini kullanarak ölçek çubuğunu ölçün ve piksel,bilme mesafesive uzunluk biriminidoldurarak Analiz altında ölçeği ayarlayın. Ardından, bu ölçek ayarını ayarlamak için Global'i seçin.
- Alanı belirlemek için Analyze altındaki Parçacıkları Analiz Et'i kullanın. İstem parametreleri boyut (piksel^2) = 0,20-sonsuz, dairesellik = 0,00-1,00 ve show = elipslerdir. Sonuçları Görüntüle'yiseçin.
NOT: Ölçüm, alan, çevre, uzunluk (majör), genişlik (minör) ve en boy oranı (AR) dahil olmak üzere birden fazla mitokondriyal morfoloji parametrelerinin sonuçlarını verecektir. Karşılık gelen mitokondriyal sayı da listelenir. - Aksonal uzunluğa bölünen mitokondriyal sayıyı kullanarak akson başına mitokondriyal sayıyı (μm) hesaplayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Burada insan iPSC'leri telensefalik glutamaterjik nöronlar olarak farklılaştırılmış, bunlar Tbr1 ve βIII tubulin belirteçleri ile immünboyama ile karakterizedir (Şekil 1A). Mitokondrinin aksonal naklini incelemek için bu hücreler kırmızı floresan boya ile boyandı ve zaman atlamalı görüntüleme yapıldı. ImageJ kolayca kullanılabilir ve elde edilmesi daha kolay olduğundan, mitokondriyal taşıma daha fazla "MultiKymograph" ve "Makrolar" ImageJ eklentileri ile analiz edildi, Şekil 1gösterilir .
Statik, anterograd ve retrograd hareket dahil olmak üzere mitokondriyal hareketin üç tane ilgili şekli vardır(Şekil 1B,C). Tek bir mitokondri statik kalabilir veya bir akson içinde anterograd veya retrograd yönde hareket edebilir ve burada, hızı belirlemek için mitokondriyal hareket yolu boyunca segmentli bir çizgi çizilmiştir (Şekil 1D). Akson boyunca mitokondriyal hareketin hızı Şekil 1E'de gösterilmiştir ve ImageJ'de "Makrolar" ile okuduktan sonra Şekil 1D'deki segmentli çizgilere karşılık gelir. MetaMorph yazılımına benzer şekilde ImageJ, ImageJ tarafından oluşturulan mimografa dayalı olarak mitokondriyal hızını ve motil mitokondri yüzdesini belirlemek için kullanılabilir (Şekil 1F). Ticari olarak kullanılabilir analiz yazılımı (örneğin, MetaMorph) kullanarak, önceki veriler, hareketli mitokondri yüzdesinin normal nöronlara göre SPG3A nöronlarında önemli ölçüde azaldığını, hız ise19'da değiştirilmediğini göstermiştir. ImageJ yazılımını değerlendirmek için, hareketli mitokondri yüzdesi incelenmiş ve SPG3A nöronlarında hareketli mitokondri yüzdesinde, kontrol yabani tip (WT) nöronlara göre benzer bir azalma gözlenmiştir (Şekil 1G).
Mitokondriyal morfolojianalizi ile ilgili olarak, mitokondriyal alan, uzunluk ve AR ImageJ "analiz parçacıkları" fonksiyonu kullanılarak analiz edildi. Aksonlar "düzleştirme" eklentisi kullanılarak düzeltildi (Şekil 2A,B). Mitokondri eşiğe göre net bir şekilde seçilmiştir (Şekil 2C,D). Son olarak, "Parçacıkları Analiz Et" eklentisi kullanılarak düzleştirilmiş aksondan mitokondriyal alan, uzunluk (majör), genişlik (minör), en boy oranı ve çevre elde edilmiştir (Şekil 2E,F). Anormal mitokondriyal morfolojisi (ve daha önce olmuştur) HSP iPSC türetilmiş telensefalik glutamaterjik nöronlarda gözlendi, SPG15 hücreleri de dahil olmak üzere (Şekil 2G,H,I)13,22. SPG15 nöron aksonları ile wt nöron aksonları ile karşılaştırıldığında hem mitokondriyal uzunluk hem de en boy oranı önemli ölçüde azaltıldı(Şekil 2G,H,I).
Şekil 1: ImageJ kullanarak mitokondriyal taşıma analizi. (A) Telensefalik glutamaterjik nöronların neslini gösteren immünboyama. Tbr1 (kırmızı), βIII tubulin (yeşil) ve Hoechst (mavi). Ölçek çubukları = 50 μm. Bu rakam bir öncekiçalışma19değiştirilmiştir. (B) Nöronların aksonları içinde mitokondriyal taşıma. Anterograd mitokondriyal hareket hücre vücudundan distal akson'a hareket eden mitokondri olarak tanımlanır ve retrograd mitokondriyal hareket distal akson dan kaynaklanır ve nöronal hücre vücuduna kadar uzanır. Segment çizgisi, nöronal hücre gövdesinden distal aksonal terminale kadar olan aksonların boyunca çizilir ve kymograflar oluşturur. (C) Kymograph ImageJ kullanılarak oluşturulur; x ekseni aksonal konumdur ve y ekseni zamandır. Sürekli beyaz bir çizgi, anterograd yönde hareket eden mitokondriondur (pembe ok ucu), geriye doğru yön (mavi ok ucu) veya statik durumdur (sarı ok ucu). (D) Makrolar eklentisi kullanılarak hızı okumak için segmentli çizgi çizilir. 1-8 sayılar çizginin segmentini tanımlar. Anterograd hareketi (1-4, 6, 8) ve statik durum (5, 7) bu büyütülmüş kymograph ayırt edilebilir. (E) Her kesim için zaman ve hareketli mesafe, gerçek ve ortalama hız (piksel). (F) ImageJ kullanarak WT ve SPG3A kortikal PN'ler için mitokondriyal taşımanın kymografı. Ölçek çubuğu = 10 μm. (G) ImageJ kullanılarak WT ve SPG3A kortikal PN'lerde motile mitokondriyal oran (*p < 0.05). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: ImageJ kullanarak mitokondriyal morfolojianaliz. (A) Akson düzleştirme parametreleri. (B) Temsilci akson düzeltildi. (C,D) Mitokondri seçmek için eşik ayarlaması. (E,F) Ölçülen mitokondriyal alan, çevre, uzunluk (majör), genişlik (minör) ve en boy oranı (AR) (E) içinde seçilen mitokondriye karşılık gelir. (G) WT ve SPG15 telensefalik glutamaterjik nöronlarda mitokondri temsilcisi resimleri. Ölçek çubukları = 20 μm. (H) WT ve SPG15 nöronlarında mitokondriyal uzunluk. (I) WT ve SPG15 nöronlarında mitokondri en boy oranı. **p < 0,01 vs. WT. (G), (H) ve (I) önceki bir çalışmadan değiştirilmiştir13. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| Floresan Aletler | Avantaj -ları | Dezavantaj -ları | Başvuru |
| MitoTracker | MitoTracker mitokondriyal potansiyel-bağımsız ve otofilozom veya lizozom ile mitokondri kolokalizasyon analiz etmek için kullanılabilir. | MitoTracker uzun vadeli araştırma için yeterince fototable değildir. | 35 |
| NPA-TPP | Bu boya yeni bir fotografik mitokondriyal etiketleme reaktifidir. | Bu boyanın sentezi ve arınma süreci zaman alıcı ve maliyetlidir. | 23 |
| MitoBADY | Bu boya yüksek duyarlılık ve özgüllük ile Raman mikroskopi kullanılarak mitokondriyal görüntüleme için kullanılabilir. | Bu boyayı kullanmak Raman mikroskobu gerektirir. | 25 |
| TMRE | Bu boya düşük konsantrasyonlu ve söndürme etkisi olmayan toksik olmayan, spesifik mitokondriyal boyama boyasI. | TMRE etiketleme mitokondri mitokondriyal membran potansiyeline bağlıdır. | 36, 37 |
| Mitokondri hedefli floresan proteinler | Mitokondri hedefli floresan proteinler daha spesifik ve kararlıdır. | Bu yöntemtransfection ihtiyacı ve transfeksiyon verimliliği farklı hücre tipleri için farklıdır. | 38, 39 |
Tablo 1: Mitokondriyal etiketleme için bazı floresan aletlerin avantajları ve dezavantajları.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu makalede, her ikisi de nörodejeneratif hastalıkaksonal dejenerasyon ve mitokondriyal morfoloji çalışma için benzersiz bir platform sağlamak kırmızı floresan boya ve ImageJ yazılımı kullanarak nöronal aksonlarda mitokondriyal taşıma ve morfoloji analiz etmek için bir yöntem açıklanır. Protokolde mitokondri boyama, canlı hücre görüntüleme ve görüntüleri analiz dahil olmak üzere çeşitli kritik adımlar vardır. Bu yöntemde mitokondriyi lekelemek için floresan boya kullanılmıştır. İnsan iPSC kaynaklı nöronlar kolayca çanak müstakil olduğundan, çanak bazı çözüm bırakmak ve yavaşça nörobazal orta eklemek önemlidir. Yıkama boya kaldırmak için üç veya dört kez yapılabilir. Buna ek olarak, mitokondri diğer muhabirler ile akson boyunca taşıma ölçmek için etiketlenmiş olabilir, floresan protein erimiş mitokondri proteinleri hedefleyen gibi6. Uzun vadeli izleme, çeşitli problar (yani, NPA-TPP, 2,1,3-benzothiadiazole [BTD] floresan türevleri, ve belirli bir Raman prob) uzun vadeli mitokondriyal izleme ve mitokondriyal dinamikleri analizi23,24,25büyük bir potansiyel gösterdi . Çeşitli probların avantajları ve dezavantajları Tablo 1'debulunabilir.
Mitokondriyal boyama dan sonra canlı hücre görüntülemesi bir kuvöz ile donatılmış bir mikroskop kullanılarak gerçekleştirilir. Görüntüleme sırasında nöronların etkin bir şekilde odaklanabilmek için nöral numuneler %5 CO2 ile 37 °C'lik inkübatörde ve en az 15 dakika nemli bir ortamda tutulmalıdır. Odak dışı efektleri en aza indirmek için, z destesi yapmak için farklı Z konumlarında görüntüler alınabilir veya otomatik odaklama işlevi kullanılabilir. Daha da önemlisi, mitokondriyal taşıma yönünü belirlemek için (anterograd veya retrograd), faz görüntüleri nöronal hücre vücut ve aksonlar ayırt etmek için alınır. Bir diğer kritik konu da floresan numunelerin fotobeyazlatma, verimli mitokondriyal taşıma hızlandırılmış görüntüler elde etmek için engellenmesi gereken. Fotobeyaztasyonen aza indirmek için etkili bir yöntem, örnekleri mercek üzerinden odaklamak ve pozlama süresi dışında tüm görüntüleme parametrelerini faz kanalının altına ayarlamaktır. Ayrıca, otomatik ölçekleme deseni floresan fotobeyazrlama azaltabilir.
Mitokondri son derece dinamik organeller ve anterograd ve retrograd yönde hem de hareket edebilir. Nöronlarda, aksonların içindeki birkaç mitokondri kayıt sırasında sabit kalır. Hareketli mitokondri arasında, hareket durumu zaman içinde değişebilir. Bu olgu hangi mitokondri tipinin sabit veya hareketli olarak kabul edildiği sorusunu gündeme getirmektedir. Bu mitokondriyal aksonal taşıma analizi sırasında eşik ayarlayarak çözülebilir. Statik mitokondriyi ayırt etmek için, Neumann ve ark. zaman içinde konum koordinatlarının ortalaması olarak tanımlanan mitokondriyal pist merkezini kullandılar, sonra eşiği 350 nm/s olarak ayarlayın, böylece mitokondrinin parça merkezinden maksimum sapma mesafesi ilk kare26'dadır. Başka bir çalışmada, yazarlar hareketli durum27sabit durumu ayırt etmek için eşik olarak 50 nm / s ayarlayın. Bir 300 nm / s eşik önceki raporlarda yapıldığı gibi mikrotübül tabanlı taşıma ayırt etmek için burada kullanılmıştır28,29. Sabit ve hareketli mitokondri için eşik farklı olmasına rağmen, eşik ayarı yabani tip ve dejeneratif nöronlar arasında akson içinde mitokondriyal hareket hakkında önemli göreceli bilgi sağlayabilir.
Mitokondriyal ışınlaşma analizini içeren protokollerin çoğunda, pozisyonların zamana karşı iki boyutlu temsili olan miyomlar kullanılmıştır. Parçacık takibi nin analizi için birden fazla otomatik araç geliştirilmiştir26,30,31,32,33,34. Bunlar her kareyi doğru bir şekilde ayırabilir. ImageJ'in ölçebileceği hız ve hareketli yüzdeye ek olarak, bu yöntem hareketli olayları doğru bir şekilde ölçebilir. Ancak, bu kullanmak için ücretsiz değildir. Burada mitokondriyal taşıma nın analizi ImageJ kullanılarak "Multikymograph" ve "Macros" eklentileri ile gerçekleştirilmiştir. Bu eklentiler etkili mitokondriyal hareketi ölçebilirsiniz. Bu eklentilerin avantajı, kullanım kolaylığı ve mitokondriyal aksonal taşımadaki değişiklikleri zaman içinde miyograflar ve hız şeklinde gösterme yeteneğidir.
Motile mitokondri SPG3A ve kontrol nöronlarında analiz edildi. Hareketli mitokondri yüzdesinde benzer bir azalma iki farklı analiz yöntemi kullanılarak gözlendi ve ImageJ'in aksonal taşımayı analiz etmedeki yararlılığını doğruladı. Buna ek olarak, mitokondriyal morfoloji çeşitli nörolojik hastalıklarda mitokondriyal disfonksiyon eğitimi için önemli okumalar sağlayan görüntülerin aynı set kullanılarak analiz edilebilir. Aksonal dejenerasyon ve mitokondriyal disfonksiyon genellikle erken evrelerde meydana geldiğinden, nöronlar ölmeden önce, bu yöntem moleküler yolları ve kurtarma için ekran terapötik belirlemenize yardımcı olmak için erken patolojik değişiklikleri incelemek için kullanılabilir nörodejenerasyon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarları beyan.
Acknowledgments
Bu çalışma Spastik Parapleji Vakfı, Blazer Vakfı ve NIH (R21NS109837) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Accutase Cell Detachment Solution | Innovative Cell Technologies | AT104 | |
| Biosafety hood | Thermo Scientific | 1300 SERIES A2 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A-7906 | |
| Brain derived neurotrophic factor (BDNF) | Peprotech | 450-02 | |
| Centrifuge | Thermo Scientific | Sorvall Legend X1R/ 75004261 | |
| Coverslips | Chemiglass Life Sciences | 1760-012 | |
| Cyclic AMP (cAMP) | Sigma-Aldrich | D0627 | |
| Dispase | Gibco | 17105-041 | |
| Dorsomorphin | Selleckchem | S7146 | |
| Dulbecco's modified eagle medium with F12 nutrient mixture (DMEM/F12) | Corning | 10-092-CV | |
| FBS | Gibco | 16141-002 | |
| Fibroblast growth factor 2 (FGF2, bFGF) | Peprotech | 100-18B | |
| Geltrex LDEV-Free Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix | Gibco | A1413201 | |
| Gem21 NeuroPlex Serum-Free Supplement | Gemini | 400-160 | |
| Glass Bottom Dishes | MatTek | P35G-0.170-14-C | |
| 9'' glass pipetes | VWR | 14673-043 | |
| Glial derived neurotrophic factor (BDNF) | Sigma-Aldrich | D0627 | |
| GlutaMAX-I | Gibco | 35050-061 | |
| Heparin | Sigma | H3149 | |
| Insulin growth factor 1 (IGF1) | Invitrogen | M7512 | |
| Knockout Serum Replacer | Gibco | A31815 | |
| Laminin | Sigma | L-6274 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma | M3148-100ML | |
| MitoTracker CMXRos | Invitrogen | M7512 | |
| Neurobasal medium | Gibco | 21103-049 | |
| Non Essential Amino Acids | Gibco | 11140-050 | |
| N2 NeuroPle Serum-Free Supplement | Gemini | 400-163 | |
| Olympus microscope IX83 | Olympus | IX83-ZDC2 | |
| PBS | Corning | 21-031-CV | |
| Phase contrast microscope | Olympus | CKX41/ IX2-SLP | |
| 6 well plates | Corning | 353046 | |
| 24 well plates | Corning | 353047 | |
| Poly-L-ornithine hydrobromide (polyornithine)) | Sigma-Aldrich | P3655 | |
| SB431542 | Stemgent | 04-0010 | |
| Sterile 50ml Disposable Vacuum Filtration System 0.22 μm Millipore Express® Plus Membrane | Millipore | SCGP00525 | |
| Stericup 500/1000 ml Durapore 0.22 μM PVDF | Millipore | SCGVU10RE | |
| Tbr1 antibody (1:2000) | Chemicon | AB9616 | |
| Trypsin inhibitor | Gibco | 17075029 | |
| 50 ml tubes | Phenix | SS-PH50R | |
| 15 ml tubes | Phenix | SS-PH15R | |
| T25 flasks (untreated) | VWR | 10861-572 | |
| Plugins for softwares | |||
| Bio-formats Package | http://downloads.openmicroscopy.org/bio-formats/5.1.0/ | ||
| Fiji software | https://fiji.sc/ | ||
| Kymograph Plugin | https://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html | ||
| MultipleKymograph.class | https://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html | ||
| MultipleOverlay.class | https://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html | ||
| WalkingAverage.class | https://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html | ||
| StackDifference.class | https://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html | ||
| Straighten_.jar | https://imagej.nih.gov/ij/plugins/straighten.html | ||
| tsp050706.txt | https://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html |
References
- Brown, A. Axonal transport of membranous and nonmembranous cargoes: a unified perspective. Journal of Cell Biology. 160 (6), 817-821 (2003).
- Morris, R. L., Hollenbeck, P. J. Axonal transport of mitochondria along microtubules and F-actin in living vertebrate neurons. The Journal of Cell Biology. 131 (5), 1315-1326 (1995).
- Schwarz, T. L.
- Magrane, J., Cortez, C., Gan, W. B., Manfredi, G. Abnormal mitochondrial transport and morphology are common pathological denominators in SOD1 and TDP43 ALS mouse models. Human Molecular Genetics. 23 (6), 1413-1424 (2014).
- Alami, N. H., et al. Axonal transport of TDP-43 mRNA granules is impaired by ALS-causing mutations. Neuron. 81 (3), 536-543 (2014).
- Wang, X., Schwarz, T. L.
- Course, M. M., et al. Live Imaging Mitochondrial Transport in Neurons. Neuromethods. 123, 49-66 (2017).
- Chazotte, B. Labeling mitochondria with fluorescent dyes for imaging. Cold Spring Harbor Protocols. 2009 (6), 4948 (2009).
- Meijering, E., Dzyubachyk, O., Smal, I. Methods for cell and particle tracking. Methods in Enzymology. 504, 183-200 (2012).
- Bros, H., Hauser, A., Paul, F., Niesner, R., Infante-Duarte, C. Assessing Mitochondrial Movement Within Neurons: Manual Versus Automated Tracking Methods. Traffic. 16 (8), 906-917 (2015).
- Rietdorf, J. http://www.embl.de/eamnet/html/kymograph.html. , Available from: http://www.embl.de/eamnet/html/kymograph.html (2015).
- Calkins, M. J., Manczak, M., Mao, P., Shirendeb, U., Reddy, P. H. Impaired mitochondrial biogenesis, defective axonal transport of mitochondria, abnormal mitochondrial dynamics and synaptic degeneration in a mouse model of Alzheimer's disease. Human Molecular Genetics. 20 (23), 4515-4529 (2011).
- Denton, K., et al. Impaired mitochondrial dynamics underlie axonal defects in hereditary spastic paraplegias. Human Molecular Genetics. 27 (14), 2517-2530 (2018).
- Kim-Han, J. S., Antenor-Dorsey, J. A., O'Malley, K. L. The parkinsonian mimetic, MPP+, specifically impairs mitochondrial transport in dopamine axons. Journal of Neuroscience. 31 (19), 7212-7221 (2011).
- Shirendeb, U. P., et al. Mutant huntingtin's interaction with mitochondrial protein Drp1 impairs mitochondrial biogenesis and causes defective axonal transport and synaptic degeneration in Huntington's disease. Human Molecular Genetics. 21 (2), 406-420 (2012).
- Lo Giudice, T., Lombardi, F., Santorelli, F. M., Kawarai, T., Orlacchio, A. Hereditary spastic paraplegia: clinical-genetic characteristics and evolving molecular mechanisms. Experimental Neurology. 261, 518-539 (2014).
- Blackstone, C. Cellular pathways of hereditary spastic paraplegia. Annual Review of Neuroscience. 35, 25-47 (2012).
- Boisvert, E. M., Denton, K., Lei, L., Li, X. J. The specification of telencephalic glutamatergic neurons from human pluripotent stem cells. Journal of Visualized Experiments. (74), e50321 (2013).
- Zhu, P. P., Denton, K. R., Pierson, T. M., Li, X. J., Blackstone, C. Pharmacologic rescue of axon growth defects in a human iPSC model of hereditary spastic paraplegia SPG3A. Human Molecular Genetics. 23 (21), 5638-5648 (2014).
- Marra, M. H., Tobias, Z. J., Cohen, H. R., Glover, G., Weissman, T. A. In Vivo Time-Lapse Imaging in the Zebrafish Lateral Line: A Flexible, Open-Ended Research Project for an Undergraduate Neurobiology Laboratory Course. Journal of Undergraduate Neuroscience Education. 13 (3), 215-224 (2015).
- Kang, J. S., et al. Docking of axonal mitochondria by syntaphilin controls their mobility and affects short-term facilitation. Cell. 132 (1), 137-148 (2008).
- Mou, Y., Li, X. J. Rescue axonal defects by targeting mitochondrial dynamics in hereditary spastic paraplegias. Neural Regeneration Research. 14 (4), 574-577 (2019).
- Huang, S., et al. New photostable naphthalimide-based fluorescent probe for mitochondrial imaging and tracking. Biosensors & Bioelectronics. 71, 313-321 (2015).
- Carvalho, P. H., et al. Designed benzothiadiazole fluorophores for selective mitochondrial imaging and dynamics. Chemistry. 20 (47), 15360-15374 (2014).
- Yamakoshi, H., et al. A sensitive and specific Raman probe based on bisarylbutadiyne for live cell imaging of mitochondria. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 25 (3), 664-667 (2015).
- Neumann, S., Chassefeyre, R., Campbell, G. E., Encalada, S. E. KymoAnalyzer: a software tool for the quantitative analysis of intracellular transport in neurons. Traffic. 18 (1), 71-88 (2017).
- Chen, M., et al. A new method for quantifying mitochondrial axonal transport. Protein & Cell. 7 (11), 804-819 (2016).
- De Vos, K. J., Sheetz, M. P. Visualization and quantification of mitochondrial dynamics in living animal cells. Methods in Cell Biology. 80, 627-682 (2007).
- Denton, K. R., Xu, C. C., Li, X. J. Modeling Axonal Phenotypes with Human Pluripotent Stem Cells. Methods in Molecular Biology. 1353, 309-321 (2016).
- Andrews, S., Gilley, J., Coleman, M. P. Difference Tracker: ImageJ plugins for fully automated analysis of multiple axonal transport parameters. Journal of Neuroscience Methods. 193 (2), 281-287 (2010).
- Reis, G. F., et al. Molecular motor function in axonal transport in vivo probed by genetic and computational analysis in Drosophila. Molecular Biology of the Cell. 23 (9), 1700-1714 (2012).
- Broeke, J. H., et al. Automated quantification of cellular traffic in living cells. Journal of Neuroscience Methods. 178 (2), 378-384 (2009).
- Welzel, O., Knorr, J., Stroebel, A. M., Kornhuber, J., Groemer, T. W. A fast and robust method for automated analysis of axonal transport. European Biophysics Journal : EBJ. 40 (9), 1061-1069 (2011).
- Mukherjee, A., et al. Automated kymograph analysis for profiling axonal transport of secretory granules. Medical Image Analysis. 15 (3), 354-367 (2011).
- Klionsky, D. J., et al. Guidelines for the use and interpretation of assays monitoring autophagy. Autophagy. 12, 1 (2016).
- Metivier, D., et al. Cytofluorometric detection of mitochondrial alterations in early CD95/Fas/APO-1-triggered apoptosis of Jurkat T lymphoma cells. Comparison of seven mitochondrion-specific fluorochromes. Immunology Letters. 61 (2-3), 157-163 (1998).
- Scaduto, R. C., Grotyohann, L. W. Measurement of mitochondrial membrane potential using fluorescent rhodamine derivatives. Biophysical Journal. 76, Pt 1 469-477 (1999).
- Liu, X., Yang, L., Long, Q., Weaver, D., Hajnoczky, G. Choosing proper fluorescent dyes, proteins, and imaging techniques to study mitochondrial dynamics in mammalian cells. Biophysics Reports. 3 (4), 64-72 (2017).
- Zhou, B., Lin, M. Y., Sun, T., Knight, A. L., Sheng, Z. H.
