Summary
손상된 미토콘드리아 수송 및 형태는 각종 신경 퇴행성 질환에 관여합니다. 제시된 프로토콜은 유전 경직 성 하반신 마비에서 미토콘드리아 수송 및 형태를 평가하기 위해 유도 된 다능성 줄기 세포 유래 전뇌 뉴런을 사용합니다. 이 프로토콜은 축축을 따라 미토콘드리아 인신 매매의 특성화와 신경 퇴행성 질환의 연구를 용이하게하는 형태학의 분석을 허용합니다.
Abstract
뉴런은 그들의 기능을 지원 하기 위해 높은 에너지에 대 한 강렬한 요구. 축 세포를 따라 손상 된 미토 콘 드리 아 수송 인간의 신경에서 관찰 되었습니다., 다양 한 질병 상태에서 신경 변성에 기여할 수 있는. 살아있는 인간 신경에 있는 미토콘드리아 역학을 검토하는 것은 도전적이더라도, 그 같은 패러다임은 신경 변성에서 미토콘드리아의 역할을 공부하기 를 위해 중요합니다. 여기서 기재된 것은 인간 유도 만능 줄기 세포(iPSCs)로부터 유래된 전뇌 뉴런 축에서 미토콘드리아 수송 및 미토콘드리아 형태를 분석하기 위한 프로토콜이다. iPSCs는 잘 확립된 방법을 사용하여 텔렌세팔산 글루탐생성 뉴런으로 분화됩니다. 뉴런의 미토콘드리아는 미토트래커 CMXRos로 염색되고, 축색내미토콘드리아 운동은 세포 배양을 위한 인큐베이터가 장착된 살아있는 세포 이미징 현미경을 사용하여 포획된다. 시간 경과 이미지는 "MultiKymograph", "바이오 포맷 수입기", "매크로"플러그인소프트웨어를 사용하여 분석됩니다. 미토콘드리아 수송의 척추 그래프가 생성되고, 전위 및 역행 방향의 평균 미토콘드리아 속도가 kymograph에서 읽습니다. 미토콘드리아 형태 분석에 관해서는, 미토콘드리아 길이, 면적 및 종횡비는 ImageJ를 사용하여 얻어진다. 요약하면,이 프로토콜은 축삭을 따라 미토콘드리아 인신 매매의 특성화및 신경 퇴행성 질환의 연구를 용이하게하기 위해 자신의 형태학의 분석을 할 수 있습니다.
Introduction
미토콘드리아 운동성 및 분포는 편광 뉴런의 가변적이고 전문적인 에너지 요구를 충족시키는 데 중요한 역할을 합니다. 뉴런은 Ca2+ 버퍼링 및 이온 전류에 대한 높은 수준의 에너지를 요구하는 시냅스의 형성을 통해 표적과 연결하기 위해 매우 긴 축세포를 확장할 수 있습니다. 소마에서 축종으로미토콘드리아를 운반하는 것은 뉴런의 축축및 시냅스 기능을 지원하는 데 매우 중요합니다. 공간적 및 시간적으로 동적 미토콘드리아 운동은 초당 수 마이크로미터의 속도로 빠른 축색 수송에 의해 수행됩니다1.
구체적으로, 운동 또는 어댑터 단백질, 예컨대 키네신 및 다인, 미토콘드리아2,3의움직임을 조절하기 위해 마이크로소튜플을 따라 빠른 소기관 수송에 참여한다. 정상적인 신경 활동은 뉴런 소마에서 말단 축종 (전방 축색 수송)으로 새로 조립 된 미토콘드리아의 적절한 수송을 필요로하고 원위 축사에서 다시 세포체로 미토콘드리아의 역수송 (역행 수송). 최근 연구에 따르면 부적절한 미토콘드리아 할당은 신경 성 결함 및 운동 신경 퇴행성 질환4,5와강하게 연관되어 있음을 나타냈다. 따라서, 신경 변성에서 미토콘드리아의 역할을 해부하기 위해, 살아있는 문화에서 축색을 따라 미토콘드리아 운동을 검사하는 방법을 확립하는 것이 중요합니다.
미토콘드리아의 추적을 검사하고 분석하는 데는 두 가지 주요 과제가 있습니다: (1) 모든 프레임의 배경에서 미토콘드리아를 식별하고, (2) 모든 프레임 간의 연결을 분석하고 생성합니다. 제1 과제를 해결하기 위해, 형광 표지 접근법은 미토콘드리아염 또는 형광 융합 미토콘드리아 표적단백질(예를 들어, 미토콘드리아 표적화 단백질)의 형광-융합 미토콘드리아 표적화 단백질(예를 들어, 미토-GFP)의 백질과 같은 배경으로부터 미토콘드리아를 구별하기 위해 널리 사용된다(예를 들어, 미토콘드리아 표적화)6,7,8. 프레임 간의 연관성을 분석하기 위해 이전 연구9에서여러 알고리즘 및 소프트웨어 도구가 설명되었습니다. 최근 논문에서 연구원들은 4개의 다른 자동화 도구(예: Volocity, Imaris, wrMTrck 및 차이 추적기)를 비교하여 미토콘드리아 수송을 정량화했습니다. 결과는 트랙 길이, 미토콘드리아 변위, 이동 지속 시간 및 속도의 불일치에도 불구하고, 이러한 자동화된 도구는 치료 후 수송 차이를 평가하기에 적합하다는 것을 보여주었다10. 이러한 도구 외에도 ImageJ용 통합 플러그인 "매크로"(Rietdorf 및 Seitz가 작성)는 미토콘드리아전송(11)을분석하는 데 널리 사용되어 왔다. 이 방법은 미토콘드리아 운동을 분석하는 데 사용할 수있는 척추 그래프를 생성, 전위 및 역행 방향 모두에서 속도를 포함.
미토콘드리아는 생리적 및 병리학적 조건에 반응하여 수와 형태학이 끊임없이 변화하는 매우 역동적인 세포기관입니다. 미토콘드리아 분열과 융합은 미토콘드리아 형태와 항상성을 엄격하게 조절합니다. 미토콘드리아 핵분열과 융합 사이의 불균형은 미토콘드리아 기능을 손상시키고 비정상적인 신경 활동과 신경 변성을 초래할 수 있는 매우 짧거나 긴 미토콘드리아 네트워크를 유도할 수 있습니다. 미토콘드리아 수송 및 형태학 장애는 알츠하이머병, 파킨슨병, 헌팅턴병, 유전적 경련 하반신마비(HSP)12,13,14,15와 같은 다양한 신경퇴행성 질환에 관여한다. HSP는 코르티코척추의 변성 및 하반신 근육을 조절하는 후속 실패를 특징으로 하는 상속된 신경 장애의 이질적인그룹(16,17)이다. 이 연구에서는, iPSC 파생 된 전뇌 뉴런은 HSP에서 미토콘드리아 수송 및 형태를 평가하는 데 사용됩니다. 이 방법은 살아있는 문화에서 뉴런 축색의 미토콘드리아 역학을 검사하기위한 독특한 패러다임을 제공합니다.
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Protocol
1. iPSCs에서 텔렌세팔성 글루타마티터지뉴런 생성
참고: iPSCs를 유지하기 위한 상세한 프로토콜과 텔렌세팔산 글루탐매터기뉴런으로의 분화는 앞서설명한 18과유사하다. 여기서, 인간 다능성 줄기 세포의 분화 동안 중요한 과정이 도입되고 강조된다.
- 마우스 배아 섬유아세포(MEF) 피더에 대한 배양 iPSCs는 인간 배아 줄기 세포(hESC) 배지에서 섬유아세포 성장 인자(bFGF, 4 ng/mL)로 보충하였다.
- 디스파스 (1 mg / mL)로 배양 한 후 3 분 동안 iPSCs를 작은 덩어리로 해리하십시오. 이어서, 4일 동안 hESC 배지에서 iPSC 응집체를 현탁액으로 배양한다. iPSC가 서스펜션 문화로 시작되는 경우 1일차(D1)를 참조하십시오. 매일 4일 동안 매체를 변경합니다.
- D5에서, 원심분리 후 iPSC 응집체를 200 x g에서 2분 동안 수집하고 3일 동안 신경 유도 배지(NIM)에서 배양한다. 세포 응집체를 3일 동안 현탁액으로 배양하여 배지의 절반을 2일마다 변경한다. 신경 유도 효율을 높이기 위해 NIM 배지에 DMH-1(2 μM) 및 SB431542(2 μM)를 추가합니다.
- D8에서 원심분리 후 iPSC 응집체를 2분 동안 200 x g으로 수집하고 10% FBS(또는 라미닌 코팅 플레이트)로 NIM에서 밤새 배양하여 6개의 웰 플레이트(플레이트당 약 20-30개의 응집체)를 부착하게 합니다. 다음 날에 이전 매체를 제거하고 D17까지 2일마다 NIM으로 변경합니다.
참고 : 로제트 구조가있는 기둥 세포의 형성으로 표시되는 신경 상피 세포의 생성이이 기간에 관찰됩니다. - D17에서 콜로니 의 중심에있는 신경 상피 세포를 기계적으로 분리 (식민지의 중심에 작은 압력을 가하여 직접 리프팅) 또는 효소 (디스파스로 처리). B27 (1x), cAMP (1 μM), 및 IGF (10 ng/mL)를 첨가하여 NIM의 8 mL을 함유하는 비처리 된 조직 배양 T25 플라스크에 분리 된 신경 상피 세포를 전송합니다.
참고 : 현탁액 배양은 세포가 피질 투영 신경 전구로 농축 된 신경 구를 형성 할 수 있게합니다. - D35 후, 폴리 오르니틴 및 LDEV-무성장 인자 지하 막매트릭스(재료표)에신경구를 플레이트-코팅된 35 mm 유리 바닥 접시는 말순뇌성 글루탐매터지 뉴런(피질 프로젝션 뉴런)을 생성한다. 도금 전에 37°C에서 2분 동안 1 mg/mL 세포 분리 용액으로 배양하여 신경구를 작은 클러스터로 해리합니다.
- 원심분리에 의해 세포 분리 용액을 제거하고 신경 분화 배지 (NDM)의 1 mL에서 다시 중단하십시오. 유리 바닥 접시에 플레이트 셀 (접시 당 매체의 100 μL에 약 5 개의 클러스터) 그들을 부착 할 수 있습니다. 이어서, NDM(접시당 1 mL)을 추가하고 B27(1x), cAMP(1 μM), IGF(10 ng/mL), hBDNF(10 ng/mL), 및 GDNF(10 ng/mL)를 함유하는 NDM에서 세포를 배양한다.
참고 : 작은 클러스터는 잘 생존하고 긴 프로젝션 뉴런을 초래하기 때문에 도금됩니다. 대안적으로, 세포는 더 나은 분리를 위해 접시 당 약 20,000 개의 세포 주위의 밀도로 해리되고 도금 될 수 있습니다. - Tbr1 및 βIII-tubulin 마커를 면역으로 염색함으로써 텔렌세팔산 글루타마테르기성 뉴런을 특성화한다.
2. 텔렌세팔산 글루타마이터뉴런의 축색을 따라 미토콘드리아 수송 검사
- NDM을 예열하고 37°C 및 5%CO2로설정된 형광 현미경에 대한 인큐베이터를 켭니다.
- 전뇌 뉴런의 축색을 따라 미토콘드리아를 시각화하려면 50 nM 적색 형광 염료로 뉴런을 배양하여 살아있는 세포에서 미토콘드리아(예: 미토트래커 CMXRos)를 37°C에서 3분 동안 NDM에 염색합니다. 다음으로, 따뜻하게 한 NDM으로 세포를 2배 씻는다. 뉴런은 NDM에서 배양된다.
- 축색을 따라 미토콘드리아 수송을 기록하기 위해 형광 현미경으로 40x 목표를 사용하여 미토콘드리아 운동의 시간 경과 이미지를 취하십시오.
참고: 배양을 안정화하기 위해, 세포가 미토콘드리아 염색 후 20분 동안 인큐베이터에서 배양될 때 살아있는 세포 이미징을 수행한다. - 위상 필드에서 형태학적 특성에 따라 축세포를 식별합니다 (신경 세포 체에서 직접 출현, 분기없이 일정한 얇은 긴 신경 염). 미토콘드리아는 전신 (세포체에서 말단 축색으로) 및 역행 방향 (축축말단에서 세포체까지)로 이동합니다. 축축을 따라 미토콘드리아 운동의 방향을 구별하기 위해 뉴런의 세포체를 명확하게 식별하십시오. 이 단계에서는 위상 필드 아래에 축을 집중하여 광표백을 줄입니다.
- 세포 체와 축세포를 구별 한 후, 축축액에서 미토콘드리아의 노출 시간과 초점을 조정하십시오. 그런 다음 총 5 분 동안 5 초마다 축사 내에서 미토콘드리아의 수송을 캡처하여 60 프레임을 생성합니다. 각 접시에 대해 최소 5개의 위치를 무작위로 캡처하고 각 그룹에 대해 3회 반복합니다.
3. 피질 뉴런의 미토콘드리아 수송 및 형태학의 데이터 분석
참고: 이미지 분석 소프트웨어(예: ImageJ 또는 MetaMorph19)를사용하여 미토콘드리아 전송에 대해 수집된 데이터를 분석합니다. ImageJ는 쉽게 사용할 수 있기 때문에 MultiKymograph, 매크로및 분석 입자 플러그인을 사용하여 ImageJ를 사용하여 미토콘드리아 수송 및 형태분석을 수행합니다.
- ImageJ를 사용하여 미토콘드리아 수송 분석
- 미토콘드리아 운동성의 시간 경과 이미지를 캡처 한 후 MultiKymograph 플러그인을 사용하여 미토콘드리아의 속도와 움직임을 분석하십시오. 이미지는 .tiff 형식 파일로 저장되며, 이전에 보고된 방법20에따라 피지 소프트웨어에 의해 분석됩니다.
- 피지 소프트웨어를 다운로드합니다. kymographs에서 미토콘드리아 이동 속도를 분석하는 데 필요한 플러그인을 다운로드합니다. 멀티플Kymograph.class, MultipleOverlay.class, StackDifference.class 및 WalkingAverage.class (재료 표)를포함하여 이 네 가지 .class 플러그인과 함께 바이오 포맷 패키지 및 Kymograph 플러그인을 다운로드하십시오. 피지 플러그인 폴더에 이러한 파일을 이동. 플러그인 폴더에 "tsp050706.txt" 플러그인을 다운로드합니다. 파일 플러그인 폴더로 이동 하는 경우 피지 소프트웨어를 다시 시작.
- 피지 소프트웨어를 엽니다. 플러그인을선택한 다음 Bio-Formats에서 Bio-Formats 가져오기를 통해 .tiff 시리즈의 이미지를 가져옵니다. 스택 보기에서 표준 ImageJ를 선택하고 모든 시리즈 열기를선택하고 자동 크기 조정을선택한 다음 확인을클릭합니다. 이미지 상단에 표시되는 픽셀 단위로 이미지의 프레임 수와 크기를 기록해 둡을 기록합니다.
참고: 이미지당 60프레임을 찍습니다. - 모든 60프레임에 대한 이미지 메뉴에서 밝기/콘트라스트를 조정하여 이미지를 더 선명하게 만드는 것이 좋습니다.
- 선 도구를 마우스 오른쪽 단추로 클릭하여 분할된 선을 선택하고 셀 바디에서 시작하여 터미널 축슨에서 끝나는 세그먼트 선을 그립니다. 플러그인에서 MultipleKymograph를 선택하여 kymograph를 생성합니다. 다중키모그래프를선택한 후 선 너비 를 선택하라는 메시지가 표시됩니다. 이 숫자가 홀수인지 확인합니다. 선 너비에 대해 1을 선택합니다. 이 단계 이후에 kymograph가 생성됩니다.
참고 : 정보의 몇 가지 중요한 조각은 kymograph에서 읽을 수 있습니다. kymograph의 y축은 60프레임의 지속 시간(5분)입니다. x축은 선택한 축축의 위치를 나타냅니다. - kymograph에서 대각선을 사용하여 미토콘드리아의 이동 방향(전방, 역행 또는 안정)을 결정합니다. 예를 들어 y축을 따라 오른쪽으로 내려가는 선은 전방 이동을 나타내고 y축을 따라 왼쪽으로 내려가는 선은 역행 운동을 나타냅니다. 수직 선은 미토콘드리아에 움직임이 없음을 나타냅니다.
- 피지 소프트웨어의 매크로 플러그인을 사용하여 이동 미토콘드리아의 거리, 시간 값 및 속도를 측정합니다. 플러그인으로 이동 | 매크로 | 설치 | tsp050607.txt. kymograph에 미토콘드리아 운동의 흔적 위에 분할 된 선을 그리고 항상 열등한 영역 (y 축)에 우수한선을 그립니다.
- 선을 그린 후 플러그인으로 이동 | 매크로 | tsp에서 속도를 읽습니다. 추적을 따라 분할된 선이 그려지므로 플러그인은 선에 해당하는 분할된 속도를 읽습니다.
참고: 모든 데이터의 단위는 픽셀입니다. dy sum은 시작점에서 소비되는 시간이며, dx 합계는 x축에서 이동하는 미토콘드리아의 거리를 나타낸다. dy 지금 및 dx는 이제 각각 모든 세그먼트에 대한 기간 시간 및 이동 거리를 보여줍니다. 실제 속도는 모든 세그먼트 (DX 지금 / 지금 다이)에 대한 속도를 보여줍니다. 평균 속도는 미토콘드리아 이동(dx 합계/dy 합계)의 평균 속도를 나타냅니다. - 축척 막대를 측정하여 픽셀 단위로 μm단위로 dx 단위를 변경합니다. 이미지의 눈금 막대를 측정하여 픽셀에서 μm까지의 거리를 위해 장치를 변환합니다. 선 도구를 사용하여 축척 막대를 따라 선을 그리고 "분석"에서 측정값을선택하여 선의 길이를 측정합니다. 이 실험에서 시간을 픽셀에서 초로 1픽셀 = 5초로 변경합니다.
- 스프레드시트 파일에서 평균 속도를 계산하고 그에 따라 역행 또는 전위행 이동에 레이블을 지정합니다. 평균 전위 또는 역행 이동 속도.
- kymograph에서 고정 및 운동성 미토콘드리아의 백분율을 결정합니다. 전위 또는 역행 이동 미토콘드리아는 전체 기간21동안 기원으로부터 5 μm 앞뒤로 이동하는 것으로 정의된다. 미토콘드리아는 5분 동안 5 μm 이상 움직이지 않으면 고정된 것으로 간주됩니다.
- ImageJ를 이용한 미토콘드리아 형태 분석
참고: ImageJ를 사용하여 미토콘드리아 길이, 면적 및 종횡비를 측정하여 미토콘드리아 형태를 결정합니다. 이렇게 하려면 아래 단계를 따르십시오.- 축색내미토콘드리아 길이와 면적을 분석하려면 ImageJ 웹 사이트에서 Straighten_.jar 플러그인을 다운로드하여 플러그인 폴더로 이동합니다. ImageJ 소프트웨어를 다시 시작합니다.
- 파일 아래의 열린 기능을 통해 그림을 열고 이미지아래의 유형을 사용하여 32 비트 이미지를 8 비트로 변환합니다.
- 축색을 따라 분할된 선을 그립니다. 플러그인에서 똑바르게 선택하고 필라멘트/와이드 라인의 너비에대해 50픽셀을 설정합니다. 이렇게 하면 곧게 펴진 축색이 생성됩니다.
- 이미지 아래의 임계값을 조정하고 "영역 | 을 선택하여 분석 에서 측정을 설정합니다. 경계 | 타원 맞추기 | 셰이프 설명자.
- 선 함수를 사용하여 축척 막대를 측정하고 거리,알고 거리및 길이 단위로 거리를 작성하여 분석 에서 축척을설정합니다. 그런 다음 전역을 선택하여 이 축척 설정을 설정합니다.
- 분석 아래에 있는 파티클 분석을 사용하여 면적을 결정합니다. 프롬프트 매개변수는 크기(pixel^2) = 0.20-무한대, 원형 = 0.00-1.00, 표시 = 타원입니다. 결과 표시를 선택합니다.
참고: 측정은 면적, 둘레, 길이(전공), 폭(경미한), 종횡비(AR)를 포함한 여러 미토콘드리아 형태 파라미터의 결과를 산출합니다. 상응하는 미토콘드리아 번호도 나열됩니다. - 축색 길이로 나눈 미토콘드리아 수를 사용하여 축색당 미토콘드리아 수를 계산합니다( μm).
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Representative Results
여기서, 인간 iPSCs는 텔렌세팔산 글루타마티터지뉴런으로 분화되었고, 이는 Tbr1 및 βIII 튜불린 마커로 면역염색을 특징으로하였다(도 1A). 미토콘드리아의 축색 수송을 검사하기 위해, 이들 세포는 적색 형광 염료로 염색되었고, 시간 경과 이미징을 수행하였다. ImageJ는 쉽게 사용할 수 있고 쉽게 얻을 수 있기 때문에, 미토콘드리아 수송은 그림 1에도시된 "MultiKymograph" 및 "매크로" ImageJ 플러그인으로 추가로 분석되었다.
정적, 전방 및 역행 운동을 포함하여 미토콘드리아 운동의 3개의 각각 상태가 있습니다(그림 1B,C). 단일 미토콘드리온은 축색 내의 전방 또는 역행 방향으로 정적 또는 이동을 유지할 수 있으며, 여기서, 미토콘드리아 운동의 트랙을 따라 분할된 선이 그려져 속도를 결정한다(도1D). 축색을 따라 미토콘드리아 운동의 속도는 그림 1E에 도시되어 있으며 ImageJ에서 "매크로"로 읽은 후 그림 1D의 분할 된 선에 해당합니다. MetaMorph 소프트웨어와 유사하게, ImageJ는 ImageJ에 의해 생성된 kymograph에 기초하여 운동성 미토콘드리아의 미토콘드리아 속도 및 백분율을 결정하는데 사용될 수있다(그림 1F). 시판되는 분석 소프트웨어(예를 들어, MetaMorph)를 사용하여, 이전 데이터는 SPG3A 뉴런에서 정상 뉴런에 비해 운동성 미토콘드리아의 백분율이 현저히 감소한 반면 속도는19로변경되지 않은 것으로 나타났다. ImageJ 소프트웨어를 평가하기 위해, 운동성 미토콘드리아의 백분율을 조사하고, SPG3A 뉴런에서 운동성 미토콘드리아의 백분율이 야생형(WT) 뉴런을 대조하는 것과 비교하여 유사한 감소를 관찰하였다(도1G).
미토콘드리아 형태에 대한 분석에 관해서는, 미토콘드리아 영역, 길이 및 AR을 ImageJ의 "입자 분석" 기능을 사용하여 분석하였다. 축색은 "곧게"플러그인을 사용하여 곧게했다(그림 2A, B). 미토콘드리아는 임계값을 조정하여 명확하게선택하였다(도 2C,D). 마지막으로, 미토콘드리아 영역, 길이(전공), 폭(minor), 종횡비 및 둘레는 "입자 분석" 플러그인을 사용하여 곧게 펴진 축색으로부터 수득되었다(도2E,F). 비정상적인 미토콘드리아 형태는 SPG15 세포를 포함하는 HSP iPSC 유래 텔렌세말릭 글루탐매터지 뉴런에서 관찰되었다(도2G, H,I)13,22. 미토콘드리아 길이 및 종횡비 둘 다 대조군 WT 뉴런 축에 비해 SPG15 뉴런 축에서 유의하게 감소하였다(도2G, H, I).
그림 1: ImageJ를 사용한 미토콘드리아 수송 분석. (A)면역 염색은 텔렌세팔릭 글루타마테르기뉴런의 생성을 나타낸다. Tbr1 (빨강), βIII 튜불린 (녹색), 그리고 Hoechst (파란색). 배율 막대 = 50 μm. 이 수치는 이전 연구19에서수정되었습니다. (B)뉴런의 축색 내 미토콘드리아 수송. 전신 미토콘드리아 운동은 세포체에서 말단 축으로 이동하는 미토콘드리아로 정의되며, 역행미토콘드리아 운동은 원위 축에서 유래하고 뉴런 세포체로 확장된다. 세그먼트 선은 신경 세포 체에서 말단 말단에 축삭을 따라 그려집니다 kymographs를 생성하기 위하여. (C)키모그래피는 ImageJ를 사용하여 생성됩니다. x축은 축축위치이고 y축은 시간입니다. 하나의 연속 흰색 선은 미토콘드리션이 전방 방향(분홍색 화살표헤드), 역행 방향(파란색 화살표촉) 또는 정적 상태(노란색 화살표머리)로 이동하는 것입니다. (D)매크로 플러그인을 사용하여 속도를 읽기 위해 분할된 선이 그려집니다. 숫자 1-8은 줄의 세그먼트를 설명합니다. 전방 운동(1-4, 6, 8) 및 정적 상태(5, 7)는 이러한 확대된 키모그래피와 구별될 수 있다. (E)각 세그먼트의 시간 및 이동 거리, 실제 및 평균 속도(픽셀 단위)입니다. (F)ImageJ를 사용하여 WT 및 SPG3A 피질 PN에 대한 미토콘드리아 수송의 Kymograph. 스케일 바 = 10 μm. (G) 이미지J를 사용하여 WT 및 SPG3A 피질 PN의 운동성 미토콘드리아 비율 (*p & 0.05). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: ImageJ를 사용하여 미토콘드리아 형태를 분석합니다. (A)축을 곧게 하기 위한 매개변수입니다. (B)대표직선 축을 곧게 펴. (C,D) 미토콘드리아를 선택하는 임계값의 조정. (E,F) 측정된 미토콘드리아 영역, 둘레, 길이(major), 폭(minor), 및 종횡비(AR)는 선택된 미토콘드리아(E)에 대응한다. (G)WT 및 SPG15 텔렌세팔산 글루타마이터리 뉴런에서 미토콘드리아의 대표적인 사진. 배율 막대 = WT 및 SPG15 뉴런의 미토콘드리아 길이 = 20 μm.(H) (I)WT 및 SPG15 뉴런에서 미토콘드리아의 종횡비. **p < 0.01 vs. WT. (G), (H) 및 (I)는 이전 연구13에서수정된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 형광 공구 | 장점 | 단점 | 참조 |
| 미토트래커 | 미토트래커는 미토콘드리아 전위독립적이며, 자가포골재 또는 리소좀으로 미토콘드리아의 국소화를 분석하는데 사용될 수 있다. | MitoTracker는 장기 연구를 위해 충분히 포토포불안정하지 않습니다. | 35 |
| NPA-TPP | 이 염료는 새로운 광안정 미토콘드리아 라벨링 시약이다. | 이 염료의 합성 및 정제 과정은 시간과 비용이 많이 듭니다. | 23 |
| 미토바디 | 이 염료는 높은 감도와 특이성을 가진 라만 현미경 검사법을 사용하여 미토콘드리아 시각화를 위해 사용될 수 있습니다. | 이 염료를 사용하려면 라만 현미경이 필요합니다. | 25 |
| TMRE | 이 염료는 낮은 농도와 담금질 효과가없는 비 독성, 특정 미토콘드리아 염색 염료입니다. | TMRE 라벨 미토콘드리아 미토 콘 드리 아 전위에 따라 달라 집니다. | 36, 37 |
| 미토콘드리아 표적 형광 단백질 | 미토콘드리아 표적 형광 단백질은 보다 특이하고 안정적입니다. | 이 방법은 형질전환과 형질전환 효율이 다른 세포 유형에 대해 다르다. | 38, 39 |
표 1: 미토콘드리아 라벨링을 위한 일부 형광 도구의 장점과 단점.
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Discussion
이 기사에서는 적색 형광 염료 및 ImageJ 소프트웨어를 사용하여 뉴런 축색의 미토콘드리아 수송 및 형태를 분석하는 방법을 설명하며, 둘 다 신경 퇴행성 질환에서 축사 변성 및 미토콘드리아 형태를 연구하는 독특한 플랫폼을 제공합니다. 프로토콜에는 미토콘드리아의 염색, 살아있는 세포 화상 진찰 및 심상 분석을 포함하여 몇몇 중요한 단계가 있습니다. 이 방법에서는, 형광 염료를 미토콘드리아를 염색하는데 사용되었다. 인간의 iPSC 유래 뉴런은 접시에서 쉽게 분리되기 때문에 접시에 몇 가지 용액을 남기고 신경 기저 배지를 부드럽게 추가하는 것이 중요합니다. 세척은 염료를 제거하기 위해 서너 번 수행 될 수있다. 또한, 미토콘드리아는 다른 기자들과 함께 표지되어 형광 단백질과 같은 축슨을 따라 그들의 수송을 측정할 수 있으며, 미토콘드리아 표적화 단백질6. 장기 추적에서, 여러 프로브(즉, NPA-TPP, 2,1,3-벤조티아디아졸[BTD] 형광 유도체 및 특정 라만 프로브)는 장기 미토콘드리아 추적 및 미토콘드리아 역학 분석23,24,25에서큰 잠재력을 보였다. 다양한 프로브의 장점과 단점은 표 1에서찾을 수 있습니다.
미토콘드리아 염색 후, 라이브 세포 이미징은 인큐베이터가 장착된 현미경을 사용하여 수행됩니다. 이미징 중에 뉴런을 효과적으로 집중시키기 위해 신경 샘플은 5%CO2를 가진 37°C 인큐베이터에 보관되어야 하며 적어도 15분 동안 습한 환경에서 유지되어야 합니다. 초점이 다른 효과를 최소화하기 위해 다른 Z 위치의 이미지를 촬영하여 Z 스택을 만들거나 자동 초점 기능을 활용할 수 있습니다. 중요한 것은, 미토콘드리아 수송의 방향을 확인하기 위하여 (anterograde 또는 역행), 위상 심상은 신경 세포 바디 및 축세포를 구별하기 위하여 취합니다. 또 다른 중요한 문제는 효율적인 미토콘드리아 수송 시간 경과 이미지를 얻기 위해 방지해야 하는 형광 샘플의 광표백입니다. 광표백을 최소화하는 효과적인 방법은 접안 렌즈를 통해 샘플을 집중하고 노출 시간을 제외하고 위상 채널 아래에 모든 이미징 매개 변수를 설정하는 것입니다. 또한 자동 스케일링 패턴은 형광 표백을 줄일 수 있습니다.
미토콘드리아는 매우 역동적인 세포기관이며, 전위 및 역행 방향 모두에서 이동할 수 있습니다. 뉴런에서, 축색내의 몇몇 미토콘드리아는 기록 도중 정지하게 머무릅니다. 움직이는 미토콘드리아 중, 운동 상태는 시간이 지남에 따라 다를 수 있습니다. 이 현상은 미토콘드리아 유형이 고정 또는 이동으로 간주되는 중요한 질문을 제기합니다. 이는 미토콘드리아 축색 수송 분석 중에 임계값을 설정하여 해결할 수 있습니다. 정적 미토콘드리아를 구별하기 위해, 노이만 등은 시간 동안 위치 좌표의 평균으로 정의되는 미토콘드리아 트랙 센터를 사용한 다음, 그 트랙 중심으로부터 미토콘드리션의 최대 편차 거리가 첫 번째프레임(26)에있도록 임계값을 350 nm/s로 설정한다. 또 다른 연구에서는, 저자는 이동 상태27에서고정 상태를 구별하기 위해 임계 값으로 50 nm /s를 설정합니다. 300 nm/s 임계값은 이전 보고서28,29에서수행된 것과 같이 미세관 기반 수송을 구별하기 위해 여기에 사용되었다. 고정 및 이동 미토콘드리아에 대 한 임계값은 다르지만, 임계값을 설정 야생 형 및 퇴행 성 뉴런 사이 축 축 내 미토 콘 드리 아 운동에 중요 한 상대 정보를 제공할 수 있습니다.
미토콘드리아 수송 분석을 관련시키는 대부분의 프로토콜은 시간 대 위치의 2차원 표현인 kymograms를 이용했습니다. 입자 추적26,30,31,32,33,34의분석을 위해 여러 개의 자동화 된 도구가 개발되었습니다. 이들은 정확하게 각 프레임을 분리할 수 있습니다. ImageJ가 측정할 수 있는 속도 및 운동량 백분율 외에도 이 방법은 운동성 이벤트를 정확하게 측정할 수 있습니다. 그러나, 이들은 무료로 사용할 수 없습니다. 여기서, 미토콘드리아 수송의 분석은 "멀티키모그래피" 및 "매크로" 플러그인과 함께 ImageJ를 사용하여 수행되었다. 이 플러그인은 효과적으로 미토콘드리아 운동을 측정 할 수 있습니다. 이러한 플러그인의 장점은 사용의 용이성과 시간이 지남에 따라 kymographs 및 속도의 형태로 미토콘드리아 축삭 수송의 변경을 나타내는 능력입니다.
운동성 미토콘드리아는 SPG3A및 대조뉴런에서 분석되었다. 운동성 미토콘드리아의 백분율에서 유사한 감소는 축사 수송을 분석하기 위하여 ImageJ의 유용성을 확인하는 2개의 다른 분석 방법을 사용하여 관찰되었습니다. 또한, 미토콘드리아 형태는 다양한 신경 질환에서 미토콘드리아 기능 장애를 연구하기위한 중요한 판독을 제공하는 동일한 이미지 세트를 사용하여 분석 할 수 있습니다. 축 축 색 변성 및 미토 콘 드리 아 기능 장애는 일반적으로 초기 단계 동안 발생 하기 때문에, 뉴런 죽기 전에, 이 방법은 분자 경로 식별 하는 데 도움이 초기 병 리 변화를 검사 하는 데 사용할 수 있습니다 및 구조 하는 치료 신경 변성.
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Disclosures
저자는 경쟁적인 재정적 이익을 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
이 작품은 경련 하반신 마비 재단, 블레이저 재단과 NIH (R21NS109837)에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Accutase Cell Detachment Solution | Innovative Cell Technologies | AT104 | |
| Biosafety hood | Thermo Scientific | 1300 SERIES A2 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A-7906 | |
| Brain derived neurotrophic factor (BDNF) | Peprotech | 450-02 | |
| Centrifuge | Thermo Scientific | Sorvall Legend X1R/ 75004261 | |
| Coverslips | Chemiglass Life Sciences | 1760-012 | |
| Cyclic AMP (cAMP) | Sigma-Aldrich | D0627 | |
| Dispase | Gibco | 17105-041 | |
| Dorsomorphin | Selleckchem | S7146 | |
| Dulbecco's modified eagle medium with F12 nutrient mixture (DMEM/F12) | Corning | 10-092-CV | |
| FBS | Gibco | 16141-002 | |
| Fibroblast growth factor 2 (FGF2, bFGF) | Peprotech | 100-18B | |
| Geltrex LDEV-Free Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix | Gibco | A1413201 | |
| Gem21 NeuroPlex Serum-Free Supplement | Gemini | 400-160 | |
| Glass Bottom Dishes | MatTek | P35G-0.170-14-C | |
| 9'' glass pipetes | VWR | 14673-043 | |
| Glial derived neurotrophic factor (BDNF) | Sigma-Aldrich | D0627 | |
| GlutaMAX-I | Gibco | 35050-061 | |
| Heparin | Sigma | H3149 | |
| Insulin growth factor 1 (IGF1) | Invitrogen | M7512 | |
| Knockout Serum Replacer | Gibco | A31815 | |
| Laminin | Sigma | L-6274 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma | M3148-100ML | |
| MitoTracker CMXRos | Invitrogen | M7512 | |
| Neurobasal medium | Gibco | 21103-049 | |
| Non Essential Amino Acids | Gibco | 11140-050 | |
| N2 NeuroPle Serum-Free Supplement | Gemini | 400-163 | |
| Olympus microscope IX83 | Olympus | IX83-ZDC2 | |
| PBS | Corning | 21-031-CV | |
| Phase contrast microscope | Olympus | CKX41/ IX2-SLP | |
| 6 well plates | Corning | 353046 | |
| 24 well plates | Corning | 353047 | |
| Poly-L-ornithine hydrobromide (polyornithine)) | Sigma-Aldrich | P3655 | |
| SB431542 | Stemgent | 04-0010 | |
| Sterile 50ml Disposable Vacuum Filtration System 0.22 μm Millipore Express® Plus Membrane | Millipore | SCGP00525 | |
| Stericup 500/1000 ml Durapore 0.22 μM PVDF | Millipore | SCGVU10RE | |
| Tbr1 antibody (1:2000) | Chemicon | AB9616 | |
| Trypsin inhibitor | Gibco | 17075029 | |
| 50 ml tubes | Phenix | SS-PH50R | |
| 15 ml tubes | Phenix | SS-PH15R | |
| T25 flasks (untreated) | VWR | 10861-572 | |
| Plugins for softwares | |||
| Bio-formats Package | http://downloads.openmicroscopy.org/bio-formats/5.1.0/ | ||
| Fiji software | https://fiji.sc/ | ||
| Kymograph Plugin | https://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html | ||
| MultipleKymograph.class | https://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html | ||
| MultipleOverlay.class | https://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html | ||
| WalkingAverage.class | https://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html | ||
| StackDifference.class | https://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html | ||
| Straighten_.jar | https://imagej.nih.gov/ij/plugins/straighten.html | ||
| tsp050706.txt | https://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html |
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