Analyse mitokondriel transport og morfologi i Human Induceret pluripotente stamceller-afledte neuroner i arvelige spastiske paraplegi
Summary
Nedsat mitokondrielle transport og morfologi er involveret i forskellige neurodegenerative sygdomme. Den præsenterede protokol bruger inducerede pluripotente stamceller-afledte forhjernen neuroner til at vurdere mitokondrielle transport og morfologi i arvelig spastisk paraplegi. Denne protokol giver mulighed for karakterisering af mitokondriel handel langs axoner og analyse af deres morfologi, som vil lette studiet af neurodegenerative sygdomme.
Abstract
Neuroner har intense krav til høj energi for at støtte deres funktioner. Nedsat mitokondrielle transport langs axoner er blevet observeret i menneskelige neuroner, som kan bidrage til neurodegeneration i forskellige sygdomstilstande. Selv om det er udfordrende at undersøge mitokondrielle dynamik i levende menneskelige nerver, sådanne paradigmer er afgørende for at studere den rolle mitokondrier i neurodegeneration. Beskrevet her er en protokol til analyse af mitokondriel transport og mitokondriel morfologi i forhjernen neuron axoner stammer fra menneskeskabte pluripotente stamceller (iPSCs). IPSCs er differentieret i telencephalic glutamatergic neuroner ved hjælp af veletablerede metoder. Mitokondrier af neuroner er plettet med MitoTracker CMXRos, og mitokondrielle bevægelse i axoner er fanget ved hjælp af en live-celle imaging mikroskop udstyret med en kuvøse for cellekultur. Time-lapse billeder analyseres ved hjælp af software med “MultiKymograph”, “Bioformat importør”, og “Makroer” plugins. Kymographs af mitokondriel transport genereres, og gennemsnitlig mitokondriel hastighed i anterograde og retrograd retninger læses fra kymografen. Med hensyn til mitokondriel morfologi analyse, mitokondriel længde, område, og billedformat opnås ved hjælp af ImageJ. Sammenfattende giver denne protokol mulighed for karakterisering af mitokondriel handel langs axoner og analyse af deres morfologi for at lette undersøgelser af neurodegenerative sygdomme.
Introduction
Mitokondriel motilitet og distribution spiller en afgørende rolle i opfyldelsen af variable og specialiserede energiske krav i polariserede neuroner. Neuroner kan udvide ekstremt lange axoner til at forbinde med mål gennem dannelsen af synapser, som kræver høje niveauer af energi til Ca2 + buffering og ion strømme. Transport af mitokondrier fra soma til axon er afgørende for at støtte axonal og synaptisk funktion af neuroner. Rumligt og tidsmæssigt dynamisk mitokondriel bevægelse udføres ved hurtig aksonal transport med hastigheder på flere mikrometer pr.sekund 1.
Specifikt, motor eller adapter proteiner, såsom kinesin og dynein, deltage i den hurtige organelle transport langs mikrotubuli til at kontrollere flytning af mitokondrier2,3. Normal neuronal aktivitet kræver korrekt transport af nyligt samlede mitokondrier fra neuronal soma til distale axon (anterograde axonal transport) og omvendt transport af mitokondrier fra den distale axon tilbage til cellekroppen (retrograd transport). Nylige undersøgelser har vist, at forkert mitokondriel tildeling er stærkt forbundet med neuronale defekter og motorneuron degenerative sygdomme4,5. Derfor, at dissekere rollen som mitokondrier i neurodegeneration, er det vigtigt at etablere metoder til at undersøge mitokondrielle bevægelse langs axoner i levende kulturer.
Der er to største udfordringer i at undersøge og analysere sporing af mitokondrier: (1) identificere mitokondrier fra baggrunden i hver ramme, og (2) analysere og generere forbindelserne mellem hver ramme. Ved løsningen af den første udfordring anvendes en fluorescensmærkningsmetode bredt til at skelne mitokondrier fra baggrunden, såsom MitoTracker farvestof eller omladning af fluorescens-smeltet mitokondrielt målretningsprotein (f.eks. mito-GFP)6,7,8. For at analysere sammenhængen mellem rammer, flere algoritmer og softwareværktøjer er blevet beskrevet i tidligere undersøgelser9. I et nyligt papir sammenlignede forskerne fire forskellige automatiserede værktøjer (f.eks. volocity, Imaris, wrMTrck og Difference Tracker) for at kvantificere mitokondriel transport. Resultaterne viste, at på trods af uoverensstemmelser i sporlængde, mitokondriel forskydning, bevægelsesvarighed og hastighed er disse automatiserede værktøjer egnede til vurdering af transportforskellen efter behandling10. Ud over disse værktøjer, en integreret plugin “Makroer” for ImageJ (skrevet af Rietdorf og Seitz) har været meget anvendt til at analysere mitokondriel transport11. Denne metode genererer kymografer, der kan bruges til at analysere mitokondriel bevægelse, herunder hastighed i både anterograde og retrograd retninger.
Mitokondrier er meget dynamiske organeller, der konstant ændrer sig i antal og morfologi som reaktion på både fysiologiske og patologiske tilstande. Mitokondriel fission og fusion stramt regulere mitokondriel morfologi og homøostase. Ubalancen mellem mitokondriel fission og fusion kan fremkalde ekstremt korte eller lange mitokondrielle netværk, som kan forringe mitokondriel funktion og resultere i unormale neuronale aktiviteter og neurodegeneration. Nedsat mitokondrielle transport og morfologi er involveret i forskellige neurodegenerative sygdomme, såsom Alzheimers sygdom, Parkinsons sygdom, Huntingtons Sygdom, og arvelig spastisk paraplegi (HSP)12,13,14,15. HSP er en heterogen gruppe af arvelige neurologiske lidelser karakteriseret ved degeneration af korticospinaltarmkanalen og efterfølgende manglende kontrol af muskelmuskler i underekstremiteterne16,17. I denne undersøgelse, iPSC-afledte forhjernen neuroner bruges til at vurdere mitokondriel transport og morfologi i HSP. Denne metode giver et unikt paradigme for at undersøge mitokondriel dynamik neuronal axoner i levende kulturer.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denne artikel beskriver en metode til at analysere mitokondriel transport og morfologi i neuronal axoner ved hjælp af rød fluorescerende farvestof og ImageJ software, som begge giver en unik platform til at studere axonal degeneration og mitokondriel morfologi i neurodegenerative sygdomme. Der er flere kritiske trin i protokollen, herunder farvning af mitokondrier, levende celle billeddannelse, og analysere billederne. I denne metode blev et fluorescerende farvestof brugt til at plette mitokondrier. Da menneskelige iPS…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af Spastic Paraplegia Foundation, Blazer Foundation og NIH (R21NS109837).
Materials
| Accutase Cell Detachment Solution | Innovative Cell Technologies | AT104 | |
| Biosafety hood | Thermo Scientific | 1300 SERIES A2 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A-7906 | |
| Brain derived neurotrophic factor (BDNF) | Peprotech | 450-02 | |
| Centrifuge | Thermo Scientific | Sorvall Legend X1R/ 75004261 | |
| Coverslips | Chemiglass Life Sciences | 1760-012 | |
| Cyclic AMP (cAMP) | Sigma-Aldrich | D0627 | |
| Dispase | Gibco | 17105-041 | |
| Dorsomorphin | Selleckchem | S7146 | |
| Dulbecco's modified eagle medium with F12 nutrient mixture (DMEM/F12) | Corning | 10-092-CV | |
| FBS | Gibco | 16141-002 | |
| Fibroblast growth factor 2 (FGF2, bFGF) | Peprotech | 100-18B | |
| Geltrex LDEV-Free Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix | Gibco | A1413201 | |
| Gem21 NeuroPlex Serum-Free Supplement | Gemini | 400-160 | |
| Glass Bottom Dishes | MatTek | P35G-0.170-14-C | |
| 9'' glass pipetes | VWR | 14673-043 | |
| Glial derived neurotrophic factor (BDNF) | Sigma-Aldrich | D0627 | |
| GlutaMAX-I | Gibco | 35050-061 | |
| Heparin | Sigma | H3149 | |
| Insulin growth factor 1 (IGF1) | Invitrogen | M7512 | |
| Knockout Serum Replacer | Gibco | A31815 | |
| Laminin | Sigma | L-6274 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma | M3148-100ML | |
| MitoTracker CMXRos | Invitrogen | M7512 | |
| Neurobasal medium | Gibco | 21103-049 | |
| Non Essential Amino Acids | Gibco | 11140-050 | |
| N2 NeuroPle Serum-Free Supplement | Gemini | 400-163 | |
| Olympus microscope IX83 | Olympus | IX83-ZDC2 | |
| PBS | Corning | 21-031-CV | |
| Phase contrast microscope | Olympus | CKX41/ IX2-SLP | |
| 6 well plates | Corning | 353046 | |
| 24 well plates | Corning | 353047 | |
| Poly-L-ornithine hydrobromide (polyornithine)) | Sigma-Aldrich | P3655 | |
| SB431542 | Stemgent | 04-0010 | |
| Sterile 50ml Disposable Vacuum Filtration System 0.22 μm Millipore Express® Plus Membrane | Millipore | SCGP00525 | |
| Stericup 500/1000 ml Durapore 0.22 μM PVDF | Millipore | SCGVU10RE | |
| Tbr1 antibody (1:2000) | Chemicon | AB9616 | |
| Trypsin inhibitor | Gibco | 17075029 | |
| 50 ml tubes | Phenix | SS-PH50R | |
| 15 ml tubes | Phenix | SS-PH15R | |
| T25 flasks (untreated) | VWR | 10861-572 | |
| Plugins for softwares | |||
| Bio-formats Package | http://downloads.openmicroscopy.org/bio-formats/5.1.0/ | ||
| Fiji software | https://fiji.sc/ | ||
| Kymograph Plugin | https://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html | ||
| MultipleKymograph.class | https://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html | ||
| MultipleOverlay.class | https://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html | ||
| WalkingAverage.class | https://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html | ||
| StackDifference.class | https://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html | ||
| Straighten_.jar | https://imagej.nih.gov/ij/plugins/straighten.html | ||
| tsp050706.txt | https://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html |
References
- Brown, A. Axonal transport of membranous and nonmembranous cargoes: a unified perspective. Journal of Cell Biology. 160 (6), 817-821 (2003).
- Morris, R. L., Hollenbeck, P. J. Axonal transport of mitochondria along microtubules and F-actin in living vertebrate neurons. The Journal of Cell Biology. 131 (5), 1315-1326 (1995).
- Schwarz, T. L. Mitochondrial trafficking in neurons. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5 (6), (2013).
- Magrane, J., Cortez, C., Gan, W. B., Manfredi, G. Abnormal mitochondrial transport and morphology are common pathological denominators in SOD1 and TDP43 ALS mouse models. Human Molecular Genetics. 23 (6), 1413-1424 (2014).
- Alami, N. H., et al. Axonal transport of TDP-43 mRNA granules is impaired by ALS-causing mutations. Neuron. 81 (3), 536-543 (2014).
- Wang, X., Schwarz, T. L. Imaging axonal transport of mitochondria. Methods in Enzymology. 457, 319-333 (2009).
- Course, M. M., et al. Live Imaging Mitochondrial Transport in Neurons. Neuromethods. 123, 49-66 (2017).
- Chazotte, B. Labeling mitochondria with fluorescent dyes for imaging. Cold Spring Harbor Protocols. 2009 (6), 4948 (2009).
- Meijering, E., Dzyubachyk, O., Smal, I. Methods for cell and particle tracking. Methods in Enzymology. 504, 183-200 (2012).
- Bros, H., Hauser, A., Paul, F., Niesner, R., Infante-Duarte, C. Assessing Mitochondrial Movement Within Neurons: Manual Versus Automated Tracking Methods. Traffic. 16 (8), 906-917 (2015).
- Calkins, M. J., Manczak, M., Mao, P., Shirendeb, U., Reddy, P. H. Impaired mitochondrial biogenesis, defective axonal transport of mitochondria, abnormal mitochondrial dynamics and synaptic degeneration in a mouse model of Alzheimer’s disease. Human Molecular Genetics. 20 (23), 4515-4529 (2011).
- Denton, K., et al. Impaired mitochondrial dynamics underlie axonal defects in hereditary spastic paraplegias. Human Molecular Genetics. 27 (14), 2517-2530 (2018).
- Kim-Han, J. S., Antenor-Dorsey, J. A., O’Malley, K. L. The parkinsonian mimetic, MPP+, specifically impairs mitochondrial transport in dopamine axons. Journal of Neuroscience. 31 (19), 7212-7221 (2011).
- Shirendeb, U. P., et al. Mutant huntingtin’s interaction with mitochondrial protein Drp1 impairs mitochondrial biogenesis and causes defective axonal transport and synaptic degeneration in Huntington’s disease. Human Molecular Genetics. 21 (2), 406-420 (2012).
- Lo Giudice, T., Lombardi, F., Santorelli, F. M., Kawarai, T., Orlacchio, A. Hereditary spastic paraplegia: clinical-genetic characteristics and evolving molecular mechanisms. Experimental Neurology. 261, 518-539 (2014).
- Blackstone, C. Cellular pathways of hereditary spastic paraplegia. Annual Review of Neuroscience. 35, 25-47 (2012).
- Boisvert, E. M., Denton, K., Lei, L., Li, X. J. The specification of telencephalic glutamatergic neurons from human pluripotent stem cells. Journal of Visualized Experiments. (74), e50321 (2013).
- Zhu, P. P., Denton, K. R., Pierson, T. M., Li, X. J., Blackstone, C. Pharmacologic rescue of axon growth defects in a human iPSC model of hereditary spastic paraplegia SPG3A. Human Molecular Genetics. 23 (21), 5638-5648 (2014).
- Marra, M. H., Tobias, Z. J., Cohen, H. R., Glover, G., Weissman, T. A. In Vivo Time-Lapse Imaging in the Zebrafish Lateral Line: A Flexible, Open-Ended Research Project for an Undergraduate Neurobiology Laboratory Course. Journal of Undergraduate Neuroscience Education. 13 (3), 215-224 (2015).
- Kang, J. S., et al. Docking of axonal mitochondria by syntaphilin controls their mobility and affects short-term facilitation. Cell. 132 (1), 137-148 (2008).
- Mou, Y., Li, X. J. Rescue axonal defects by targeting mitochondrial dynamics in hereditary spastic paraplegias. Neural Regeneration Research. 14 (4), 574-577 (2019).
- Huang, S., et al. New photostable naphthalimide-based fluorescent probe for mitochondrial imaging and tracking. Biosensors & Bioelectronics. 71, 313-321 (2015).
- Carvalho, P. H., et al. Designed benzothiadiazole fluorophores for selective mitochondrial imaging and dynamics. Chemistry. 20 (47), 15360-15374 (2014).
- Yamakoshi, H., et al. A sensitive and specific Raman probe based on bisarylbutadiyne for live cell imaging of mitochondria. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 25 (3), 664-667 (2015).
- Neumann, S., Chassefeyre, R., Campbell, G. E., Encalada, S. E. KymoAnalyzer: a software tool for the quantitative analysis of intracellular transport in neurons. Traffic. 18 (1), 71-88 (2017).
- Chen, M., et al. A new method for quantifying mitochondrial axonal transport. Protein & Cell. 7 (11), 804-819 (2016).
- De Vos, K. J., Sheetz, M. P. Visualization and quantification of mitochondrial dynamics in living animal cells. Methods in Cell Biology. 80, 627-682 (2007).
- Denton, K. R., Xu, C. C., Li, X. J. Modeling Axonal Phenotypes with Human Pluripotent Stem Cells. Methods in Molecular Biology. 1353, 309-321 (2016).
- Andrews, S., Gilley, J., Coleman, M. P. Difference Tracker: ImageJ plugins for fully automated analysis of multiple axonal transport parameters. Journal of Neuroscience Methods. 193 (2), 281-287 (2010).
- Reis, G. F., et al. Molecular motor function in axonal transport in vivo probed by genetic and computational analysis in Drosophila. Molecular Biology of the Cell. 23 (9), 1700-1714 (2012).
- Broeke, J. H., et al. Automated quantification of cellular traffic in living cells. Journal of Neuroscience Methods. 178 (2), 378-384 (2009).
- Welzel, O., Knorr, J., Stroebel, A. M., Kornhuber, J., Groemer, T. W. A fast and robust method for automated analysis of axonal transport. European Biophysics Journal : EBJ. 40 (9), 1061-1069 (2011).
- Mukherjee, A., et al. Automated kymograph analysis for profiling axonal transport of secretory granules. Medical Image Analysis. 15 (3), 354-367 (2011).
- Klionsky, D. J., et al. Guidelines for the use and interpretation of assays monitoring autophagy. Autophagy. 12, 1 (2016).
- Metivier, D., et al. Cytofluorometric detection of mitochondrial alterations in early CD95/Fas/APO-1-triggered apoptosis of Jurkat T lymphoma cells. Comparison of seven mitochondrion-specific fluorochromes. Immunology Letters. 61 (2-3), 157-163 (1998).
- Scaduto, R. C., Grotyohann, L. W. Measurement of mitochondrial membrane potential using fluorescent rhodamine derivatives. Biophysical Journal. 76, 469-477 (1999).
- Liu, X., Yang, L., Long, Q., Weaver, D., Hajnoczky, G. Choosing proper fluorescent dyes, proteins, and imaging techniques to study mitochondrial dynamics in mammalian cells. Biophysics Reports. 3 (4), 64-72 (2017).
- Zhou, B., Lin, M. Y., Sun, T., Knight, A. L., Sheng, Z. H. Characterization of mitochondrial transport in neurons. Methods in Enzymology. 547, 75-96 (2014).
