Summary
Нарушение митохондриального транспорта и морфологии участвуют в различных нейродегенеративных заболеваний. Представленный протокол использует индуцированные плюрипотентные стволовые клетки полученных нейронов мозга для оценки митохондриального транспорта и морфологии в наследственной спастической параплегии. Этот протокол позволяет охарактеризовать митохондрийный оборот по аксонам и анализ их морфологии, что облегчит изучение нейродегенеративных заболеваний.
Abstract
Нейроны имеют интенсивные потребности в высокой энергии для того, чтобы поддерживать свои функции. Нарушение митохондриального переноса вдоль аксонов наблюдается в человеческих нейронов, которые могут способствовать нейродегенерации в различных состояниях болезни. Хотя это сложно изучить митохондриальной динамики в живых человеческих нервов, такие парадигмы имеют решающее значение для изучения роли митохондрий в нейродегенерации. Описано здесь протокол для анализа митохондриального транспорта и митохондриальной морфологии в аксонах нейронов предмозга, полученных из индуцированных человеком плюрипотентных стволовых клеток (iPSCs). IPSCs дифференцированы в теленецефалические глутаметергические нейроны с использованием устоявшихся методов. Митохондрии нейронов окрашены MitoTracker CMXRos, а митохондриальные движения в аксонах фиксируются с помощью живого изображения микроскопа, оснащенного инкубатором для клеточной культуры. Изображения замедленного анализа анализируются с помощью программного обеспечения с помощью плагинов "MultiKymograph", "Bioformat importer" и "Macros". Сгенерированы гирографы митохондриального транспорта, а средняя митохондриальная скорость в антероградских и ретроградных направлениях считывается с кимографа. Что касается анализа митохондриальной морфологии, митохондриальной длины, области и соотношения сторон получаются с помощью ImageJ. Таким образом, этот протокол позволяет охарактеризовать митохондриальный оборот вдоль аксонов и анализ их морфологии для облегчения исследований нейродегенеративных заболеваний.
Introduction
Митохондриальная подвижность и распределение играют жизненно важную роль в выполнении переменных и специализированных энергетических требований в поляризованных нейронах. Нейроны могут расширять очень длинные аксоны, чтобы соединиться с целями через образование синапсов, которые требуют высоких уровней энергии для буферизации Ca2 и ионных токов. Перенос митохондрий от сомы к аксону имеет решающее значение для поддержки аксональной и синаптической функции нейронов. Пространственно и временно динамическое митохондриальное движение осуществляется быстрым аксональным транспортом со скоростью несколько микрометров всекунду 1.
В частности, моторные или адаптерные белки, такие как кинезин и динейн, участвуют в быстром переносе органелл ы вдоль микротрубок, чтобы контролировать движение митохондрий2,3. Нормальная нейрональная активность требует надлежащей транспортировки вновь собранных митохондрий от нейрональной сомы к дистальной аксон (антероградный аксональный транспорт) и обратной транспортировки митохондрий из дистального аксона обратно в клеточное тело (ретроградный транспорт). Недавние исследования показали, что неправильное распределение митохондрий тесно связано с дефектами нейронов и двигательных нейронных дегенеративных заболеваний4,5. Поэтому, чтобы вскрыть роль митохондрий в нейродегенерации, важно установить методы изучения митохондриального движения вдоль аксонов в живых культурах.
Существует две основные проблемы в изучении и анализе отслеживания митохондрий: (1) выявление митохондрий от фона в каждом кадре, и (2) анализ и генерация связей между каждым кадром. При решении первой задачи широко используется подход к маркировке флуоресценции для разграничения митохондрий от фона, таких как краситель MitoTracker или трансфекция флуоресценции, слитого митохондриального прицеливания белка (например, мито-ГФП)6,7,8. Для анализа связи между кадрами, несколько алгоритмов и программных средств были описаны в предыдущих исследованиях9. В недавней работе исследователи сравнили четыре различных автоматизированных инструмента (например, Volocity, Imaris, wrMTrck и Difference Tracker) для количественной оценки митохондриального транспорта. Результаты показали, что, несмотря на расхождения в длине трека, митохондриальной смещения, продолжительности движения и скорости, эти автоматизированные инструменты подходят для оценки разницы в транспортировке после обработки10. В дополнение к этим инструментам, интегрированный плагин "Macros" для ImageJ (написано Rietdorf и Seitz) широко используется для анализа митохондриального транспорта11. Этот метод генерирует kymographs, которые могут быть использованы для анализа митохондриальных движений, в том числе скорости как в антероградных и ретроградных направлениях.
Митохондрии являются высокодинамическими органеллами, которые постоянно меняются в численности и морфологии в ответ как на физиологические, так и на патологические состояния. Митохондриальная расщепление и слияние жестко регулируют митохондриальную морфологию и гомеостаз. Дисбаланс между митохондриальным делением и слиянием может вызвать чрезвычайно короткие или длинные митохондриальные сети, которые могут ухудшить митохондриальную функцию и привести к аномальной нейронной деятельности и нейродегенерации. Нарушение митохондриального транспорта и морфологии участвуют в различных нейродегенеративных заболеваний, таких как болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона, болезнь Гентингтона, и наследственной спастической параплегии (HSP)12,13,14,15. HSP является неоднородной группой наследственных неврологических расстройств, характеризующихся дегенерацией кортикоспинального тракта и последующей неспособностью контролировать мышцы нижних конечностей16,17. В этом исследовании, iPSC полученных предмозг нейронов используются для оценки митохондриального транспорта и морфологии в HSP. Этот метод обеспечивает уникальную парадигму для изучения митохондриальной динамики нейрональных аксонов в живых культурах.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Поколение теленецефалических глутаматергических нейронов от iPSCs
ПРИМЕЧАНИЕ: Подробный протокол для поддержания iPSCs и их дифференциации в теленецефалических глутамергических нейронов аналогичны описанным ранее18. Здесь вводится и подчеркивается критический процесс при дифференциации плюрипотентных стволовых клеток человека.
- Культура iPSCs на мыши эмбриональной фибробласт (MEF) фифрыров в человеческой эмбриональной стволовых клеток (hESC) среде дополнены фактором роста фибробластов (bFGF, 4 нг/мл).
- После инкубации с dispase (1 мг/мл) в течение 3 мин, разъединить iPSCs в небольших сгустков. Затем, культура iPSC агрегатирует в подвеске в среде hESC в течение 4 дней. Обратитесь к этому временному пункту, когда iPSCs начинают как культуру подвески, как день 1 (D1). Изменение среды ежедневно в течение 4 дней.
- На D5, собирать агрегаты iPSC после центрифугации на 200 х г в течение 2 минут и культуры в нервной индукции средств (NIM) в течение 3 дней. Культура ячейки агрегатирует в подвеске в течение 3 дней, меняя половину средств массовой информации каждые 2 дня. Добавьте DMH-1 (2 мкм) и SB431542 (2 мкм) в NIM-среду для повышения эффективности нейронной индукции.
- На D8, собирать агрегаты iPSC после центрифугации на 200 х г в течение 2 мин и пусть они придерживаются 6 хорошо пластин (около 20-30 агрегатов на хорошо пластины) путем культивирования в НИМ с 10% FBS (или с ламинина покрытием пластин) на ночь. На следующий день, удалить старые среды и изменить на НИМ каждые 2 дня до D17.
ПРИМЕЧАНИЕ: В этот период наблюдается генерация нейроэпителиальных клеток, на что указывает образование колоннарных клеток со структурами розетки. - На D17, механически изолировать нейроэпителиальные клетки в центре колоний (подъем непосредственно путем применения небольшого давления в центре колоний) или ферментативно (лечение с диспазей). Передача изолированных нейроэпителиальных клеток в необработанную ткань культуры T25 колбу, содержащую 8 мл НИМ с добавлением B27 (1x), cAMP (1 мкм) и IGF (10 нг/мл).
ПРИМЕЧАНИЕ: Культура подвески позволяет клеткам образовывать нейросферы, которые обогащаются корковой проекцией нейронных прародителей. - После D35, пластины нейросфер на поли-орнитин и LDEV-бесплатно снижение фактора роста подвале мембранной матрицы (Таблица материалов) покрытием 35 мм стеклянные bottom dishes для генерации телецефалических глутамергических нейронов (кортикальная проекция нейронов). Перед покрытием, диссоциировать нейросферы на небольшие кластеры путем инкубации с 1 мг / мл раствор отслоения клеток в течение 2 мин при 37 градусов по Цельсию.
- Удалите раствор отслоения клеток центрифугированием и повторно притяните в 1 мл нейронной дифференциации среды (NDM). Плиты клетки на стеклянной нижней блюдо (около пяти кластеров в 100 л среднего на блюдо), чтобы позволить им прикрепить. Затем добавьте NDM (1 мл на блюдо) и культуры клеток в NDM, содержащих B27 (1x), cAMP (1 мкм), IGF (10 нг/мл), hBDNF (10 нг/мл), и GDNF (10 нг/мл).
ПРИМЕЧАНИЕ: Небольшие кластеры покрыты, потому что они хорошо выживают и приводят к длинным проекционным нейронам. Кроме того, клетки могут быть разобщены и покрыты при плотности около 20000 клеток на блюдо для лучшего разделения. - Характеризуйте теленефалические глутаметергические нейроны, иммуностоинцев Tbr1 и ЗИИ-тубулин маркеров.
2. Изучение митохондриального переноса вдоль аксонов теленецефалических глутаматергических нейронов
- Разогрейте NDM и включите инкубатор для флуоресцентного микроскопа, установленного при 37 градусах по Цельсию и 5% CO2.
- Чтобы визуализировать митохондрии вдоль аксонов нейронов переднего мозга, инкубировать нейроны с 50 НМ красный флуоресцентный краситель пятно митохондрий в живых клетках (например, MitoTracker CMXRos) в NDM в течение 3 мин при 37 градусов по Цельсию. Далее, мыть клетки 2x с разогретым NDM. Нейроны инкубируются в NDM.
- Для записи митохондриального транспорта вдоль аксонов, возьмите замедленное изображение митохондриального движения с помощью 40-кратной цели с флуоресцентным микроскопом.
ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы стабилизировать культуру, выполнять живые изображения клеток, когда клетки инкубируются в инкубаторе в течение 20 минут после митохондриального окрашивания. - Под фазовым полем идентифицируйте аксоны на основе морфологических характеристик (непосредственно возникают из нейронального клеточного тела, постоянных тонких длинных нейритов без ветвления). Митохондрии перемещаются в антерограде (от клеточного тела к дистальной аксон) и ретроградных направлениях (от аксонального терминала до клеточного тела). Различать направление митохондриального движения вдоль аксонов, четко определить клеточные тела нейронов. На этом этапе фокусааа аксонов под фазовым полем, чтобы уменьшить фотоотбеление.
- После различения клеточного тела и аксона, отрегулируйте время экспозиции и фокус митохондрий в аксонах. Затем, захват транспорта митохондрий в аксоны каждые 5 с в общей продолжительности 5 мин, что дает 60 кадров. Случайно захватить по крайней мере пять мест для каждого блюда и повторить 3x для каждой группы.
3. Анализ данных митохондриального транспорта и морфологии в корковых нейронах
ПРИМЕЧАНИЕ: Анализ собранных данных о митохондриальной транспортировке с помощью программного обеспечения для анализа изображений (например, ImageJ или MetaMorph19). Так как ImageJ легко доступен, выполнять анализ митохондриального транспорта и морфологии с помощью ImageJ с MultiKymograph, Макрос, и анализ частиц плагинов.
- Анализ митохондриального транспорта с помощью ImageJ
- После захвата замедленного изображения митохондриальной подвижности, проанализировать скорость и движение митохондрий с помощью плагина MultiKymograph. Изображения сохраняются как файлы формата .tiff, которые анализируются программным обеспечением Фиджи после ранее сообщенного метода20.
- Скачать программное обеспечение Фиджи. Скачать плагины, которые будут необходимы для анализа митохондриальной скорости перемещения от kymographs. Скачать Био-форматы пакет и Kymograph Plugin вместе с этими четырьмя плагинами .class, в том числе: MultipleKymograph.class, MultipleOverlay.class, StackDifference.class, и WalkingAverage.class (Таблица материалов). Переместите эти файлы в папку плагинов Фиджи. Скачать плагины "tsp050706.txt" в папку плагинов. Перезапустите программное обеспечение Фиджи, когда файлы перемещаются в папку плагинов.
- Открытое программное обеспечение Фиджи. Выберите плагины,а затем импортировать изображения серии .tiff через Bio-Formats Importer под Био-форматами. Убедитесь в том, чтобы выбрать Стандартный ImageJ в стек просмотра,выбрать Открыть все серии, проверить Autoscale, а затем нажмите OK. Обратите внимание на количество кадров и размер изображений в пикселях, которые отображаются в верхней части изображения.
ПРИМЕЧАНИЕ: Возьмите 60 кадров на изображение. - Рассмотрите возможность сделать изображения более четкими, регулируя яркость/контрастность в меню изображения для всех 60 кадров.
- Нажмите правой линии инструмент, чтобы выбрать сегментированную линию и нарисовать сегментированную линию, начиная с тела клетки и заканчивая на терминале аксон. Создайте kymograph, выбрав MultipleKymograph под плагинами. Выбор ширины линии подсказочен после выбора MultipleKymograph. Убедитесь, что это нечетное число. Выберите 1 для ширины линии. После этого шага образуется кимограф.
ПРИМЕЧАНИЕ: Несколько важных частей информации можно прочитать из kymograph. Y-оси kymograph является время продолжительности (5 мин) для 60 кадров. Ось x-оси представляет положение выбранных аксонов. - Используйте диагональ в kymograph для определения направления движения митохондрий (антероградных, ретроградных или стабильных). Например, линия, спускаясь вправо вдоль оси y, указывает на антироградное движение, а линия, спускаясь влево вдоль оси y, указывает на ретроградное движение. Вертикальная линия указывает на отсутствие движения в митохондрии.
- Измерьте расстояние, временные значения и скорость движущихся митохондрий с помощью плагина Macros в программном обеспечении Фиджи. Перейти к плагинам Макрос Установка tsp050607.txt. Нарисуйте сегментированную линию над следом митохондриального движения на kymograph, и всегда рисуйте линию от начальника к низшей области (y-оси).
- После рисования линии, перейдите к Плагины Макрос читать скорости из чайной ложки. Так как сегментированная линия вдоль трассы нарисована, плагин считывает сегментированные скорости, соответствующие линии.
ПРИМЕЧАНИЕ: Единица для всех данных является пикселей. dy сумма время, потребляемые от отправной точки, и dx сумма указывает расстояние митохондриона, движущегося в x-оси. dy now and dx теперь показывает время периода и расстояние движения для каждого сегмента, соответственно. фактическая скорость показывает скорость для каждого сегмента (dx сейчас / dy сейчас). средняя скорость указывает среднюю скорость для митохондриального перемещения (сумма dx/dy). - Измените единицу dx теперь от пикселя к мкм, как соотношение пикселей в мкм, измеряя бар масштаба. Преобразуйте устройство на расстояние от пикселя до мм, измерив бары масштаба на изображениях. Используйте линейный инструмент, чтобы провести линию вдоль барной стойки масштаба и измерить длину линии, выбрав Measure' под "Анализ. Измените время от пикселя к секундам, как 1 пиксель и 5 секунд в этом эксперименте.
- В файле электронной таблицы вычислите среднюю скорость и соответственно обозначьте ретроградное или антероградное движение. Средняя скорость антероградного или ретроградного движения.
- Определите процент стационарных и подвижных митохондрий от кимографа. Антероградные или ретроградные движущиеся митохондрии определяются как движущиеся 5 мкм вперед или назад от происхождения в течение всего периода21. Митохондрии считаются неподвижными, если они не двигались более чем на 5 мкм в течение 5 минут.
- Анализ митохондриальной морфологии с использованием ImageJ
ПРИМЕЧАНИЕ: Определите митохондриальную морфологию путем измерения митохондриальной длины, области и соотношения аспектов с помощью ImageJ. Для этого выполните приведенные ниже шаги.- Для того, чтобы проанализировать митохондриальной длины и области в аксоны, скачать Straighten_.jar плагин с веб-сайта ImageJ (см. Таблица материалов) и переместить его в папку плагинов. Перезапуск программного обеспечения ImageJ.
- Откройте изображение через открытую функцию под файлом и преобразуйте 32-битное изображение в 8 бит с помощью Type under Image.
- Нарисуйте сегментированную линию вдоль аксонов. Выберите выпрямить под плагины и установить 50 пикселей для ширины нити / Wide Line. Это будет генерировать выпрямленный аксон.
- Отрегулируйте порог под изображением и установите измерение под анализом, выбрав "Область Периметр и периметр Пригонка эллипса Дескрипторы формы.
- Измерьте панель масштаба, используя функцию линии и установите шкалу под Анализ, заполнив расстояние в пиксель, знайте расстояние,и единицу длины. Затем выберите Глобальный для установки этой шкалы.
- Используйте анализ частиц под анализом, чтобы определить область. Быстрые параметры: размер (пиксель-2) - 0,20-бесконечность, круговость - 0,00-1,00, а также отображение эллипсов. Выберите результаты отображения.
ПРИМЕЧАНИЕ: Измерение даст результаты нескольких параметров митохондриальной морфологии, включая площадь, периметры, длина (основной), ширина (небольшая) и соотношение аспектов (AR). Также указан соответствующий митохондриальный номер. - Рассчитайте митохондрийное число на аксон (мкм) с помощью митохондриального числа, разделенного на аксональную длину.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Здесь, человека iPSCs были дифференцированы в теленецефалических глутамерных нейронов, которые были разработаны иммуно-пятно с Tbr1 и III тубулина маркеров (Рисунок 1A). Для изучения аксонального переноса митохондрий эти клетки были окрашены красным флуоресцентным красителем, и была проведена визуализация замедленного времени. Так как ImageJ легко доступны и легче получить, митохондриальный транспорт был дополнительно проанализирован с "MultiKymograph" и "Макрос" ImageJ плагины, показанные на рисунке 1.
Есть три соответствующих состояния митохондриального движения, в том числе статические, антероградные и ретроградные движения(рисунок 1B, C). Один митохондрион может оставаться статичным или двигаться в антероградном или ретроградном направлении в пределах аксона, и здесь, сегментированная линия была нарисована вдоль трека митохондриального движения для определения скорости(Рисунок 1D). Скорость митохондриального движения вдоль аксона показана на рисунке 1E и соответствует сегментированным линиям на рисунке 1D после прочтения "Макрос" в ImageJ. Как и программное обеспечение MetaMorph, ImageJ может быть использован для определения митохондриальной скорости и процент мотил-митохондрий на основе kymograph, генерируемого ImageJ (Рисунок 1F). Используя коммерчески доступное программное обеспечение для анализа (например, MetaMorph), предыдущие данные показали, что процент мотил-митохондрий был значительно снижен в нейронах SPG3A по сравнению с нормальными нейронами, в то время как скорость не была изменена19. Для оценки программного обеспечения ImageJ, процент мотиля митохондрий был рассмотрен, и аналогичное снижение доли мотил-митохондрий в sPG3A нейронов по сравнению с контролем дикого типа (WT) нейронов наблюдается (Рисунок 1G).
Что касается анализа митохондриальной морфологии, митохондриальной области, длины и AR были проанализированы с помощью функции "анализ частиц" в ImageJ. Аксоны были выпрямлены с помощью "прямого" плагина(Рисунок 2A,B). Митохондрии были выбраны четко путем корректировки порога(рисунок 2C,D). Наконец, митохондриальная область, длина (основная), ширина (минор), соотношение сторон и периметр были получены из выпрямленного аксона с помощью плагина "Analyze Particles"(рисунок 2E,F). Аномальная митохондриальная морфология была (и ранее была) наблюдается в HSP iPSC полученных теленецефалических глутаматергических нейронов, в том числе SPG15 клеток (Рисунок 2G,H, I)13,22. И митохондриальной длины и аспект соотношение было значительно сокращено в SPG15 нейрона аксоны по сравнению с контролем WT нейрона аксоны (Рисунок 2G,H,I ).
Рисунок 1: Анализ митохондриального транспорта с использованием ImageJ. (A) Иммуностоинсповый, показывающий поколение теленецефалических глутаматергических нейронов. Tbr1 (красный), III тубулин (зеленый) и Hoechst (синий). Шкала баров 50 мкм. Эта цифра была изменена по сравнению с предыдущим исследованием19. (B) Митохондриальный транспорт в пределах аксонов нейронов. Антероградное митохондриальное движение определяется как митохондрии, движущиеся от клеточного тела к дистальному аксону, а ретроградное митохондрийское движение происходит от дистальной аксоны и распространяется на нервное тело клетки. Линия сегмента нарисована вдоль аксонов от нервно-клеточного тела до дистального аксонального терминала для генерации кимографов. (C) Kymograph генерируется с помощью ImageJ; x-оси - это аксональная позиция, а y-оси - это время. Одной из непрерывных белых линий является митохондрион, движущийся в антероградном направлении (розовая наконечник стрелы), ретроградное направление (синяя наконечник стрелы) или статическое состояние (желтая стрелка). (D) Сегментированная линия обращается для чтения скорости с помощью плагина Macros. Цифры 1-8 описывают сегмент линии. От этого увеличенного кимодграфа можно отличить антероградское движение (1-4, 6, 8) и статическое состояние (5, 7). (E) Время и расстояние перемещения для каждого сегмента, фактическая и средняя скорость (в пикселях). (F) Kymograph митохондриального транспорта для WT и SPG3A корковых PNs с использованием ImageJ. Шкала бар No 10 мкм. (G) Мотилмимимиирального соотношения в WT и SPG3A корковых PNs с использованием ImageJ (Злт; 0,05). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: Анализ митохондриальной морфологии с помощью ImageJ. (A)Параметры для выпрямивания аксона. (B) Представитель выпрямлен аксон. (C,D) Корректировка порога выбора митохондрий. (E,F) Измеренная митохондриальная область, периметр, длина (основной), ширина (небольшая) и соотношение аспектов (AR), соответствующие выбранным митохондриям в (E). (G) Представитель фотографии митохондрий в WT и SPG15 телецефалических глутаматергических нейронов. Шкала баров 20 мкм. (H) Митохондриальная длина в WT и SPG15 нейронов. (I) Соотношение сторон митохондрий в нейронах WT и SPG15. П.л.; 0,01 против. WT. (G), (H) и (I) модифицируются по сравнению с предыдущим исследованием13. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
| Флуоресцентные инструменты | Преимущества | Недостатки | Ссылки |
| MitoTracker | MitoTracker является митохондриальной потенциально независимой и может быть использован для анализа колокализации митохондрий с аутофагосомы или лизосомы. | MitoTracker не является достаточно фотостолконтным для долгосрочных исследований. | 35 |
| НПА-ТЭС | Этот краситель является новым фотостолии митохондриального маркировки реагента. | Процесс синтеза и очистки этого красителя занимает много времени и затрат. | 23 |
| МитоБАДИ | Этот краситель можно использовать для митохондриальной визуализации с помощью раманеской микроскопии с высокой чувствительностью и специфичностью. | Использование этого красителя требует Рамана микроскоп. | 25 |
| ТМР | Этот краситель является нетоксичным, специфическим митохондриальным окрашиванием красителя с низкой концентрацией и не утоляющим эффектом. | Маркировка TMRE митохондрий зависит от потенциала митохондриальной мембраны. | 36, 37 |
| Митохондрий-ориентированные флуоресцентные белки | Митохондрий-ориентированные флуоресцентные белки более специфичны и стабильны. | Этот метод нуждается в трансфекции и трансфекции эффективность отличается для различных типов клеток. | 38, 39 |
Таблица 1: Преимущества и недостатки некоторых флуоресцентных инструментов для митохондриальной маркировки.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В этой статье описывается метод анализа митохондриального транспорта и морфологии в нейрональных аксонах с использованием красного флуоресцентного красителя и программного обеспечения ImageJ, оба из которых обеспечивают уникальную платформу для изучения аксональной дегенерации и митохондриальной морфологии при нейродегенеративных заболеваниях. Есть несколько важных шагов в протоколе, в том числе окрашивание митохондрий, изображения живых клеток, и анализ изображений. В этом методе, флуоресцентный краситель был использован для пятнина митохондрий. Так как человеческие нейроны, полученные из iPSC, легко отделяются от блюда, важно оставить какое-то решение в блюде и аккуратно добавить нейробазальную среду. Мытье можно выполнить три или четыре раза, чтобы удалить краситель. Кроме того, митохондрии могут быть помечены с другими репортерами для измерения их транспортировки вдоль аксонов, таких как флуоресцентный белок слитые митохондрии ориентации белков6. В долгосрочном слежении, несколько зондов (т.е., NPA-TPP, 2,1,3-бензотиадиазола «BTD» флуоресцентные производные, и специфический зонд Раман) показали большой потенциал в долгосрочном митохондриальной слежения и митохондриальной динамики анализа23,24,25. Преимущества и недостатки различных зондов можно найти в таблице 1.
После митохондриального окрашивания живая клеточная визуализация выполняется с помощью микроскопа, оснащенного инкубатором. Чтобы эффективно фокусировать нейроны во время визуализации, образцы нейронов должны храниться в инкубаторе 37 градусов по Цельсию с 5% CO2 и во влажной среде в течение по крайней мере 15 минут. Чтобы свести к минимуму эффекты, не связанные с фокусировкой, можно сделать изображения на разных позициях, чтобы сделать стек, или функцию автоматического фокуса. Важно отметить, что для определения направления митохондриального переноса (антероградного или ретроградного), для различения нейрональных клеток тела и аксонов принимаются фазовые изображения. Другой важной проблемой является фотоотбеление флуоресцентных образцов, которые должны быть предотвращены для получения эффективных митохондриальных транспортных покадров. Эффективным методом минимизации фотоотбелевания является фокусировка образцов через окуляр и установление всех параметров изображения под фазовым каналом, за исключением времени экспозиции. Кроме того, автоматический шаблон масштабирования может уменьшить фотоотбеление флуоресценции.
Митохондрии являются высокодинамическими органеллами и могут двигаться как в антероградном, так и в ретроградном направлениях. В нейронах несколько митохондрий в аксонах остаются неподвижными во время записи. Среди движущихся митохондрий, состояние движения может меняться с течением времени. Это явление поднимает важный вопрос о том, какой тип митохондрий считается неподвижным или движущимся. Это можно решить, установив порог во время митохондриального аксонального анализа транспорта. Чтобы отличить статические митохондрии, Neumann et al. использовали центр митохондриальной дорожки, который определяется как среднее значение координат положения с течением времени, а затем установить порог до 350 нм/с, так что максимальное расстояние отклонения митохондриона от его трекового центра находится в первом кадре26. В другом исследовании авторы установили 50 нм/с в качестве порога для различения стационарного статуса от движущегося статуса27. Порог в 300 нм/с использовался здесь для того, чтобы различать перенос на основе микротрубок, как это было сделано в предыдущих отчетах28,29. Хотя порог для стационарных и движущихся митохондрий отличается, установление порога может обеспечить важную относительную информацию о митохондриальных движениях в аксонах между дикими и дегенеративными нейронами.
Большинство протоколов, связанных с митохондральным анализом транспорта, использовали кимографии, которые представляют собой двумерное представление позиций по сравнению со временем. Для анализа слежения за частицамиразработаны несколькоавтоматизированных инструментов26,30,31,32,33,34. Они могут точно отделить каждый кадр. В дополнение к скорости и проценту подвижности, который ImageJ может измерить, этот метод может точно измерять движения мотыльных событий. Тем не менее, они не являются бесплатными для использования. Здесь анализ митохондриального транспорта проводился с использованием видеомагнитоплавинов «Мультикимограф» и «Макрос». Эти плагины могут эффективно измерять митохондриальные движения. Преимуществом этих плагинов является их простота использования и способность указывать на изменения в митохондриальной аксональной транспортировки в виде kymographs и скорости с течением времени.
Мотилические митохондрии были проанализированы в SPG3A и контроль нейронов. Аналогичное снижение доли мотил-митохондрий наблюдалось с использованием двух различных методов анализа, подтверждающих полезность ImageJ для анализа аксонального переноса. Кроме того, митохондриальная морфология может быть проанализирована с помощью того же набора изображений, что обеспечивает важные считывание для изучения митохондриальной дисфункции при различных неврологических заболеваниях. Так как аксональная дегенерация и митохондриальная дисфункция обычно происходят на ранних стадиях, прежде чем нейроны умирают, этот метод может быть использован для изучения ранних патологических изменений, чтобы помочь определить молекулярные пути и экран терапии, чтобы спасти нейродегенерации.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не заявляют о каких-либо конкурирующих финансовых интересах.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана Фондом Спастик Параплегия, Фондом Блейзера и NIH (R21NS109837).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Accutase Cell Detachment Solution | Innovative Cell Technologies | AT104 | |
| Biosafety hood | Thermo Scientific | 1300 SERIES A2 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A-7906 | |
| Brain derived neurotrophic factor (BDNF) | Peprotech | 450-02 | |
| Centrifuge | Thermo Scientific | Sorvall Legend X1R/ 75004261 | |
| Coverslips | Chemiglass Life Sciences | 1760-012 | |
| Cyclic AMP (cAMP) | Sigma-Aldrich | D0627 | |
| Dispase | Gibco | 17105-041 | |
| Dorsomorphin | Selleckchem | S7146 | |
| Dulbecco's modified eagle medium with F12 nutrient mixture (DMEM/F12) | Corning | 10-092-CV | |
| FBS | Gibco | 16141-002 | |
| Fibroblast growth factor 2 (FGF2, bFGF) | Peprotech | 100-18B | |
| Geltrex LDEV-Free Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix | Gibco | A1413201 | |
| Gem21 NeuroPlex Serum-Free Supplement | Gemini | 400-160 | |
| Glass Bottom Dishes | MatTek | P35G-0.170-14-C | |
| 9'' glass pipetes | VWR | 14673-043 | |
| Glial derived neurotrophic factor (BDNF) | Sigma-Aldrich | D0627 | |
| GlutaMAX-I | Gibco | 35050-061 | |
| Heparin | Sigma | H3149 | |
| Insulin growth factor 1 (IGF1) | Invitrogen | M7512 | |
| Knockout Serum Replacer | Gibco | A31815 | |
| Laminin | Sigma | L-6274 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma | M3148-100ML | |
| MitoTracker CMXRos | Invitrogen | M7512 | |
| Neurobasal medium | Gibco | 21103-049 | |
| Non Essential Amino Acids | Gibco | 11140-050 | |
| N2 NeuroPle Serum-Free Supplement | Gemini | 400-163 | |
| Olympus microscope IX83 | Olympus | IX83-ZDC2 | |
| PBS | Corning | 21-031-CV | |
| Phase contrast microscope | Olympus | CKX41/ IX2-SLP | |
| 6 well plates | Corning | 353046 | |
| 24 well plates | Corning | 353047 | |
| Poly-L-ornithine hydrobromide (polyornithine)) | Sigma-Aldrich | P3655 | |
| SB431542 | Stemgent | 04-0010 | |
| Sterile 50ml Disposable Vacuum Filtration System 0.22 μm Millipore Express® Plus Membrane | Millipore | SCGP00525 | |
| Stericup 500/1000 ml Durapore 0.22 μM PVDF | Millipore | SCGVU10RE | |
| Tbr1 antibody (1:2000) | Chemicon | AB9616 | |
| Trypsin inhibitor | Gibco | 17075029 | |
| 50 ml tubes | Phenix | SS-PH50R | |
| 15 ml tubes | Phenix | SS-PH15R | |
| T25 flasks (untreated) | VWR | 10861-572 | |
| Plugins for softwares | |||
| Bio-formats Package | http://downloads.openmicroscopy.org/bio-formats/5.1.0/ | ||
| Fiji software | https://fiji.sc/ | ||
| Kymograph Plugin | https://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html | ||
| MultipleKymograph.class | https://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html | ||
| MultipleOverlay.class | https://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html | ||
| WalkingAverage.class | https://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html | ||
| StackDifference.class | https://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html | ||
| Straighten_.jar | https://imagej.nih.gov/ij/plugins/straighten.html | ||
| tsp050706.txt | https://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html |
References
- Brown, A. Axonal transport of membranous and nonmembranous cargoes: a unified perspective. Journal of Cell Biology. 160 (6), 817-821 (2003).
- Morris, R. L., Hollenbeck, P. J. Axonal transport of mitochondria along microtubules and F-actin in living vertebrate neurons. The Journal of Cell Biology. 131 (5), 1315-1326 (1995).
- Schwarz, T. L. Mitochondrial trafficking in neurons. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5 (6), (2013).
- Magrane, J., Cortez, C., Gan, W. B., Manfredi, G. Abnormal mitochondrial transport and morphology are common pathological denominators in SOD1 and TDP43 ALS mouse models. Human Molecular Genetics. 23 (6), 1413-1424 (2014).
- Alami, N. H., et al. Axonal transport of TDP-43 mRNA granules is impaired by ALS-causing mutations. Neuron. 81 (3), 536-543 (2014).
- Wang, X., Schwarz, T. L. Imaging axonal transport of mitochondria. Methods in Enzymology. 457, 319-333 (2009).
- Course, M. M., et al. Live Imaging Mitochondrial Transport in Neurons. Neuromethods. 123, 49-66 (2017).
- Chazotte, B. Labeling mitochondria with fluorescent dyes for imaging. Cold Spring Harbor Protocols. 2009 (6), 4948 (2009).
- Meijering, E., Dzyubachyk, O., Smal, I. Methods for cell and particle tracking. Methods in Enzymology. 504, 183-200 (2012).
- Bros, H., Hauser, A., Paul, F., Niesner, R., Infante-Duarte, C. Assessing Mitochondrial Movement Within Neurons: Manual Versus Automated Tracking Methods. Traffic. 16 (8), 906-917 (2015).
- Rietdorf, J. http://www.embl.de/eamnet/html/kymograph.html. , Available from: http://www.embl.de/eamnet/html/kymograph.html (2015).
- Calkins, M. J., Manczak, M., Mao, P., Shirendeb, U., Reddy, P. H. Impaired mitochondrial biogenesis, defective axonal transport of mitochondria, abnormal mitochondrial dynamics and synaptic degeneration in a mouse model of Alzheimer's disease. Human Molecular Genetics. 20 (23), 4515-4529 (2011).
- Denton, K., et al. Impaired mitochondrial dynamics underlie axonal defects in hereditary spastic paraplegias. Human Molecular Genetics. 27 (14), 2517-2530 (2018).
- Kim-Han, J. S., Antenor-Dorsey, J. A., O'Malley, K. L. The parkinsonian mimetic, MPP+, specifically impairs mitochondrial transport in dopamine axons. Journal of Neuroscience. 31 (19), 7212-7221 (2011).
- Shirendeb, U. P., et al. Mutant huntingtin's interaction with mitochondrial protein Drp1 impairs mitochondrial biogenesis and causes defective axonal transport and synaptic degeneration in Huntington's disease. Human Molecular Genetics. 21 (2), 406-420 (2012).
- Lo Giudice, T., Lombardi, F., Santorelli, F. M., Kawarai, T., Orlacchio, A. Hereditary spastic paraplegia: clinical-genetic characteristics and evolving molecular mechanisms. Experimental Neurology. 261, 518-539 (2014).
- Blackstone, C. Cellular pathways of hereditary spastic paraplegia. Annual Review of Neuroscience. 35, 25-47 (2012).
- Boisvert, E. M., Denton, K., Lei, L., Li, X. J. The specification of telencephalic glutamatergic neurons from human pluripotent stem cells. Journal of Visualized Experiments. (74), e50321 (2013).
- Zhu, P. P., Denton, K. R., Pierson, T. M., Li, X. J., Blackstone, C. Pharmacologic rescue of axon growth defects in a human iPSC model of hereditary spastic paraplegia SPG3A. Human Molecular Genetics. 23 (21), 5638-5648 (2014).
- Marra, M. H., Tobias, Z. J., Cohen, H. R., Glover, G., Weissman, T. A. In Vivo Time-Lapse Imaging in the Zebrafish Lateral Line: A Flexible, Open-Ended Research Project for an Undergraduate Neurobiology Laboratory Course. Journal of Undergraduate Neuroscience Education. 13 (3), 215-224 (2015).
- Kang, J. S., et al. Docking of axonal mitochondria by syntaphilin controls their mobility and affects short-term facilitation. Cell. 132 (1), 137-148 (2008).
- Mou, Y., Li, X. J. Rescue axonal defects by targeting mitochondrial dynamics in hereditary spastic paraplegias. Neural Regeneration Research. 14 (4), 574-577 (2019).
- Huang, S., et al. New photostable naphthalimide-based fluorescent probe for mitochondrial imaging and tracking. Biosensors & Bioelectronics. 71, 313-321 (2015).
- Carvalho, P. H., et al. Designed benzothiadiazole fluorophores for selective mitochondrial imaging and dynamics. Chemistry. 20 (47), 15360-15374 (2014).
- Yamakoshi, H., et al. A sensitive and specific Raman probe based on bisarylbutadiyne for live cell imaging of mitochondria. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 25 (3), 664-667 (2015).
- Neumann, S., Chassefeyre, R., Campbell, G. E., Encalada, S. E. KymoAnalyzer: a software tool for the quantitative analysis of intracellular transport in neurons. Traffic. 18 (1), 71-88 (2017).
- Chen, M., et al. A new method for quantifying mitochondrial axonal transport. Protein & Cell. 7 (11), 804-819 (2016).
- De Vos, K. J., Sheetz, M. P. Visualization and quantification of mitochondrial dynamics in living animal cells. Methods in Cell Biology. 80, 627-682 (2007).
- Denton, K. R., Xu, C. C., Li, X. J. Modeling Axonal Phenotypes with Human Pluripotent Stem Cells. Methods in Molecular Biology. 1353, 309-321 (2016).
- Andrews, S., Gilley, J., Coleman, M. P. Difference Tracker: ImageJ plugins for fully automated analysis of multiple axonal transport parameters. Journal of Neuroscience Methods. 193 (2), 281-287 (2010).
- Reis, G. F., et al. Molecular motor function in axonal transport in vivo probed by genetic and computational analysis in Drosophila. Molecular Biology of the Cell. 23 (9), 1700-1714 (2012).
- Broeke, J. H., et al. Automated quantification of cellular traffic in living cells. Journal of Neuroscience Methods. 178 (2), 378-384 (2009).
- Welzel, O., Knorr, J., Stroebel, A. M., Kornhuber, J., Groemer, T. W. A fast and robust method for automated analysis of axonal transport. European Biophysics Journal : EBJ. 40 (9), 1061-1069 (2011).
- Mukherjee, A., et al. Automated kymograph analysis for profiling axonal transport of secretory granules. Medical Image Analysis. 15 (3), 354-367 (2011).
- Klionsky, D. J., et al. Guidelines for the use and interpretation of assays monitoring autophagy. Autophagy. 12, 1 (2016).
- Metivier, D., et al. Cytofluorometric detection of mitochondrial alterations in early CD95/Fas/APO-1-triggered apoptosis of Jurkat T lymphoma cells. Comparison of seven mitochondrion-specific fluorochromes. Immunology Letters. 61 (2-3), 157-163 (1998).
- Scaduto, R. C., Grotyohann, L. W. Measurement of mitochondrial membrane potential using fluorescent rhodamine derivatives. Biophysical Journal. 76, Pt 1 469-477 (1999).
- Liu, X., Yang, L., Long, Q., Weaver, D., Hajnoczky, G. Choosing proper fluorescent dyes, proteins, and imaging techniques to study mitochondrial dynamics in mammalian cells. Biophysics Reports. 3 (4), 64-72 (2017).
- Zhou, B., Lin, M. Y., Sun, T., Knight, A. L., Sheng, Z. H. Characterization of mitochondrial transport in neurons. Methods in Enzymology. 547, 75-96 (2014).
