Summary

Analisando o Transporte Mitocondrial e a Morfologia em neurônios derivados de células-tronco pluripotentes induzidos por humanos em Paraplegia Espástica Hereditária

Published: February 09, 2020
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Summary

Transporte mitocondrial prejudicado e morfologia estão envolvidos em várias doenças neurodegenerativas. O protocolo apresentado usa neurônios cerebrais derivados de células-tronco pluripotentes induzidas para avaliar o transporte mitocondrial e a morfologia em paraplegia espástica hereditária. Este protocolo permite a caracterização do tráfico mitocondrial ao longo de axônios e análise de sua morfologia, o que facilitará o estudo de doenças neurodegenerativas.

Abstract

Os neurônios têm intensas demandas por alta energia para apoiar suas funções. O transporte mitocondrial prejudicado ao longo de axônons tem sido observado em neurônios humanos, o que pode contribuir para a neurodegeneração em vários estados da doença. Embora seja desafiador examinar a dinâmica mitocondrial nos nervos humanos vivos, tais paradigmas são fundamentais para estudar o papel das mitocôndrias na neurodegeneração. Descrito aqui está um protocolo para analisar o transporte mitocondrial e a morfologia mitocondrial em axônios de neurônios cerebrais provém derivados de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos (iPSCs). Os iPSCs são diferenciados em neurônios glutamatergicos telencefálicos usando métodos bem estabelecidos. Mitocôndrias dos neurônios estão manchadas com MitoTracker CMXRos, e o movimento mitocondrial dentro dos axônons os axônolos são capturados usando um microscópio de imagem de células ao vivo equipado com uma incubadora para a cultura celular. Imagens de lapso de tempo são analisadas usando software com plugins “MultiKymograph”, “Bioformat importer” e “Macros”. Kymographs do transporte mitocondrial são gerados, e velocidade mitocondrial média nas direções anteroras e retrógradas é lida a partir do kymograph. Em relação à análise mitocondrial de morfologia, o comprimento mitocondrial, a área e a proporção são obtidos usando o ImageJ. Em resumo, este protocolo permite a caracterização do tráfico mitocondrial ao longo de axônios e análise de sua morfologia para facilitar estudos de doenças neurodegenerativas.

Introduction

A motilidade mitocondrial e a distribuição desempenham um papel vital no cumprimento de demandas energéticas variáveis e especializadas em neurônios polarizados. Os neurônios podem estender axônhons extremamente longos para se conectar com metas através da formação de sinapses, que exigem altos níveis de energia para correntes ca2+ e íons. O transporte de mitocôndrias de soma para axônomon é fundamental para suportar a função axonal e sináptica dos neurônios. O movimento mitocondrial espacial e temporalmente dinâmico é conduzido pelo transporte axonal rápido a taxas de vários micrômetros por segundo1.

Especificamente, proteínas motoras ou adaptantes, como cinesesina e dynein, participam do transporte rápido de organela ao longo de microtúbulos para controlar o movimento das mitocôndrias2,3. A atividade neuronal normal requer transporte adequado de mitocôndrias recém-montadas da soma neuronal ao axôlo distal (transporte axonal anterogrado) e transporte reverso de mitocôndrias do axôlo distal de volta ao corpo celular (transporte retrógrado). Estudos recentes indicaram que a alocação mitocondrial inadequada está fortemente associada a defeitos neuronais e doenças degenerativas do neurônio motor4,5. Portanto, para dissecar o papel das mitocôndrias na neurodegeneração, é importante estabelecer métodos para examinar o movimento mitocondrial ao longo de axôlos nas culturas vivas.

Existem dois desafios principais na análise e análise do rastreamento das mitocôndrias: (1) identificar mitocôndrias do fundo em cada quadro, e (2) analisar e gerar as conexões entre cada quadro. Na resolução do primeiro desafio, uma abordagem de rotulagem de fluorescência é amplamente utilizada para distinguir mitocôndrias do fundo, como o tinante MitoTracker ou transfecção de proteína mitocondrial com fluorescência (por exemplo, mito-GFP)6,7,8. Para analisar a associação entre quadros, vários algoritmos e ferramentas de software foram descritos em estudos anteriores9. Em um artigo recente, os pesquisadores compararam quatro ferramentas automatizadas diferentes (por exemplo, Volocity, Imaris, wrMTrck e Difference Tracker) para quantificar o transporte mitocondrial. Os resultados mostraram que, apesar das discrepâncias no comprimento da pista, do deslocamento mitocondrial, da duração do movimento e da velocidade, essas ferramentas automatizadas são adequadas para avaliar a diferença de transporte após o tratamento10. Além dessas ferramentas, um plugin integrado “Macros” para ImageJ (escrito por Rietdorf e Seitz) tem sido amplamente utilizado para analisar o transporte mitocondrial11. Este método gera kymogramas que podem ser usados para analisar o movimento mitocondrial, incluindo velocidade em direções anteroras e retrógradas.

Mitocôndrias são organelas altamente dinâmicas que mudam constantemente de número e morfologia em resposta a condições fisiológicas e patológicas. Fissão mitocondrial e fusão regulam firmemente a morfologia mitocondrial e a homeostase. O desequilíbrio entre fissão mitocondrial e fusão pode induzir redes mitocondriais extremamente curtas ou longas, que podem prejudicar a função mitocondrial e resultar em atividades neuronais anormais e neurodegeneração. Transporte mitocondrial prejudicado e morfologia estão envolvidos em várias doenças neurodegenerativas, como doença de Alzheimer, doença de Parkinson, doença de Huntington e paraplegia espástica hereditária (HSP)12,13,14,15. HSP é um grupo heterogêneo de distúrbios neurológicos herdados caracterizados pela degeneração do trato corticorrâmdia e subsequente falha no controle dos músculos dos membros inferiores16,17. Neste estudo, neurônios cerebrais derivados do IPSC são usados para avaliar transporte mitocondrial e morfologia em HSP. Este método fornece um paradigma único para examinar a dinâmica mitocondrial de axônsão neuronal em culturas vivas.

Protocol

1. Geração de neurônios glutamatergicos telencefálicos de iPSCs NOTA: O protocolo detalhado para a manutenção dos iPSCs e sua diferenciação em neurônios glutalicos telencefálicos são semelhantes aos descritos anteriormente18. Aqui, o processo crítico durante a diferenciação de células-tronco pluripotentes humanas é introduzido e destacado. IPSCs culturais em alimentadores de fibroblasto embrionário de camundongos (MEF) em meio de células-tron…

Representative Results

Aqui, os iPSCs humanos foram diferenciados em neurônios glutamatergicos telencefálicos, caracterizados por imunomanchas com marcadores tbr1 e βIII de tubulina(Figura 1A). Para examinar o transporte axonal de mitocôndrias, essas células foram manchadas com corante fluorescente vermelho, e a imagem de lapso de tempo foi realizada. Como o ImageJ está prontamente disponível e mais fácil de obter, o transporte mitocondrial foi ainda mais analisado com os plugins ImageJ “M…

Discussion

Este artigo descreve um método para analisar o transporte mitocondrial e a morfologia em axônios neuronais usando corante fluorescente vermelho e software ImageJ, ambos fornecem uma plataforma única para estudar degeneração axonal e morfologia mitocondrial em doenças neurodegenerativas. Existem vários passos críticos no protocolo, incluindo a coloração de mitocôndrias, imagens de células ao vivo e análise das imagens. Neste método, um corante fluorescente foi usado para manchar mitocôndrias. Uma vez que os…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabalho foi apoiado pela Fundação Paraplegia Spastic, fundação Blazer e o NIH (R21NS109837).

Materials

Accutase Cell Detachment Solution Innovative Cell Technologies AT104
Biosafety hood Thermo Scientific 1300 SERIES A2
Bovine serum albumin (BSA) Sigma A-7906
Brain derived neurotrophic factor (BDNF) Peprotech 450-02
Centrifuge Thermo Scientific Sorvall Legend X1R/ 75004261
Coverslips Chemiglass Life Sciences 1760-012
Cyclic AMP (cAMP) Sigma-Aldrich D0627
Dispase Gibco 17105-041
Dorsomorphin Selleckchem S7146
Dulbecco's modified eagle medium with F12 nutrient mixture (DMEM/F12) Corning 10-092-CV
FBS Gibco 16141-002
Fibroblast growth factor 2 (FGF2, bFGF) Peprotech 100-18B
Geltrex LDEV-Free Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix Gibco A1413201
Gem21 NeuroPlex Serum-Free Supplement Gemini 400-160
Glass Bottom Dishes MatTek P35G-0.170-14-C
9'' glass pipetes VWR 14673-043
Glial derived neurotrophic factor (BDNF) Sigma-Aldrich D0627
GlutaMAX-I Gibco 35050-061
Heparin Sigma H3149
Insulin growth factor 1 (IGF1) Invitrogen M7512
Knockout Serum Replacer Gibco A31815
Laminin Sigma L-6274
2-Mercaptoethanol Sigma M3148-100ML
MitoTracker CMXRos Invitrogen M7512
Neurobasal medium Gibco 21103-049
Non Essential Amino Acids Gibco 11140-050
N2 NeuroPle Serum-Free Supplement Gemini 400-163
Olympus microscope IX83 Olympus IX83-ZDC2
PBS Corning 21-031-CV
Phase contrast microscope Olympus CKX41/ IX2-SLP
6 well plates Corning 353046
24 well plates Corning 353047
Poly-L-ornithine hydrobromide (polyornithine)) Sigma-Aldrich P3655
SB431542 Stemgent 04-0010
Sterile 50ml Disposable Vacuum Filtration System 0.22 μm Millipore Express® Plus Membrane Millipore SCGP00525
Stericup 500/1000 ml Durapore 0.22 μM PVDF Millipore SCGVU10RE
Tbr1 antibody (1:2000) Chemicon AB9616
Trypsin inhibitor Gibco 17075029
50 ml tubes Phenix SS-PH50R
15 ml tubes Phenix SS-PH15R
T25 flasks (untreated) VWR 10861-572
Plugins for softwares
Bio-formats Package http://downloads.openmicroscopy.org/bio-formats/5.1.0/
Fiji software https://fiji.sc/
Kymograph Plugin https://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html
MultipleKymograph.class https://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html
MultipleOverlay.class https://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html
WalkingAverage.class https://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html
StackDifference.class https://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html
Straighten_.jar https://imagej.nih.gov/ij/plugins/straighten.html
tsp050706.txt https://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html

References

  1. Brown, A. Axonal transport of membranous and nonmembranous cargoes: a unified perspective. Journal of Cell Biology. 160 (6), 817-821 (2003).
  2. Morris, R. L., Hollenbeck, P. J. Axonal transport of mitochondria along microtubules and F-actin in living vertebrate neurons. The Journal of Cell Biology. 131 (5), 1315-1326 (1995).
  3. Schwarz, T. L. Mitochondrial trafficking in neurons. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5 (6), (2013).
  4. Magrane, J., Cortez, C., Gan, W. B., Manfredi, G. Abnormal mitochondrial transport and morphology are common pathological denominators in SOD1 and TDP43 ALS mouse models. Human Molecular Genetics. 23 (6), 1413-1424 (2014).
  5. Alami, N. H., et al. Axonal transport of TDP-43 mRNA granules is impaired by ALS-causing mutations. Neuron. 81 (3), 536-543 (2014).
  6. Wang, X., Schwarz, T. L. Imaging axonal transport of mitochondria. Methods in Enzymology. 457, 319-333 (2009).
  7. Course, M. M., et al. Live Imaging Mitochondrial Transport in Neurons. Neuromethods. 123, 49-66 (2017).
  8. Chazotte, B. Labeling mitochondria with fluorescent dyes for imaging. Cold Spring Harbor Protocols. 2009 (6), 4948 (2009).
  9. Meijering, E., Dzyubachyk, O., Smal, I. Methods for cell and particle tracking. Methods in Enzymology. 504, 183-200 (2012).
  10. Bros, H., Hauser, A., Paul, F., Niesner, R., Infante-Duarte, C. Assessing Mitochondrial Movement Within Neurons: Manual Versus Automated Tracking Methods. Traffic. 16 (8), 906-917 (2015).
  11. Calkins, M. J., Manczak, M., Mao, P., Shirendeb, U., Reddy, P. H. Impaired mitochondrial biogenesis, defective axonal transport of mitochondria, abnormal mitochondrial dynamics and synaptic degeneration in a mouse model of Alzheimer’s disease. Human Molecular Genetics. 20 (23), 4515-4529 (2011).
  12. Denton, K., et al. Impaired mitochondrial dynamics underlie axonal defects in hereditary spastic paraplegias. Human Molecular Genetics. 27 (14), 2517-2530 (2018).
  13. Kim-Han, J. S., Antenor-Dorsey, J. A., O’Malley, K. L. The parkinsonian mimetic, MPP+, specifically impairs mitochondrial transport in dopamine axons. Journal of Neuroscience. 31 (19), 7212-7221 (2011).
  14. Shirendeb, U. P., et al. Mutant huntingtin’s interaction with mitochondrial protein Drp1 impairs mitochondrial biogenesis and causes defective axonal transport and synaptic degeneration in Huntington’s disease. Human Molecular Genetics. 21 (2), 406-420 (2012).
  15. Lo Giudice, T., Lombardi, F., Santorelli, F. M., Kawarai, T., Orlacchio, A. Hereditary spastic paraplegia: clinical-genetic characteristics and evolving molecular mechanisms. Experimental Neurology. 261, 518-539 (2014).
  16. Blackstone, C. Cellular pathways of hereditary spastic paraplegia. Annual Review of Neuroscience. 35, 25-47 (2012).
  17. Boisvert, E. M., Denton, K., Lei, L., Li, X. J. The specification of telencephalic glutamatergic neurons from human pluripotent stem cells. Journal of Visualized Experiments. (74), e50321 (2013).
  18. Zhu, P. P., Denton, K. R., Pierson, T. M., Li, X. J., Blackstone, C. Pharmacologic rescue of axon growth defects in a human iPSC model of hereditary spastic paraplegia SPG3A. Human Molecular Genetics. 23 (21), 5638-5648 (2014).
  19. Marra, M. H., Tobias, Z. J., Cohen, H. R., Glover, G., Weissman, T. A. In Vivo Time-Lapse Imaging in the Zebrafish Lateral Line: A Flexible, Open-Ended Research Project for an Undergraduate Neurobiology Laboratory Course. Journal of Undergraduate Neuroscience Education. 13 (3), 215-224 (2015).
  20. Kang, J. S., et al. Docking of axonal mitochondria by syntaphilin controls their mobility and affects short-term facilitation. Cell. 132 (1), 137-148 (2008).
  21. Mou, Y., Li, X. J. Rescue axonal defects by targeting mitochondrial dynamics in hereditary spastic paraplegias. Neural Regeneration Research. 14 (4), 574-577 (2019).
  22. Huang, S., et al. New photostable naphthalimide-based fluorescent probe for mitochondrial imaging and tracking. Biosensors & Bioelectronics. 71, 313-321 (2015).
  23. Carvalho, P. H., et al. Designed benzothiadiazole fluorophores for selective mitochondrial imaging and dynamics. Chemistry. 20 (47), 15360-15374 (2014).
  24. Yamakoshi, H., et al. A sensitive and specific Raman probe based on bisarylbutadiyne for live cell imaging of mitochondria. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 25 (3), 664-667 (2015).
  25. Neumann, S., Chassefeyre, R., Campbell, G. E., Encalada, S. E. KymoAnalyzer: a software tool for the quantitative analysis of intracellular transport in neurons. Traffic. 18 (1), 71-88 (2017).
  26. Chen, M., et al. A new method for quantifying mitochondrial axonal transport. Protein & Cell. 7 (11), 804-819 (2016).
  27. De Vos, K. J., Sheetz, M. P. Visualization and quantification of mitochondrial dynamics in living animal cells. Methods in Cell Biology. 80, 627-682 (2007).
  28. Denton, K. R., Xu, C. C., Li, X. J. Modeling Axonal Phenotypes with Human Pluripotent Stem Cells. Methods in Molecular Biology. 1353, 309-321 (2016).
  29. Andrews, S., Gilley, J., Coleman, M. P. Difference Tracker: ImageJ plugins for fully automated analysis of multiple axonal transport parameters. Journal of Neuroscience Methods. 193 (2), 281-287 (2010).
  30. Reis, G. F., et al. Molecular motor function in axonal transport in vivo probed by genetic and computational analysis in Drosophila. Molecular Biology of the Cell. 23 (9), 1700-1714 (2012).
  31. Broeke, J. H., et al. Automated quantification of cellular traffic in living cells. Journal of Neuroscience Methods. 178 (2), 378-384 (2009).
  32. Welzel, O., Knorr, J., Stroebel, A. M., Kornhuber, J., Groemer, T. W. A fast and robust method for automated analysis of axonal transport. European Biophysics Journal : EBJ. 40 (9), 1061-1069 (2011).
  33. Mukherjee, A., et al. Automated kymograph analysis for profiling axonal transport of secretory granules. Medical Image Analysis. 15 (3), 354-367 (2011).
  34. Klionsky, D. J., et al. Guidelines for the use and interpretation of assays monitoring autophagy. Autophagy. 12, 1 (2016).
  35. Metivier, D., et al. Cytofluorometric detection of mitochondrial alterations in early CD95/Fas/APO-1-triggered apoptosis of Jurkat T lymphoma cells. Comparison of seven mitochondrion-specific fluorochromes. Immunology Letters. 61 (2-3), 157-163 (1998).
  36. Scaduto, R. C., Grotyohann, L. W. Measurement of mitochondrial membrane potential using fluorescent rhodamine derivatives. Biophysical Journal. 76, 469-477 (1999).
  37. Liu, X., Yang, L., Long, Q., Weaver, D., Hajnoczky, G. Choosing proper fluorescent dyes, proteins, and imaging techniques to study mitochondrial dynamics in mammalian cells. Biophysics Reports. 3 (4), 64-72 (2017).
  38. Zhou, B., Lin, M. Y., Sun, T., Knight, A. L., Sheng, Z. H. Characterization of mitochondrial transport in neurons. Methods in Enzymology. 547, 75-96 (2014).

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Cite This Article
Mou, Y., Mukte, S., Chai, E., Dein, J., Li, X. Analyzing Mitochondrial Transport and Morphology in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Neurons in Hereditary Spastic Paraplegia. J. Vis. Exp. (156), e60548, doi:10.3791/60548 (2020).

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