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JoVE Journal Biochemistry
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Biochemistry

使用蛋白质印迹法研究神经元K-Cl共转运蛋白KCC2的功能和活性

Published: December 9, 2022 doi: 10.3791/64179
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Institute of Biomedical and Clinical Sciences, Medical School, Faculty of Health and Life Sciences, University of Exeter, Hatherly Laboratories

Summary

本协议重点介绍了蛋白质印迹技术在研究神经元K-Cl共转运蛋白KCC2的功能和活性方面的应用。该方案描述了通过蛋白质印迹 在 激酶调节位点Thr906/1007处KCC2磷酸化的研究。此外，本文还简要强调了确认KCC2活性的其他方法。

Abstract

氯化钾共转运蛋白2（KCC2）是阳离子氯化共转运蛋白（CCCs）溶质载体家族12（SLC12）的成员，仅在神经元中发现，对于Cl- 稳态的正常功能以及因此具有功能性GABA能抑制至关重要。KCC2的适当调节失败是有害的，并且与包括癫痫在内的几种神经系统疾病的流行有关。在了解KCC2调节所涉及的机制方面取得了相当大的进展，KCC2被认可为开发使研究人员能够研究其功能和活动的技术;通过直接（评估激酶调控位点磷酸化）或间接（观察和监测GABA活性） 调查 。在这里，该协议重点介绍了如何使用蛋白质印迹技术研究激酶调节位点 - Thr906 和 Thr1007 - 的 KCC2 磷酸化。还有其他经典方法可用于直接测量KCC2活性，例如铷离子和铊离子摄取测定。进一步的技术如膜片钳电生理学用于测量GABA活性;因此，间接反映活化和/或失活的KCC2，如细胞内氯离子稳态的评估所告知的。本文将简要讨论其中一些附加技术。

Introduction

氯化钾共转运蛋白2（KCC2）是阳离子氯化共转运蛋白（CCCs）溶质载体家族12（SLC12）的成员，仅在神经元中发现，对于Cl-稳态的正常功能以及因此功能性GABA能抑制1，2，3，4至关重要。KCC2将低神经元内Cl-浓度（[Cl-]i）维持在4-6mM，有助于大脑和脊髓中的γ-氨基丁酸（GABA）/甘氨酸超极化和突触抑制5。KCC2的适当调节失败与几种神经系统疾病的流行有关，包括癫痫4。此外，KCC2介导的Cl−挤出减少和超极化GABAA和/或甘氨酸受体介导的电流受损与癫痫，神经性疼痛和痉挛有关6，7。神经元 KCC2 通过无赖氨酸 （WNK）-STE20/SPS1 相关脯氨酸/富丙氨酸 （SPAK）/氧化应激响应 （OSR） 激酶信号传导复合物1 在其 C 末端细胞内结构域内的关键调节残基磷酸化而负调节，这有助于维持未成熟神经元中去极化的 GABA 活性2，8，9.WNK-SPAK/OSR1磷酸化苏氨酸残基906和1007（Thr906/Thr1007），随后下调KCC2的mRNA基因表达，导致其生理功能随之恶化8，10。然而，更重要的是，已知WNK-SPAK/OSR1激酶复合物磷酸化并抑制KCC2表达1，2，4，11，12已经是一个事实，并且抑制磷酸化Thr906 / Thr1007的激酶复合物信号通路与KCC2 mRNA基因13，14，15的表达增加有关。.重要的是要注意，通过蛋白质磷酸化调节神经元KCC2和Na + -K+-2Cl-共转运蛋白1（NKCC1）表达同时并以相反的模式1，4，16起作用。

在了解KCC2调节机制方面取得了持续和相当大的进展，认可开发使研究人员能够研究其功能和活动的技术;通过直接（评估激酶调控位点磷酸化）或间接（观察和监测GABA活性） 调查 。这里介绍的方案重点介绍了蛋白质印迹技术的应用，通过研究共转运蛋白在激酶调控位点Thr906/1007的磷酸化来研究神经元K+-Cl- 共转运蛋白KCC2的功能和活性。

蛋白质印迹是一种用于从组织或细胞样本中检测特定目标蛋白的方法。该方法首先通过电泳按大小分离蛋白质。然后将蛋白质电泳转移到固体载体（通常是膜）上，然后使用特异性抗体标记目标蛋白质。将抗体与使用比色法、化学发光法或荧光法检测的不同标签或荧光团偶联抗体偶联。这允许从蛋白质混合物中检测特定的目标蛋白质。该技术已用于表征KCCs1 的磷酸化特异性位点，并已用于鉴定抑制KCC3 Thr991 / Thr1048磷酸化的激酶抑制剂17。通过遵循该协议，可以特异性地检测细胞/组织裂解物中的总和磷酸化KCC2。原则上，通过该技术检测蛋白质偶联抗体具有很强的帮助性，因为它有助于提高对KCC2磷酸化位点合作活性的理解，从而阐明了参与其生理调节的分子机制。总蛋白表达的定量分析代表了KCC2的功能和活性。还有其他经典方法用于直接测量KCC2活性，例如铷离子和铊离子摄取测定。进一步的技术如膜片钳电生理学用于测量GABA活性;因此，间接反映活化和/或失活的KCC2，如细胞内氯离子稳态的评估所告知的。

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Protocol

注意：该方案描述了用于检测特定目标蛋白质的蛋白质印迹方法。

1. 细胞培养和转染

  1. 在细胞培养过程之前加热珠浴（37°C）中的所有试剂。准备培养基，Dulbecco的改良鹰培养基（DMEM），补充有10%胎牛血清，1%的2mM L-谷氨酰胺，100x非必需氨基酸，100mM丙酮酸钠和100单位/ mL青霉素链霉素。
  2. 解冻稳定转染的大鼠KCC2b人胚胎肾293细胞（HEK293rnKCC2b）18 在珠浴（37°C）中。将细胞从冷冻管转移到含有 5 mL 新鲜培养基的离心管中。以1200×g旋转细胞3-5分钟。
  3. 使用吸液器移液器（固定在真空泵上）吸出上清液并加入 10 mL 新鲜培养基以重新悬浮细胞。将细胞悬液转移到10厘米的培养皿板上。
  4. 将培养皿放入培养箱中，使其在37°С下在加湿的5%CO2 气氛中生长48小时。监测孵育期以确保细胞健康生长。当细胞在孵育期后达到90%以上的汇合度时，进一步分裂细胞。
  5. 从细胞培养皿中吸出旧培养基，并用 2 mL 磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 轻轻冲洗细胞。加入2mL胰蛋白酶，在室温下孵育约1-2分钟。
  6. 使用 2 mL 的完整培养基轻轻清洗培养皿中的胰蛋白酶化细胞。将 9 mL 新鲜培养基添加到新培养皿中，并将旧培养皿中的 1 mL 溶液添加到每个新培养皿中。将分裂细胞培养皿转移回培养箱48小时以达到90%汇合度≥。
  7. 在提取裂解缓冲液中的细胞之前，用二甲基亚砜（DMSO）作为对照，8μM星形孢菌素或0.5mM N-乙基马来酰亚胺（NEM）处理细胞15分钟。

2. 细胞裂解物的制备和上样

  1. 吸出培养皿上的培养基（来自转染程序）。将细胞培养物放在冰上，用冰冷的PBS清洗细胞。
  2. 吸出PBS，然后加入1.0 mL冰冷裂解缓冲液，其中含有50 mM tris-HCl（pH 7.5），1 mM乙二醇-双（β-氨基乙醚）-N，N，N′，N′-四乙酸（EGTA），1 mM乙二胺四乙酸（EDTA），50 mM氟化钠，5 mM焦磷酸钠，10 mM钠-β-甘油磷酸盐，1 mM原钒酸钠，1%（w / v）Triton X-100，0.27 M蔗糖， 1 mM 苯甲胺、0.1% （v/v） 2-巯基乙醇和 2 mM 苯甲基磺酰氟 （PMSF） 到培养皿中。
    注意：细胞收获期间裂解缓冲液的体积因培养皿尺寸而异，例如，每 1 x 10 7 细胞/100 mm 培养皿/150 cm 2 烧瓶适合 1 mL 裂解缓冲液，而每 5 x 106 细胞/60 mm 培养皿/75 cm 2 烧瓶适合 0.5 mL。
  3. 使用冷塑料细胞刮刀从培养皿底部刮下细胞，然后轻轻使用移液器将细胞悬液转移到已经在冰上的微量离心管中。在4°C下不断搅拌管30分钟。
  4. 在16，000× g 的冷离心机（4°C）中旋转细胞裂解物20分钟，从离心机中轻轻取出试管，并将其放在冰上。将上清液收集到预冷的新鲜管中并丢弃沉淀。
    注意：可能需要根据细胞类型改变离心力和时间。不过，一般准则鼓励以 16，000 x g 离心 20 分钟。但是，必须为每个实验确定这一点。例如，像白细胞这样的脆弱细胞需要非常轻的离心速度。

3. 从细胞裂解物中制备免疫沉淀剂

  1. 将 300 μL 蛋白质-G-琼脂糖移液到微量离心管中。将溶液以500× g 旋转2分钟，弃去上清液。
  2. 加入 500 μL PBS 并充分涡旋溶液。将溶液以500× g 旋转2分钟，弃去上清液。重复此步骤。
  3. 将 1 mg 抗 KCC2 Thr906 和抗 KCC2 Thr1007 抗体与 200 μL 蛋白 G-琼脂糖珠混合，并用 PBS 将体积补足至 500 μL。在4°C下在振动平台或旋转轮上摇动2小时。 用PBS清洗2次。
  4. 对整个细胞裂解物进行蛋白质定量，并向洗涤的珠子中加入1mg细胞裂解物。在4°C下在端到端旋转器中轻轻孵育2小时。 旋转珠子并用含有 150 mM 氯化钠 （NaCl） 的 PBS 洗涤 3 次。
  5. 用 200 μL PBS 洗涤免疫沉淀剂（珠子）3 倍。将最终沉淀重悬于 100 μL 1x 十二烷基硫酸锂 （LDS） 样品缓冲液中。
  6. 在室温下在转子振荡器中摇动管5分钟，并在75°C的加热块中孵育10分钟。将上样样品以11，000 x g 离心2分钟，并使用上清液上样凝胶。

4. 进行蛋白质印迹

  1. 组装浇注设备并倒入新鲜制备的8%分离凝胶（配方/制备见 表1 ）以浇铸凝胶，从浇注玻璃顶部留出约2厘米的空间。向设置中加入 200 μL 绝对异丙醇，使其在室温下静置 60 分钟。
    注意：十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）的聚丙烯酰胺凝胶配方取决于目标蛋白质的大小（表2）。因此，在确定所需的凝胶百分比之前，请记下蛋白质大小。
  2. 使用移液管去除异丙醇，并用约200μL蒸馏水仔细冲洗凝胶。加入新鲜制备的6%堆积凝胶（配方/制备见 表1 ），以填充浇注装置上约2厘米的空间。轻轻地放入孔梳中，并在室温下静置30分钟。
  3. 将灌制凝胶固定到电泳槽中。
  4. 将 30.3 g Tris 碱、144.1 g 甘氨酸和 10 g SDS 溶解在 1000 mL 蒸馏水中，制备 10x 转印缓冲液。将 10 mL 10% SDS 和 100 mL 10x 转印缓冲液加入 890 mL 蒸馏水中，制备 1 倍电泳缓冲液。
  5. 将 1x 电泳缓冲液倒入水箱中。将 5 μL 分子量标记物加载到第一个孔中，将等量的蛋白质加载到 SDS-PAGE 凝胶的每个孔中（在 18-30 μL 之间，具体取决于使用的梳子大小）。用1x LDS填充空孔，并在120 V下运行凝胶约90-120分钟。
  6. 将 58.2 g Tris 碱和 29.3 g 甘氨酸溶解在 1000 mL 蒸馏水中，制备 10x 转印缓冲液。用含有20%甲醇的1x转印缓冲液激活硝酸纤维素膜。用转印缓冲液冲洗凝胶和膜，并将它们轻轻地铺在制备堆栈上。
    注意：无需调整电泳缓冲液和转印缓冲液的pH值，因为它们应处于所需的最佳pH值。此外，建议在实验前准备这些缓冲液并将其储存在室温下以节省时间。
  7. 按以下顺序排列要转移的三明治：负极（黑框/末端）-三明治泡沫-滤纸-冲洗的SDS-PAGE凝胶-冲洗的硝酸纤维素膜-滤纸-三明治泡沫-正极（红框）。将组装好的三明治堆叠在转移罐中，并以 90 V 运行 90 分钟或 30 V 运行 360 分钟。

5. 抗体染色和图像显影

  1. 取下膜并使其干燥。在室温下，使用由含有0.1%1x 吐温20（1x TBS-T）的Tris缓冲盐水中的5%脱脂牛奶制成的封闭缓冲液封闭膜1小时。
  2. 将膜与一抗8，15，19和β-肌动蛋白（上样对照）的适当稀释液在封闭缓冲液中孵育1小时或在4°C下过夜。 在1x TBS-T的三次洗涤中洗涤膜，每次5分钟。
    注意：将单独的膜与上样对照（如β-肌动蛋白、α-微管蛋白或甘油醛3-磷酸脱氢酶抗体）孵育是为了在随后的定量过程中使其他蛋白质印迹结果标准化。每种一抗的推荐稀释度可在制造商手册中找到。
  3. 将洗涤后的膜与二抗在封闭缓冲液中稀释5000倍孵育60分钟。再次，在1x TBS-T中洗涤膜3次，每次5分钟。
    注意：强烈建议必须针对产生一抗的物种提高二抗。例如，如果总KCC2的一抗是小鼠抗KCC2，则必须使用抗小鼠的二抗。
  4. 将洗涤过的膜放在成像板上。混合等体积的每种增强化学发光（ECL）试剂，并将混合溶液轻轻地铺在膜上以产生信号。

6. 使用成像系统进行图像采集和数据量化

  1. 将成像板转移到成像系统上的相应隔间进行成像。打开计算机上的成像软件进行图像处理。
  2. 在工具栏上，单击“ 新建协议 ”，然后选择 “单通道”。单击凝胶成像/应用对话框下的 选择 ，滚动至 印迹 并选择化学 高灵敏度 或 化学高分辨率。然后单击 信号累积 设置以设置要采集的图像的持续时间和数量。
  3. 单击实验方案设置下的定位凝胶，并在必要时调整成像系统中的 凝胶 。单击 运行协议 以获取图像。
  4. 右键单击映像目录框下的其中一个采集的图像，将图像保存在计算机上。导航到所需的图像，然后单击运行对话框下的 “选择图像并继续 ”。
  5. 单击图像变换图标以调整 图像 的对比度和像素饱和度。点击 屏幕截图 常规工具栏上的图标，根据所需的图像格式将图像保存到计算机。
  6. 使用 ImageJ 软件测量条带密度，并使用适当的统计工具进行分析。

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Representative Results

在这里， 图1 中给出的代表性结果研究了星形孢菌素和NEM对使用蛋白质印迹技术稳定表达KCC2b（HEKrnKCC2b）18 的HEK293细胞系中WNK-SPAK/OSR1介导的KCC2和NKCC1磷酸化的影响。有关代表性结果的全面细节在Zhang等人15中进行了讨论。与NEM类似，星形孢菌素是一种广泛的激酶抑制剂，可以增强KCC2转运活性并抑制NKCC1活性15，20。用星形孢菌素和NEM处理HEK293细胞导致SPAK靶位点磷酸化减少 - 位于T环激酶结构域的Thr233和hsSPAK的S环磷酸化位点Ser373。因此，这两种化合物都降低了上述SPAK磷酸化位点的磷酸化水平。此外，星形孢菌素降低了HEKrnKCC2b中Ser940的磷酸化，但NEM显着增加了其磷酸化。此外，星形孢菌素降低Thr505位点的磷酸化，而NEM在同一位点引起磷酸化的轻微但微不足道的增加。两种化合物对Thr505位点的蛋白激酶C（PKC）和Ser940位点的KCC2b磷酸化的差异影响相关性良好。代表性结果还表明，两种药物都改变了总rnKCC2b，hsNKCC1或hsSPAK的表达。NEM（但不是星形孢菌素处理）导致总KCC2量的表达显着增加，而当用两种化合物处理时，总NKCC1和SPAK的表达没有显着变化。此外，这两种化合物导致SPAK在Thr233和Ser373位点的磷酸化降低，这分别与rnKCC2b和hsNKCC1中Thr906/Thr1007和Thr203/207/212位点的删节磷酸化相关。此外，星形孢菌素和NEM分别降低和增加rnKCC2b中Ser940位点PKC的磷酸化，这分别与星形孢素和NEM处理后Thr505位点PKC-δ磷酸化的减少和增加相关（图1）。

Figure 1
图 1：HEK rn KCC2b 细胞中星形孢菌素和 NEM 处理时 rn KCC2b 和 hsNKCC1 磷酸化位点的定量分析。 （A）稳定转染的HEK rnKCC2b细胞用DMSO（对照），8μM星形孢菌素或0.5mM NEM处理15分钟。收获细胞裂解物并用指定抗体进行免疫沉淀（IP）和免疫印迹（IB）。缩写：D = 二聚体 KCC2;M = 单体 KCC2。（B）稳定转染的HEKrnKCC2b细胞的免疫印迹定量。使用ImageJ软件量化条带强度。< 0.001;**p < 0.01;威尔科克森-曼恩惠特尼检验 （n = 6）。这个数字是从Zhang等人15修改而来的。请点击此处查看此图的大图。

8 mL 8% 分离凝胶 5 mL 6% 堆积凝胶
所需材料 体积（微升） 所需材料 体积（微升）
蒸馏 H2O 4200 蒸馏 H2O 2900
40%丙烯酰胺 1600 40%丙烯酰胺 750
1.5 M 三分 pH 8.8 2000 0.5 M Tris pH 6.8 1250
10% 安全数据表 80 10% 安全数据表 50
10% APS 80 10% APS 50
泰梅德 8 泰梅德 5
制作分离凝胶：
1) 从 4.2 mL 的 ddH2O 开始
2) 加入 1.6 mL 40% 丙烯酰胺/双丙烯酰胺溶液
3) 加入 2 mL 的 1.5 M Tris pH 8.8 并混合
4) 混合 80 μL 10% SDS
5) 准备使用时，加入 8 μL TEMED 并混合
6) 加入 80 μL 10% APS* 并混合
制作堆积凝胶：
1) 从 2.9 mL 的 ddH2O 开始
2) 加入 0.75 mL 40% 丙烯酰胺/双丙烯酰胺溶液
3) 加入 1.25 mL 的 0.5 M Tris pH 6.8 并混合
4) 混合 50 μL 10% SDS
5) 准备使用时，加入 5 μL TEMED 并混合
6) 加入 50 μL 10% APS* 并混合
SDS = 十二烷基硫酸钠
APS = 每硫酸铵
TEMED = N， N， Nʹ， Nʹ-四甲基乙二胺
*添加APS后，应立即将溶液倒入浇注设备中，因为溶液会在几分钟内聚合。因此，建议在需要溶液时准备分离和堆叠凝胶溶液。

表 1： 制作聚丙烯酰胺凝胶混合物（分离和堆叠凝胶溶液）的配方。

凝胶百分比（%） 蛋白质大小（千达）
最多 20 个 4 到 40
15 12 到 45
12.5 10 到 70
10 15 到 100
8 50 到 200
4 到 6 > 200

表 2： 推荐的SDS-PAGE凝胶百分比，适用于不同大小的蛋白质

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Discussion

许多方法已被用于测量在神经元中表达的CCC的SLC12的活性，包括KCC2。其中许多技术已被证明可以增强分析这些转运蛋白的功能相关性及其在不同疾病相关突变中的结构 - 功能模式的科学知识。至关重要的是，各种方法都有优点和注意事项21.然而，上面解释的方案概述了如何使用蛋白质印迹评估激酶调控位点Thr906和Thr1007的KCC2磷酸化，这有助于研究KCC2的功能和活性。

KCC2的调节是通过关键丝氨酸/苏氨酸残基的磷酸化和去磷酸化发生的1。蛋白质印迹是一种有效的技术，可用于研究 Thr906 和 Thr1007 激酶调控位点的 KCC2 磷酸化。原则上，使用针对目标免疫印迹样品/蛋白质的磷酸化肽的磷酸化特异性抗体检测KCC2磷酸化的变化。蛋白质印迹是一种用于从组织或细胞样本中检测目标特定蛋白质的方法。该方法首先通过电泳按大小分离蛋白质。然后将蛋白质电泳转移到固体载体（通常是膜）上，然后使用特异性抗体标记目标蛋白质。将抗体与使用比色法、化学发光法或荧光法检测的不同标签或荧光团偶联抗体偶联。这允许从蛋白质混合物中检测特定的目标蛋白质。该技术已用于表征KCC22，8的磷酸化特异性位点，并已用于鉴定拮抗KCC2 Thr906 / Thr1007磷酸化15的KCC2抑制剂。HEK293系列由于其在分子生物学实验中的优势而已用于多个实验。它们繁殖快，易于维护，转染和蛋白质生产效率高22。然而，一些观点认为它可能不是进行神经生物学实验的最合适候选者，因为它不是来自大脑的细胞，因此其生理特异性在神经科学研究中可能值得怀疑。然而，以前的研究表明，在HEK293细胞和实际神经元组织/细胞15，23中KCC2的表达中观察到类似的结果。因此，HEK293在神经科学研究中的相关性可能不会被完全抛弃。

在涉及通过蛋白质印迹技术分析蛋白质表达的研究中，应特别注意裂解缓冲液组合物的选择、所用去垢剂的性质（类型和浓度）24以及蛋白酶抑制剂。缓冲液的组成必须经过优化，以适应目标蛋白，以促进其增溶和提取过程，并使其易于通过蛋白质印迹25进行检测。可溶性蛋白质通常需要低浓度的温和洗涤剂，而膜蛋白可能需要更强的洗涤剂条件。然而，强力洗涤剂可能会破坏相互作用，复合物可能会丢失。洗涤剂的类型和浓度都可能影响蛋白质的性质和活性，因此，需要坚持这些洗涤剂的有限/耐受浓度范围。蛋白酶抑制剂的加入将避免目标蛋白被内源性蛋白降解，最佳推荐工作温度为4°C，有效降低蛋白水解率。有时，为了获得免疫印迹信号较差的抗体的高质量免疫印迹信号，将免疫沉淀（IP）作为蛋白质印迹的上游实验进行。该技术是有利的，因为它促进了抗原与其各自抗体在随后的分离和定量之前以其天然构象的相互作用26。因此，IP可以提高蛋白质印迹程序输出的质量。在应用IP技术之前，重要的是通过分析全细胞裂解物或通过蛋白质印迹分析起始级分来评估裂解物中免疫共沉淀伴侣蛋白的存在和表达效率。此外，在制备用于SDS-PAGE电泳的所需百分比凝胶溶液之前，必须事先了解待研究蛋白质的分子量，因为蛋白质的大小会影响凝胶基质的筛分效果。

然而，通过该技术检测蛋白质偶联抗体是非常有帮助的，因为它有助于提高对KCC2磷酸化位点合作活动的理解，这可能提供有关共转运蛋白磷酸化和可能调节共转运蛋白的信号通路完整性的信息，以便可靠地预测共转运蛋白活性。然而，需要注意的是，蛋白质印迹技术只能产生半定量数据，这意味着该技术仅强调蛋白质表达的相对评估，而不是绝对定量。这被认可为不同泳道中样品装载和转移速率的差异，这些差异在各个印迹上是不同的。检测到的信号也不是线性的，不能反映样品27的浓度范围。此外，磷酸化状态可能不是报告蛋白质活性的可靠因素，因为抑制剂、突变和蛋白质与其环境的相互作用等干预措施可以直接影响蛋白质活性，而不会改变其磷酸化水平28，29，30。因此，使用磷酸化特异性抗体来补充其他生化方法可能更有益。

如前所述，还有其他经典方法用于直接测量KCC2活性。通过测量通过均质细胞制剂膜的放射性86Rb+通量来评估KCC2是一种流行的方法。该方法使用活性放射性同位素作为示踪剂，通过离子通道。简而言之，将感兴趣的细胞在无阳离子溶液中孵育以抑制内源性KCC2，然后与特定抑制剂（例如ouabain）孵育，然后与含有抑制剂和86Rb +的摄取培养基孵育。液体闪烁计数器用于测量/追踪细胞裂解后的活动。不过，这种方法具有稳健性、高灵敏度和选择性，并且不易受到干扰。然而，其应用并未扩展到具有多种细胞类型的组织，如脑或神经元培养物。此外，该技术限制了亚细胞水平离子浓度分辨率的变化。此外，使用具有高能量发射（最大1.77 MeV;最大1.08 MeV）的短半衰期（18.65天）放射性同位素的潜在毒性和健康危害也存在安全问题31。这可能在很大程度上表明不适合通常需要大量细胞的神经元细胞研究。这些问题导致Terstappen 1999开发了非放射性85Rb+外排测定法，作为放射性86Rb+测定离子通量的替代品。非放射性方法极大地放逐了用于分析制药行业中K+和非选择性阳离子通道的放射性86Rb+测定31。非放射性85Rb+外排测定涉及两个主要过程，第一个是细胞培养和操作，第二个是通过原子吸收光谱（AAS）测定示踪铷。这种方法易于使用，但是，它确实需要许多测定验证实验，并且存在较差的时间分辨率32。然而，非放射性85Rb+外排测定已逐渐被证明是评估KCC和NKCC的可靠技术33。

铊 （TI+） 通量测定使用 TI+ 作为 K+ 的替代离子，因为它与 KCC2 和 NKCC2 上的 K+ 位点具有高结合亲和力。TI +流入细胞可以使用铊敏感荧光染料（如苯并噻唑香豆素和氟尿津-2）来检测。一旦通过通道运输，TI+可能与BTC / 氟尿津-2染料结合，引起荧光成像板读数器31可以检测到的荧光变化。TI+指示染料以乙酰氧基甲酯的形式进入细胞，然后被细胞质酯酶切割以释放活性荧光形式。为了激活KCC，在存在或不存在测试化合物（例如KCC2抑制剂）的情况下，用K +和Tl+的混合物刺激细胞。铊进入并与荧光染料结合。荧光信号的增加与Tl+通过共转运蛋白流入细胞成正比，因此代表了共转运蛋白活性的功能测量。该方法在测量各种类型的细胞培养物中的KCC2和NKCC2活性方面也得到了很好的应用，例如，对稳定表达人KCC234的HEK293细胞系的研究。在缺点方面，存在多种潜在的脱靶途径系可能会干扰TI +内流，例如，HEK293细胞中的Na + / K + ATP酶可能导致更高的假阳性或假阴性命中率35。此外，与其他通量测定一样，由于多次洗涤步骤后神经元细胞的存活率低，这种方法在神经元细胞中的实施仍然有限。多个K+通道和转运蛋白的神经元表达也会阻碍KCC2特异性K+通量的准确评估。该技术为研究小神经元区室中的通道（例如树突和树突棘）以及轴突中的通道提供了局限性，这是由于缺乏空间分辨率和低时间分辨率。

进一步的技术如膜片钳电生理学用于测量GABA活性;因此，间接反映活化和/或失活的KCC2，如细胞内氯离子稳态的评估所告知的。通常，SLC12功能的电生理测量依赖于GABAA受体（GABAAR）可渗透氯化物36的原理。KCC2是调节GABA能抑制的关键。特别是，KCC2的[Cl-]i挤出活性是GABAAR6超极化的基础。细胞内记录通过从GABAAR介导的电流（EGABA）的潜力逆转中推断KCC2的氯化物挤出能力提供了重要的见解。超极化EGABA表示较低的[Cl-]i，因此KCC2的活性增加。电生理学中的短杆菌肽膜片钳技术是测量GABA活性的金标准方法。一些先前发表的研究已使用短杆菌肽膜片钳记录来研究KCC2的功能和活性，以评估/监测[Cl-]i稳态确实被证明是成功的8，9，37，38，39，40.在短杆菌肽膜片钳记录期间，使用具有相对贴片的玻璃电极在细胞/组织表面上创建紧密密封，以记录离子通道的细胞内活性，参考细胞/组织周围浴中的另一个电极。该技术可以通过在电压钳模式下以固定电压测量穿过细胞膜的电流量或通过记录在电流钳模式36下以固定电流穿过膜的电压量来执行。可以应用基本技术的几种变体，这在很大程度上取决于研究问题。该技术不会创建相对较大的孔样全细胞贴片记录，但电极溶液中包含的孔形成抗生素（短杆菌肽）用于在膜36中形成小孔。特别是，短杆菌肽的添加在膜中产生阳离子选择性孔，其表现出微不足道的阴离子渗透性。电压斜坡协议是在稳定电压下记录电流的有效且可靠的替代方案。通过电压斜坡协议获得的电流/电压关系似乎可以更好地记录GABAAR介导的膜电流。在该协议中，施加不断变化但受监控的电压（以稳定速率），并同时不断测量电流36，41。在此协议期间，电压脉冲（通常在超极化方向）的应用用于激活由于欧姆响应而导致的泄漏电流。通常，GABAAR介导的膜电流是根据泄漏电流（即减去泄漏的激动剂电流的反转电位）计算的36。从该协议获得的电流 - 电压关联有助于更好地了解在涉及GABA A受体通道的实验方案中离子浓度变化的位置。Yelhekar等人41使用计算模型表明，从插值法得出的稳定离子浓度的结论可能不合理，因为该方法估计的反转电位可能不正确。

大多数记录使用的平均电阻为5 MΩ。电阻较低（3-4 MΩ）的移液器可能导致较低的串联电阻，这更适合电压钳位记录。然而，对于更高阻力的移液器，移液器的吸头会相对较宽，因此，它以难以形成密封和稳定性的形式提出了挑战36，42。因此，有必要监测GΩ的形成以获得记录，同时大大降低生成的噪声数据水平。该技术在研究KCC2的功能和活性方面的稳健性，根据其在测量GABA活性方面的适用性和可靠性来判断，已被几项研究证实。先前的研究表明，[Cl-]i通过测量GABAAR（能够门禁氯化物电导）对其各自激动剂的反应，使用这种技术保持稳定。这意味着，连续电接入伴随着细胞内氯化物浓度43，44的很少或没有改变。此外，该技术有助于规避GABAAR活化期间膜电位和EGABA的人为变化（打开氯化物和碳酸氢盐电导）45。上述技术使该技术领先于其他类型的电生理学记录。然而，该技术的局限性包括：（1）由于电极尖端占据膜的一部分，可能会产生频繁的记录噪声，这可能会降低电流分辨率，以及（2）用短杆菌肽穿孔膜通常需要相对较长的时间。

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Disclosures

作者没有什么可透露的。

Acknowledgments

这项工作得到了英国皇家学会（Grant no. IEC\NSFC\201094）和英联邦博士奖学金的支持。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
40% acrylamide Sigma-Aldrich A2917 Used to make seperating and stacking gel for SDS-PAGE 
Ammonium Per Sulfate Sigma-Aldrich 248614 Used to make seperating and stacking gel for SDS-PAGE 
anti pSPAK Dundee University S670B Used as primary antibody for western blotting
anti-KCC2 Dundee University S700C Used as primary antibody for western blotting
anti-KCC2 pSer940 Thermo Fisher Scientific PA5-95678 Used as primary antibody for western blotting
anti-KCC2 pThr1007 Dundee University S961C Used as primary antibody for western blotting
anti-KCC2 pThr906 Dundee University S959C Used as primary antibody for western blotting
anti-mouse Cell Signalling technology 66002 Used as secondary antibody for western blotting
anti-NKCC1 Dundee University S841B Used as primary antibody for western blotting
anti-NKCC1 pThr203/207/212 Dundee University S763B Used as primary antibody for western blotting
anti-rabbit Cell Signalling technology C29F4 Used as secondary antibody for western blotting
anti-sheep abcam ab6900 Used as secondary antibody for western blotting
anti-SPAK Dundee University S669D Used as primary antibody for western blotting
anti-β-Tubulin III Sigma-Aldrich T8578 Used as primary antibody for western blotting
Benzamine Merck UK 135828 Used as component of lysis buffer
Beta-mercaptoethanol Sigma-Aldrich M3148 Used as component of loading buffer and lysis buffer
Bradford Coomasie Thermo Scientific 1856209 Used for lysate protein quantification
Casting apparatus Atto  WSE-1165W Used to run SDS-page electrophoresis
Centrifuge Eppendorf 5804 Used in lysate preparation
Centrifuge VWR MicroStar 17R Used for spinning samples
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich D2650-100ML Used for cell culture experiment
Dried Skimmed Milk Marvel N/A Used to make blocking buffer
Dulbecco's Modified Eagle's Medium - high glucose Sigma-Aldrich D6429 Used for cell culture
ECL reagent Perkin Elmer ORTT755/2655 Used to develop image for western blotting
EDTA Fisher Scientific D/0700/53 Used as component of lysis buffer
EGTA Sigma-Aldrich e4378 Used as component of lysis buffer
Electrophoresis Power Supply BioRad PowerPAC HC To supply power to run SDS-page electrophoresis
Ethanol ThermoFisher E/0650DF/17 Used for preparing sterilized equipments and environment
Fetal Bovine Serum -  heat inactivated Merck Life Sciences UK F9665 Used for cell culture
Fumehood Walker A7277 Used for cell culture
Gel Blotting - Whatman GE Healthcare  10426981 Used in western blotting to make transfer sandwich
Glycine Sigma-Aldrich 15527 Used to make buffers
GraphPad Prism Software GraphPad Software, Inc., USA Version 6.0 Used for plotting graphs and analysing data for  western blotting
HCl Acros Organics 10647282 Used to make seperating and stacking gel for SDS-PAGE 
Heating block Grant QBT1 Used to heat WB loading samples
HEK293 cells Merck UK 12022001-1VL Cell line for culture experiment
ImageJ Software Wayne Rasband and Contributors; NIH, USA  ImageJ 1.53e Used to measure band intensities from western blotting images
Imaging system BioRad ChemiDoc MP Used to take western blotting images
Incubator LEEC LEEC precision 190D Used for cell culture
Isopropanol Honeywell 24137 Used in casting gel for electrophoresis
L-glutamine solution Sigma-Aldrich G7513 Used for cell culture
Lithium dodecyl sulfate (LDS) Novex NP0008 Used as loading buffer for western blotting
MEM Non-essential amino acid  Merck Life Sciences UK M7145 Used for cell culture
Microcentrifuge Eppendorf 5418 Used for preparing lysates for WB
Microplate reader BioRad iMark Used for lysate protein concentration readout
Microsoft Powerpoint Microsoft, USA PowerPoint2016 Used to edit western blotting images
Molecular Weight Marker BioRad 1610373 Used for western blotting
N-ethylmaleimide Thermo Fisher Scientific 23030 Used for cell culture experiment
Nitrocellulose membrane Fisher Scientific 45004091 Used for western blotting
Penicillin-Streptomycin Gibco 15140122 Used for cell culture
pH Meter Mettler Toledo Seven compact s210 Used to monitor pH of buffer solutions
Phenylmethylsulfonylfluoride (PMSF) Sigma-Aldrich P7626 Used as component of lysis buffer
Phosphate Buffer Saline Sigma-Aldrich D8537 Used for cell culture
PKCδ pThr505 Cell Signalling technology 9374 Used as primary antibody for western blotting
Sepharose Protein G Generon PG50-00-0002 Used for immunoprecipitation
Sodium chloride Sigma-Aldrich S7653 Used as component of wash buffer
Sodium Chloride Sigma-Aldrich S7653 Used to prepare TBS-T buffer
Sodium Dodecyl Sulfate Sigma-Aldrich L5750 Used to make seperating and stacking gel for SDS-PAGE 
sodium orthovanadate Sigma-Aldrich S6508 Used as component of lysis buffer
Sodium Pyruvate Sigma-Aldrich S8636 Used for cell culture
sodium-β-glycerophosphate Merck UK G9422 Used as component of lysis buffer
Staurosporine (from Streptomyces sp.) Scientific Laboratory Supplies, UK S4400-1MG Used for cell culture experiment
Sucrose Scientifc Laboratory Supplies S0389 Used as component of lysis buffer
TEMED Sigma-Aldrich T7024 Used to make seperating and stacking gel for SDS-PAGE 
Transfer Chamber BioRad 1658005EDU Used in western blotting to transfer protein on membrane
Tris Sigma-Aldrich T6066 Used to make seperating and stacking gel for SDS-PAGE 
Triton-X100 Sigma-Aldrich T8787 Used as component of lysis buffer
Trypsin-EDTA Solution Merck Life Sciences UK T4049 Used for cell culture
Tween-20 Sigma-Aldrich P3179 Used as make TBS-T buffer
Vacuum pump Charles Austen Dymax 5 Used for cell culture
Vortex Scientific Industries K-550-GE Used in sample preparation
Vortex mixer Scientific Industries Ltd Vortex-Genie  K-550-GE Used of mixing resolved sample
Water bath Grant Instruments Ltd. (JB Academy) JBA5 Used to incubate solutions

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References

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生物化学，第190期，
使用蛋白质印迹法研究神经元K-Cl共转运蛋白KCC2的功能和活性
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Josiah, S. S., Meor Azlan, N. F., Oguro-Ando, A., Zhang, J. Study of the Functions and Activities of Neuronal K-Cl Co-Transporter KCC2 Using Western Blotting. J. Vis. Exp. (190), e64179, doi:10.3791/64179 (2022).

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