دروسوفيلا مراقبة النشاط (DAM): طريقة لقياس النشاط الحركي في الذباب

Overview

يصف هذا الفيديو نظام مراقبة نشاط Drosophila (DAM) المستخدم لتتبع النشاط الحركي. يستخدم الباحثون بيانات النشاط التي تم جمعها من السد لدراسة الإيقاعات الإيقاعية في ذباب الفاكهة. يظهر مقطع البروتوكول المميز كيفية تحميل الذباب في الجهاز وتسجيل بيانات النشاط للتجارب الإيقاعية.

Protocol

هذا البروتوكول هو مقتطف من تشيو وآخرون.  

1. تحميل الذباب في أنابيب النشاط ونظام رصد النشاط الحركي

1. قبل تحميل الذباب في أنابيب النشاط، قم بتشغيل الحاضنات التي سيتم استخدامها لإيواء مراقبي النشاط. ضبط درجة الحرارة باستخدام عناصر التحكم الحاضنة وتعيين نظام الضوء / الظلام باستخدام وحدة تحكم ضوء نظام DAM أو الحاضنات الخاصة نظام التحكم في الضوء وفقا للتصميم التجريبي المطلوب. يجب أن يكون الوقت اللازم لتحميل الذباب في أنابيب النشاط كافيا لتثبيت درجة الحرارة.
2. تخدير الذباب بثاني أكسيد الكربون.
3. استخدم فرشاة طلاء ناعمة لنقل ذبابة واحدة برفق إلى أنبوب نشاط.
4. الاستيلاء على منتصف قطعة واحدة من الغزل الذي هو حوالي نصف بوصة مع ملقط غرامة وإدراج الغزل في نهاية غير الغذاء من أنبوب النشاط لسد الفتحة ومنع الذبابة من الهروب خلال التجربة، وفي الوقت نفسه السماح تدفق الهواء في الأنبوب. بدلا من ذلك، يمكن استخدام القبعات البلاستيكية مع ثقوب صغيرة (Trikinetics، وشركة) لإغلاق الفتحة.
5. تأكد من وضع الأنابيب على جوانبها حتى تستيقظ الذبابة ، وإلا هناك خطر من أن تتعثر الذبابة في الطعام.
6. أدخل الأنابيب في شاشات النشاط. مع أحدث, نموذج أكثر إحكاما من شاشات Trikinetics (TRIKINETICS DAM2 و DAM2-7), فمن الضروري لعقد الأنابيب في مكان مع الأربطة المطاطية لضمان أن شعاع الأشعة تحت الحمراء يمر أنبوب في موقف المركز.
7. وضع مراقبي النشاط في الحاضنات وربطها بنظام جمع البيانات عبر أسلاك الهاتف. تحقق باستخدام برنامج تجميع نظام DAM للتأكد من توصيل جميع الشاشات بشكل صحيح ويتم جمع البيانات من كل منها. تنبعث من الشاشة شعاع ضوء الأشعة تحت الحمراء عبر مركز كل أنبوب نشاط زجاجي. يتم تسجيل النشاط الحركي للذباب كبيانات ثنائية خام حيث يتم تسجيل "واحد" في كل مرة يتم فيها كسر شعاع الأشعة تحت الحمراء أو يتم تسجيل "صفر" حيث لا يتم كسر شعاع الأشعة تحت الحمراء.

2. التصميم التجريبي لتسجيل البيانات لتحديد دورية واتساع Circadian

1. تتم مزامنة الذباب وentrained من خلال تعريضها للضوء / الظلام المطلوب (LD) ونظام درجة الحرارة لمدة 2-5 أيام كاملة. الشرط entrainment الأكثر استخداما هو دورة خفيفة / مظلمة من 12 ساعة ضوء / 12 ساعة الظلام (12:12 LD) في 25 درجة مئوية. ويستند هذا الشرط القياسية المقبولة عموما أساسا على فكرة أن Drosophila نشأت من المواقع الاستوائية الأفريقية. عند دراسة الإيقاعات circadian هناك بعض العبارات التي يحتاج المرء إلى أن تصبح مألوفة مع. ذات الصلة بهذا البروتوكول، يتم تعريف الوقت عندما تضيء الأضواء في الحاضنة كما zeitgeber الوقت 0 (ZT0) وجميع الأوقات الأخرى هي نسبة إلى تلك القيمة (على سبيل المثال، في دورة LD 12:12، ZT12 هو الوقت عندما يتم إيقاف تشغيل الأضواء). تحت معيار 12:12 شروط LD, نوع البرية Drosophila melanogaster عادة ما تظهر اثنين من نوبات النشاط; واحد تركزت حول ZT0 يطلق عليها "صباح" الذروة وآخر حول ZT12 يطلق عليها "مساء" الذروة (الشكل 1A). يتم التحكم في نوبات الصباح والمساء من خلال الساعة الذاتية ولكن هناك أيضا استجابات "الذهول" التي هي رشقات نارية عابرة من النشاط استجابة للتحولات الخفيفة / المظلمة. يومين من التدريب هو الحد الأدنى ويمكن استخدامها، على سبيل المثال، في الشاشات الكبيرة التي هي أكثر استهلاكا للوقت وموجهة نحو قياس فترات التشغيل الحر في ظلام دامس (انظر أدناه، الخطوة 2). ومع ذلك، إذا كنت مهتما في دراسة أنماط النشاط خلال دورة ضوء الظلام اليومي، فمن الأفضل للحفاظ على الذباب لمدة 4-5 أيام في LD وذلك للحصول على مزيد من البيانات. في الأساس ، فإن زيادة عدد الذباب أو عدد أيام LD في تحليل البيانات النهائي (على سبيل المثال ، بيانات المجمع من اليومين الماضيين بقيمة نشاط LD الحركي) ستولد ملامح وقياسات أكثر موثوقية للنشاط اليومي (على سبيل المثال ، توقيت الذروة الصباحية أو المسائية). علاوة على ذلك ، يختلف التوزيع اليومي للنشاط كدالة طول اليوم (photoperiod) ودرجة الحرارة. أحد الأسباب الرئيسية لتغيير الضوء أو درجة الحرارة من المعيار هو إذا أراد المرء دراسة كيفية خضوع أنماط النشاط اليومي للتكيف الموسمي (على سبيل المثال تشن وآخرون ، كولد سبرينغ هارب سيمب كوانت بيول. (2007)). Drosophila يمكن أيضا أن تكون مدربة على دورات درجة الحرارة اليومية (على سبيل المثال غلاسر وستانوسكي، كور بيول. (2005); سيهادوفا وآخرون، الخلايا العصبية (2009)). دورات درجة الحرارة التي تختلف فقط 2-3 درجة مئوية كافية لإيقاعات النشاط entrain.
2. يتم قياس إيقاعات النشاط الحركي الحر في ظل ظروف مظلمة ودرجة الحرارة المستمرة بعد انتهاء فترة التدريب (انظر أعلاه، الخطوة 1). يمكن تغيير الإعداد لدورة الضوء في أي وقت في المرحلة المظلمة في اليوم الأخير من LD بحيث يمثل اليوم التالي من التجربة اليوم الأول من DD. سبعة أيام من جمع بيانات DD كافية لحساب الفترة الإيقاعية والسعة (على سبيل المثال ، قوة أو قوة الإيقاع) من الذباب. بشكل عام ، من الضروري وجود عينة من حجم الذباب لا يقل عن 16 للحصول على فترات تشغيل حر موثوق بها لنوع وراثي معين. حتى لو كان المرء مهتما فقط بقياس النشاط اليومي ، فلا يزال من الأفضل قياس فترات التشغيل الحر للذباب في DD حيث أن التغييرات في الفترة الداخلية يمكن أن تغير التوزيع اليومي للنشاط في LD. فعلى سبيل المثال، عادة ما يعرض الذباب ذو الفترات الداخلية الطويلة قمم مسائية متأخرة في LD (على سبيل المثال، انظر الشكل 2).
3. في ختام التجربة، يتم تنزيل البيانات الثنائية الخام التي تم جمعها باستخدام برنامج نظام DAM على جهاز تخزين بيانات محمول، على سبيل المثال مفتاح USB.
4. تتم معالجة البيانات الثنائية الخام باستخدام دام Filescan102X (Trikinetics, Inc.) وتلخيصها في صناديق 15 و 30 دقيقة عند تحليل المعلمات circadian، أو صناديق 1-5 دقيقة عند تحليل معلمات النوم / الراحة. حاليا، خمس دقائق متجاورة من الخمول هو التعريف القياسي للنوم / الراحة في دروسوفيلا (هندريكس وآخرون، الخلايا العصبية (2000)؛ هو وسهغال، أساليب إنزيمول، (2005)).
5. هناك العديد من الطرق المختلفة لتحليل البيانات التي تم جمعها على نظام DAM ولكننا لن نقدم سوى تلك الأساليب المستخدمة بشكل روتيني في مختبرنا. يستخدم Microsoft Excel لتعيين النمط الجيني لمجموعات نماذج مختلفة. برنامج FaasX (M. Boudinot و F. Rouyer، المركز الوطني للبحوث Scientifique، Gif-sur-Yvette Cedex، فرنسا) أو الأرق (برنامج قائم على ماتلاب؛ ليزلي أشمور، جامعة بيتسبرغ، السلطة الفلسطينية) تستخدم لفحص معلمات circadian (مثل الفترة والطاقة) أو النوم / الراحة (على سبيل المثال نسبة النوم، متوسط طول نوبة الراحة) على التوالي.

Representative Results

الشكل 1: الرسوم البيانية الاستئصالية المتولدة باستخدام FaasX تظهر إيقاعات النشاط الحركي اليومي للذباب البري الإيقاعي (ث لكل⁰ ذباب يحمل متحولا لكل + ) (A و B) مقابل w غير نظمي لكل^{0 متحولات} (C و D). تم الاحتفاظ الذباب الذكور في 25 درجة مئوية وentrained لمدة 4 أيام في 12:12 LD (ضوء: الظلام) دورات تليها سبعة أيام في DD (الظلام المستمر). بالنسبة لكل خط طيران، تم قياس مستويات النشاط الحركي للذباب الفردي (n>32) في صناديق مدتها 15 دقيقة ثم تم قياسها في المتوسط للحصول على ممثل ملف تعريف المجموعة لهذا الخط. A و C إظهار بيانات النشاط التي تم إنشاؤها من متوسط اليومين الثاني والثالث في دورة الضوء / الظلام (LD 2-3) في حين B و D إظهار بيانات النشاط المتولدة من متوسط اليومين الثاني والثالث في ظلام دامس (DD 2-3). تمثل الأشرطة العمودية النشاط (في وحدات عشوائية) المسجلة في صناديق لمدة 15 دقيقة خلال فترة الضوء (رمادي فاتح) أو الفترة المظلمة (الرمادي الداكن). أشرطة أفقية في الجزء السفلي من الرسوم البيانية LD eduction؛ أبيض, أضواء على; أسود، أضواء قبالة. ZT0 و ZT12 تمثل بداية ونهاية photoperiod على التوالي. للرسوم البيانية DD eduction؛ يمثل CT0 وCT12 بداية ونهاية اليوم الذاتي في ظروف مظلمة ثابتة ، يشار إليها بالشريط الرمادي. في لوحة A, M = ذروة الصباح; E = ذروة المساء. تمثل الأسهم الموجودة في اللوحة A السلوك الاستباقي للقمم الصباحية والمسائية الملاحظة في الذباب البري من النوع ، والتي تكون غائبة في w لكل⁰ ذباب غير هكيمي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2: مخطط مزدوج تم إنشاؤه باستخدام برنامج FaasX يوضح بيانات النشاط الحركي للذباب ذي النوع البري أو القصير أو الطويل. تم الاحتفاظ الذباب الذكور في 25 درجة مئوية وentrained لمدة 4 أيام في 12:12 دورات LD تليها ثمانية أيام في الظلام المستمر (DD) لحساب فترة التشغيل الحر (ر) باستخدام دورة P في FaasX. ثلاثة خطوط طيران مع فترة نوع البرية [ث لكل⁰؛ لكل +; لكل⁰ متحولة تحمل لكل + transgene] ، فترة طويلة [ث لكل⁰؛ لكل (S47A) ؛ لكل⁰ متحولة تحمل لكل (S47A) transgene] ، وفترة قصيرة [ث لكل⁰؛ لكل (S47D) ؛ لكل⁰ متحولة تحمل لكل (S47D) transgene] تظهر هنا (تشيو وآخرون 2008). يمثل المحور X ZT أو وقت CT في LD أو DD على التوالي، ويمثل المحور ص عدد الأنشطة (الوحدات التعسفية) التي تم تجميعها في صناديق مدتها 15 دقيقة. تربط الخطوط الحمراء المنقطة قمم المساء لكل يوم من التجارب. لاحظ أنه خلال LD يتم "إجبار" ذروة المساء على الحفاظ على التزامن مع دورة LD 24 ساعة ، في حين أن فترة التشغيل الحر في DD يمكن أن تنحرف عن 24 ساعة. على سبيل المثال، بالنسبة للذباب ذات الفترات القصيرة، سيحدث توقيت النشاط المسائي في وقت سابق من كل يوم متعاقب في DD (عندما يتم رسمه مقابل مقياس زمني 24 ساعة، كما هو موضح هنا)، في حين يتم ملاحظة التحول إلى اليمين للذباب لفترات طويلة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Drosophila activity monitor (DAM)	Trikinetics Inc.; Waltham, MA	DAM2 or DAM5	DAM2 monitors are more compact, and more can fit into a single incubator
Power supply interface unit (for DAM system)	Trikinetics Inc.; Waltham, MA	PSIU9	Includes PS9-1 AC Power Supply
Light controller	Trikinetics Inc.; Waltham, MA	LC6
Pyrex glass tubes	Trikinetics Inc.; Waltham, MA	PGT5, PGT7, and PGT10
Plastic activity tube caps	Trikinetics Inc.; Waltham, MA	CAP5	Yarn can be used instead of plastic caps.
DAM System data collection software	Trikinetics Inc.; Waltham, MA		Versions available for both Mac and PC
FaasX software	Centre National de la Recherche Scientifique		Only for Mac
Insomniac 2.0 software	University of Pittsburgh School of Medicine		Runs on Matlab. Can be used on both PC and Macintosh.
Environmental incubator with temperature and diurnal control, e.g. Percival incubator	Percival Scientific, Inc.	I-30BLL	Interior space dimension:Width: 65cm;Height: 86cm;Depth: 55cm
Environmental incubator with temperature and diurnal control, e.g. DigiTherm Heating/Cooling Incubator with Circadian Timed Lighting and Timed Temperature	Tritech Research, Inc.	05DT2CIRC001	Interior space dimension:Width: 36m;Height: 56m;Depth: 28cm
APC Smart-UPS 2200VA 120V (Emergency power backup unit)	APC	SU2200NET	Output Power Capacity of 1600 Watts
Sucrose	Sigma-Aldrich	S7903
Bacto Agar	BD Biosciences	214010
TissuePrep Paraffin pellets	Fisher Scientific	T565	Melting point 56 °C-57 °C
Block heater	VWR international	12621-014