Summary
Tavşan diz ekleminde kıkırdak defektlerinin tedavisi için bir deney tekniği tarif edilmektedir. Bir matris üzerinde numaralı seribaşı otolog kondrosit implantasyonu tatmin edici uzun vadeli sonuçlar sağlayan eklem kıkırdağı lezyonların yeniden ve onarım için bir iyi kabul edilen bir yöntemdir. Matrix destekli otolog kondrosit transplantasyonu (MACT) bir standart ve klinik olarak kurulan implantasyon yöntem sunmaktadır.
Abstract
Eklem kıkırdağı kendini rejenerasyon 1 için sınırlı bir kapasiteye sahiptir çünkü eklem kıkırdağı kusurları önemli bir sağlık sorunu olarak kabul edilir. Tedavi edilmeyen kıkırdak lezyonları devam eden ağrıya yol, olumsuz yaşam kalitesini etkileyen ve osteoartrit için zemin hazırlayabilir. Son on yıl boyunca, çeşitli cerrahi tekniklerin bu lezyonların tedavisi için geliştirilmiştir. Ancak, şimdiye kadar hyalin kıkırdak ile defekt kapsayan veya tatmin edici uzun vadeli iyileşme 2-4 sağlama açısından tam bir onarım elde etmek mümkün değildi. Bu nedenle, eklem kıkırdağı yaralanmaları gibi Doku Mühendisliği gibi rejeneratif teknikler için önemli bir hedef olmaya devam etmektedir. Genellikle lifli ya da fibröz kıkırdak dokusu oluşumuna yol açan diğer cerrahi tekniklerin aksine, doku mühendisliği tam olarak nakledilen hücrelerin kondrojenik potansiyel kullanarak orijinal eklem kıkırdağının kompleks yapısı ve özellikleri geri amaçlamaktadır. Recent gelişmeler rejeneratif kıkırdak tedaviler için umut verici olanaklar açtı.
Tam kat kıkırdak veya osteokondral lezyonlarının tedavisi için ilk hücre bazlı yaklaşım klinik otolog kondrosit implantasyonu (ACI) 5 öncülük Lars Peterson ve Mats Brittberg tarafından 1994 yılında yapıldı. Bugün, tekniği klinik hatta 10 ila 20 yıl implantasyon 6 sonra iyi klinik sonuçlar bakımı, diz büyük kıkırdak defektleri tedavisi için iyi kurulmuştur. Son yıllarda, otolog kondrosit implantasyonu hızlı bir ilerleme yapıldı. Hücreler daha sonra dikilmiştir edildiği bir yapay üç boyutlu kolajen matrisin kullanımı daha popüler 7-9 oldu.
MACT iki cerrahi işlemler oluşmaktadır: kondrosit toplamak için, İlk olarak, kıkırdak biyopsi t olmayan bir ağırlık taşıyan kıkırdak alanından yapılması gerekiro diz eklemi. Daha sonra, kondrosit, çıkarılan saflaştırılmış ve in vitro yeterli hücre sayısı için genişletilmiş edilmektedir. Kondrositler, daha sonra, üç boyutlu bir matris üzerine ekilir ve daha sonra yeniden implante edilebilir. Bir doku mühendisliği implant hazırlarken, çoğalma hızı ve farklılaşma kapasitesi başarılı bir doku rejenerasyonu 10 için çok önemlidir. Bir cep taşıyıcı olarak üç boyutlu bir matrisin kullanılması, bu hücresel özellikleri 11 desteklemek için düşünülmektedir.
Aşağıdaki protokol özetlemek ve kıkırdak biyopsi gelen kondrosit izolasyonu için bir teknik, bir 3D-matrix (Chondro-Gide, Geistlich Biomaterials, Wollhusen, İsviçre) üzerine in vitro ve tohumlama kendi çoğalması gösterecektir. Son olarak, bir tavşan diz ekleminin yapay olarak oluşturulmuş kıkırdak zararların içine hücre-matriks-yapıları arasında implantasyon tarif edilecektir. Bu teknik, deneysel ortamda olarak kullanılabilirkıkırdak onarım daha fazla deneyler için.
Protocol
A. Kıkırdak Biyopsi (Ameliyathane, Steril olmayan Hazırlık Odaya 1-5 Steps)
- Doğru doz ilaç edebilmek için ve ameliyat sonra ağırlık izlemek için tavşan (6 aylık Yeni Zelanda Beyaz tavşan, kadın, 3.5-4.0 kg vücut ağırlığı,) son bir kilo kontrolü yapın.
- 10 mg / kg propofole intravenöz enjeksiyonu ile anestezi neden tavşana.
- Entübasyon sonra, 1.5 mg / kg / dk propofol ve intravenöz 0.05 mg / kg fentanil ile anestezi korumak. Kapnografi, pulse oksimetre ve nabız ile anestezi izleyin.
- Bir elektrik kesme makinesi ve vakum kürk ile ameliyat olmak için diz tıraş.
- Iyice traş diz dezenfekte ve steril bir sargı ile tavşan geri kalanı kapsar.
- Patella palpe ve patella medial bir cilt kesisi gerçekleştirin.
- Steril koşullar altında bir medial parapatellar artrotomi ile diz eklemi açın. Herhangi bir küçük su kesme kaçınınişlem sırasında yüzeyel kan damarları.
- Yanal patella yerinden.
- Herhangi bir anomali ve makroskobik kıkırdak lezyonları için diz eklemi kontrol edin.
- Dikkatlice steril bir neşter (Şekil 1) ile Trochlea osis femoris dışında küçük kıkırdak parçaları (2-3 mm) kabuğu.
- Hemen tam ortam ile 50 ml'lik bir tüp içine bu kıkırdak biyopsisi yerleştirmek (DMEM +% 10 fetal buzağı serumu (FCS) ve% 1 penisilin / streptomisin (pen / strep)) işleminden sonra in vitro kültür sağ ile devam etmektedir.
- Kusurları temiz ve steril serum fizyolojik ile yıkayın.
- Trochlea oluk içinde Patella yerleştirin.
- Tek bir düğme dikiş (4-0 vicryl) ve sürekli bir cilt sütür (4-0 Monocryl) ile kat yara kapatma. Emilebilir dikiş malzemesi kullanın.
- Son olarak, su buharı geçirgen soyunma bir sprey ile yara mühür.
In vitro kültür B.
- Biyopsi c Sürecien kısa zamanda steril bir laminer akış doku kültürü kaputu ameliyat sonrası artilage adet.
- Oda sıcaklığında 3 dakika boyunca 500 x g'de santrifüj ile daha sonra PBS içinde steril hasat edilmiş kıkırdak 2x yıkayın.
- 30 dakika boyunca 1 mm 3, bir 50 ml Falcon transfer parçalar halinde kesilmiş ve kıkırdak 10 mi tripsin-EDTA (% 0.25) ve 10 ml PBS ile 30 dakika süreyle bir çalkalayıcı içinde sindirirler
- 30 dakika sonra tam ortam eklenerek tripsinizasyon dur. Daha sonra, serum içermeyen ortam içinde bir kollajenaz (0.21 U / mg), (DMEM +% 1 Pen / Strep) ile 12 saat boyunca başka kıkırdak parçaları sallayın.
- Oda sıcaklığında 3 dakika boyunca 170 x g'de santrifüj edilen çözelti.
- 5 ml tam ortam içinde hücre topakları yeniden süspanse edin.
- Tohum 5 ml tam ortam içinde ve 37 ° C'de nemlendirilmiş bir doku kültürü inkübatöründe tutmak ° C,% 5 CO2 içinde 25 cm2 doku kültürü şişeleri için, izole edilmiş kondrositler.
- % 80 arasında bir yoğunluğa kondrosit büyütün.
- Hücrelerin F bırakın3 dakika boyunca% 0.05 tripsin-EDTA ile maruz kalmadan önce PBS 2x yıkanarak ROM şişeler. Kondrositler ayırmak sonra, 10 ul komple ortam ilave trypsinization dur.
- Tam orta 300 xg (3 dk) ve tekrar süspansiyon pelet de süspansiyon santrifüj.
- Doku kültürü şişeleri (75 cm2) ve 1:3 arasında bir oran (~ 5.000 hücre / cm 2) her 5 günde ya da% 80 konfluent üzerine bölünmüş Tohum hücreleri.
- Tripan mavisi boyama ile hücre sayıları ve canlılığı belirleyin.
Matrix C. Hücre-tohumlama
- Yukarıda tarif edildiği gibi yıkama ve serbest implantasyon öncesinde hücreler. Hücre sayısı gerçekleştirin ve 1.5 ml mikrosantrifüj tüpe 5 x 10 4 hücre transferi. Daha sonra, oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 500 x g'de santrifüj.
- Matrisin tam doygunluk için 15 ul tam ortam içinde yeniden süspanse pelet.
- Steril bir biyopsi ile troklear kusurun tam boyutları için çift katlı kollajen iskele Cutyumruk.
- Uygun boyutlu bir doku kültürü kabı (örneğin, 24-delikli plakalar) içine yerleştirin matrisi.
- Matris, gözenekli, hücre yapışan yanı üzerine tohum hücreleri. Bu matris uzak hücre göçü engeller.
- Kondrositlerin tam yapışma sağlamak için 1 saat boyunca bir inkübatör içinde daha fazla hücre kültür ortamı olmayan hücre-matris tohumlu bırakın.
- Taze tam ortam ile kültürleme kapları (örneğin, 24-gözlü plakalar) içine Ardından, hücre-matriks-yapıları. Güçlü bağlılık bekleniyor olsa da matris kapalı herhangi bir hücre yıkayın dikkat edin.
- Şimdi, hücre-matriks-yapıları yeniden implantasyon için ameliyat odasına alınabilir.
D. Matrix destekli Otolog Kondrosit Nakli
- (A 1-8) yukarıda tarif edildiği gibi, karşı diz Parapatellar artrotomiye yapın.
- Steril bir hava operatin ile troklear oluk iki izole kıkırdak defektleri oluşturung güç matkap (çapı 3.6 mm).
- Kusur temizleyin ve steril tuzlu su ile durulayın.
- Dikkat herhangi bir zamanda iliği boşluğu açmak için değil dikkat edilmelidir. Gerekirse, kanama karşı elektrik koter ile kusurların alt mühür.
- Gözenekli yüzü aşağı (Şekil 2) ile kültürlü kondrosit numaralı seribaşı matrisler İmplant. Daha sonra delik içine basın-fit ve çevresindeki yüzey yıkayın.
- Güvenli fiksasyon sağlamak için fibrin yapıştırıcı (Tissucol Duo S) biraz ile implante matrisler Seal.
- Pıhtılaşma sonra, troklear oluk içinde patella yerini değiştirmek ve diz eklemi birkaç kez hareket tam kapsamlı geçerlidir.
- Yanal bir kez daha patella yerinden ve istikrarsız tespitin herhangi bir olay ya da işaret olup olmadığını kontrol edin. Matrisler hala yerinde tutulması gerekir.
- Tekrar patella değiştirin ve yukarıda açıklandığı gibi giyinme katmanları ve sprey yara kapanması ile işlemi bitirmek.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Açıklanan cerrahi teknik yapay kıkırdak kusur içine otolog kondrosit başarılı bir izolasyon ve implantasyon izin verir. Deney düzeneği çevre kıkırdak içine implant başarılı bir şekilde entegrasyonu ile sonuçlanmıştır.
In vivo olarak 12 hafta sonra, kıkırdak kusur implant (Şekil 4) kayma gerilmesi ve hasar azaltılmış bir homojen ve sağlam yüzey, ile tamir dokusu ile doluydu. Ayrıca, implantın hiçbir hipertrofi veya kalsifikasyon görüldü. Onarım dokusu sağlıklı çevre kıkırdak dokuya benzer bir sert ve katı kalite, gösterdi. İmplantın yetersiz biyomekanik özellikleri nedeniyle komşu kıkırdak üzerinde artan yük erken dejenerasyon için bir risk olurdu, çünkü bu önemli bir yönü oldu. Ayrıca, delaminasyon bir greft oluşmamıştır. Herhangi bir fissu, ameliyat öncesi kusurun aynı boyutta için membran kesilmiş olmasıimplant ve çevresindeki kıkırdak arasında halka veya yarıklar kaçınılmıştır.
Şekil 1. 80% confluency az kondrosit birincil kültür tek tabaka.
Şekil 2. Bir kıkırdak femoral Trochlea oluk dışında biyopsi alarak.
Şekil 3,. Yapay troklear kıkırdak defekti oluşturuldu.
Şekil 4. Açılmış diz eklemi 12 hafta önceden içine otolog kondrosit ile numaralı seribaşı bir membran implantasyonu sonrasıDelinmiş kıkırdak defekti (kırmızı ok).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Sunulan protokol tavşan diz yapay olarak oluşturulmuş kıkırdak defektleri içine sonraki çoğalması ve yeniden implantasyon için otolog kondrosit izole etmek için bir 9,12,13 kurulmuş ve kolay kullanışlı bir teknik sağlar. Eklem kıkırdağı lezyonlarının yeniden ve onarım için otolog kondrosit kullanımı klinik kullanımı tatmin edici uzun dönem sonuçları 6 sağlayan zaten.
Periost hipertrofisi ve kireçlenme örneğin gibi büyük sorunlar, greft delaminasyon veya donör alan morbiditesi otolog kondrosit implantasyonu 14 birinci ve ikinci nesil oluştu. Bu nedenle araştırmacılar kusur siteye kondrosit sunmak için eksojen biyoçözünür malzemeler kullanılarak teknikleri geliştirdiler. Agaroz 15 kullanılırken kondrositik özelliklerin korunması ile ilgili üç-boyutlu bir kültür sistemi üzerindeki pozitif etkisi arka arkaya, örneğin, kanıtlanmıştır, Poli - dioxanon ve poliglaktin 16, polyesterler poli (L-laktid) (PLLA) ve poli (D, L-laktid-ko-coglycolide) (PLGA) 17, 12, fibrin, hiyalüronan 18, aljinat 19, 20 ya da kolajen kollagen matrisleri 9 .
Bu çalışmada kullanılan iki tabakalı bir kollajen membran Chondro-Gide başarıyla 9,21,22 önce çeşitli klinik çalışmalarda uygulanır ve daha önce klinik uygulamalarda 21,23 parçası olmuştur. Kollajen membran iki tabakalı yapısı, kondrosit entegrasyon ve çoğalması için istikrarlı bir mikro sunan matris içinde hücrelerin eşit dağılımını sağlar ve geleneksel ACI 11 görüldüğü gibi hücre sızıntı olasılığını ortadan kaldırır. Bu MACT tekniğin kullanımı ile, nakledilen kondrositler yerel olarak muhafaza canlılığı ile korunur. Matris destekli otolog kondrosit transplantasyon sentezine yol açaryenilenmesi doku kıkırdak benzeri ve 21 klinik olarak uygulanabilir.
Açıklanan hayvan modeli de eklem kıkırdak lezyonlarının 11,24,25 deneysel tedavisinde kabul edilir. Ancak, sunulan teknik kullanılarak yapılan deneyler arasında olası sonuç rutin klinik için çeviri çeşitli nedenlerden dolayı zordur. Bir hayvan modelinde genellikle implante hücrelerin erken entegrasyon süreçleri ile başlamak izin tavsiye edilir Ameliyattan sonraki ilk gün / hafta içinde ağırlık taşıyan olmayan veya kısmi elde etmek neredeyse imkansızdır. Hemen ameliyat sonrası taşıyan tam ağırlığı potansiyel nakli zarar verebilecek ve bu nedenle sonuç etkileyebilir. Ancak bu ayarı 9,12 benzer tüm hayvan modellerinde benzer olmuştur. Daha yakından insan durumu benzeyen büyük hayvanların,, ile deneyler daha da hayvan çalışmalarında garanti altındadır.
Özet olarak, ancak, bir e kurulmuşYukarıda açıklandığı gibi Xperimental hayvan modeli kıkırdak onarım daha da deneysel çalışmalar için bir temel sağlar ve karmaşık çalışma ayarlarının gerçekleştirilmesi ve performans kolaylaştırabilir. Bu hayvan modeli kullanarak büyüme faktörleri, gen indüksiyon ve değişen matris özelliklere sahip deneysel muayene kurulan klinik geliştirmek için yararlı olabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.
Acknowledgments
Bu proje Alman Araştırma Birliği (DFG, HE 4578/3-1) tarafından finanse edildi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Name of reagent/equipment | Company | Catalogue Number | Comments |
| DMEM | Biochrom AG | F 0415 | |
| Collagenase A | Roche | 10 103 586 001 | 0.21 U/mg |
| Fetal calf serum (FCS) | PAN Biotech GmbH | 3702-P103009 | |
| Propofol | Fresenius Kabi | ||
| Penicillin/Streptomycin | Biochrom AG | A 2213 | 10,000 U/ml/10,000 μg/ml |
| PBS Dulbecco (1X) | Biochrom AG | L1815 | |
| Ethanol (70%) | Merck KgaA | 410230 | |
| Trypsin-EDTA 0.25 %/0.02 % | Biochrom AG | L2163 | in PBS w/o Ca2+, Mg2+ |
| Fentanyl | Delta Select GmBH | 1819340 | |
| NaCl solution (0.9%) | Bbraun | 8333A193 | |
| Tissue culture dishes 100 mm/150 mm | TPP AG | 93100/93150 | Growth area 60.1 mm2/147.8 mm2 |
| Tissue culture flasks 25/75 mm2 | TPP AG | 90025/90075 | 25 mm2, 75 mm2 |
| Centrifuge Tubes (50 ml) | TPP AG | 91050 | Gamma-sterilized |
| Hemocytometer | Brand GmbH+Co KG | 717810 | Neubauer |
| Trypan Blue Solution 0.4% | Sigma-Aldrich | L8154 | |
| Spray dressing (OpSite) | Smith&Nephew | 66004978 | Permeable for water vapor |
| Chondro-GideÒ | Geistlich Pharma AG | 30915.5 | |
| Biopsy Punch | pfm medical ag | 48351 | |
| Tissucol Duo S | Baxter | 3419627 | 0.5 ml |
References
- Albrecht, C., et al. Gene expression and cell differentiation in matrix-associated chondrocyte transplantation grafts: a comparative study. Osteoarthritis Cartilage. 19, 1219-1227 (2011).
- Pridie, K. H. A method of resurfacing osteoarthritic knee joints. J. Bone Joint Surg. Br. 41, 618-619 (1959).
- Johnson, L. L. Arthroscopic abrasion arthroplasty historical and pathologic perspective: present status. Arthroscopy. 2, 54-69 (1986).
- Steadman, J. R., Rodkey, W. G., Singelton, S. B., Briggs, K. K. Microfracture technique for full-thickness chondral defects: technique and clinical result. Operat. Tech. Orthop. 7, 300-304 (1997).
- Brittberg, M., et al. Treatment of deep cartilage defects in the knee with autologous chondrocyte transplantation. N. Engl. J. Med. 331, 889-895 (1994).
- Peterson, L., Vasiliadis, H. S., Brittberg, M., Lindahl, A. Autologous chondrocyte implantation: a long-term follow-up. Am. J. Sports Med. 38, 1117-1124 (2010).
- Nehrer, S., et al. Chondrocyte-seeded collagen matrices implanted in a chondral defect in a canine model. Biomaterials. 19, 2313-2328 (1998).
- Frenkel, S. R., Toolan, B., Menche, D., Pitman, M. I., Pachence, J. M. Chondrocyte transplantation using a collagen bilayer matrix for cartilage repair. J. Bone. Joint Surg. Br. 79, 831-836 (1997).
- Salzmann, G. M., et al. The dependence of autologous chondrocyte transplantation on varying cellular passage, yield and culture duration. Biomaterials. 32, 5810-5818 (2011).
- Frohlich, M., Malicev, E., Gorensek, M., Knezevic, M., Kregar Velikonja, N. Evaluation of rabbit auricular chondrocyte isolation and growth parameters in cell culture. Cell Biol. Int. 31, 620-625 (2007).
- Willers, C., Chen, J., Wood, D., Xu, J., Zheng, M. H. Autologous chondrocyte implantation with collagen bioscaffold for the treatment of osteochondral defects in rabbits. Tissue Eng. 11, 1065-1076 (2005).
- Vogt, S., et al. The influence of the stable expression of BMP2 in fibrin clots on the remodelling and repair of osteochondral defects. Biomaterials. 30, 2385-2392 (2009).
- Ueblacker, P., et al. In vivo analysis of retroviral gene transfer to chondrocytes within collagen scaffolds for the treatment of osteochondral defects. Biomaterials. 28, 4480-4487 (2007).
- Marlovits, S., Zeller, P., Singer, P., Resinger, C., Vecsei, V. Cartilage repair: generations of autologous chondrocyte transplantation. Eur. J. Radiol. 57, 24-31 (2006).
- Benya, P. D., Shaffer, J. D. Dedifferentiated chondrocytes reexpress the differentiated collagen phenotype when cultured in agarose gels. Cell. 30, 215-224 (1982).
- Rudert, M., Hirschmann, F., Wirth, C. J. Growth behavior of chondrocytes on various biomaterials. Orthopade. 28, 68-75 (1999).
- Hsu, S. H., et al. Evaluation of biodegradable polyesters modified by type II collagen and Arg-Gly-Asp as Tissue Engineering scaffolding materials for cartilage regeneration. Artificial Organs. 30, 42-55 (2006).
- Brun, P., Cortivo, R., Zavan, B., Vecchiato, N., Abatangelo, G. In vitro reconstructed tissues on hyaluronan-based temporary scaffolding. J. Mater. Sci. Mater. Med. 10, 683-688 (1999).
- Domm, C., Fay, J., Schunke, M., Kurz, B. Redifferentiation of dedifferentiated joint cartilage cells in alginate culture. Effect of intermittent hydrostatic pressure and low oxygen partial pressure. Orthopade. 29, 91-99 (2000).
- Kimura, T., Yasui, N., Ohsawa, S., Ono, K. Chondrocytes embedded in collagen gels maintain cartilage phenotype during long-term cultures. Clin. Orthop. Relat. Res. , 231-239 (1984).
- Kon, E., et al. Second-generation autologous chondrocyte implantation: results in patients older than 40 years. Am. J. Sports Med. 39, 1668-1675 (2011).
- Gavenis, K., Schmidt-Rohlfing, B., Mueller-Rath, R., Andereya, S., Schneider, U. In vitro comparison of six different matrix systems for the cultivation of human chondrocytes. In Vitro Cell Dev. Biol. Anim. 42, 159-167 (2006).
- Niemeyer, P., et al. Characteristic complications after autologous chondrocyte implantation for cartilage defects of the knee joint. Am. J. Sports Med. 36, 2091-2099 (2008).
- Tay, L. X., et al. Treatment outcomes of alginate-embedded allogenic mesenchymal stem cells versus autologous chondrocytes for the repair of focal articular cartilage defects in a rabbit model. The American Journal of Sports Medicine. 40, 83-90 (2012).
- Brittberg, M., Nilsson, A., Lindahl, A., Ohlsson, C., Peterson, L. Rabbit articular cartilage defects treated with autologous cultured chondrocytes. Clin. Orthop. Relat. Res. , 270-283 (1996).
