Summary
En eksperimentel teknik til behandling af chondrale defekter i kaninens knæled beskrives. Implantation af autologe chondrocytter podet på en matrix er et godt accepteret metode til remodellering og reparation af ledbrusk læsioner giver tilfredsstillende resultater på lang sigt. Matrix-assisteret autolog chondrocyt transplantation (MACT) tilbyder en standardiseret og klinisk etablerede implantation metode.
Abstract
Ledbrusk defekter betragtes som et stort sundhedsproblem, fordi ledbrusk har en begrænset kapacitet til selv-regeneration 1.. Ubehandlede brusklæsioner fører til løbende smerter, negativ indflydelse på livskvaliteten og prædisponere for slidgigt. I de seneste årtier har flere kirurgiske teknikker blevet udviklet til behandling af sådanne læsioner. Men indtil nu har det ikke været muligt at opnå en fuld reparation i form af dække defekten med hyalin ledbrusk eller levere tilfredsstillende langfristet genopretning 2-4. Derfor ledbrusken skader forbliver et oplagt mål for regenerative teknikker såsom Tissue Engineering. I modsætning til andre kirurgiske teknikker, som ofte fører til dannelsen af fibrøst eller fibrocartilaginous væv, sigter Tissue Engineering på fuldstændig genopretning den komplekse struktur og egenskaber af den oprindelige ledbrusk ved hjælp af chondrogene potentiale af transplanterede celler. RSENESTE udvikling åbnet lovende muligheder for regenerativ brusk behandlinger.
Den første celle tilgang til behandling af fuld tykkelse brusk eller osteochondral læsioner blev udført i 1994 af Lars Peterson og Mats Brittberg der var pioner klinisk autolog chondrocyt implantation (ACI) 5.. Dag, er teknikken klinisk veletableret til behandling af store hyaline bruskdefekter i knæet, opretholde gode kliniske resultater endda 10 til 20 år efter implantation 6.. I de seneste år, undergik implantation af autologe chondrocytter en hurtig progression. Anvendelsen af en kunstig tredimensional collagen matrix, på hvilken cellerne efterfølgende genplantet blev mere og mere populære 7-9.
MACT består af to kirurgiske procedurer: Først for at indsamle chondrocytter, en bruskbiopsi skal udføres fra et ikke vægtbærende brusk område than knæled. Derefter er chondrocytter bliver ekstraheret, renset og udvidet til et tilstrækkeligt antal celler in vitro. Chondrocytter podes derefter på en tredimensional matrix og kan efterfølgende genimplanteret. Ved udarbejdelsen af et vævs-manipuleret implantat, proliferation sats og differentiering kapacitet er afgørende for en vellykket vævsregenerering 10.. Anvendelsen af en tredimensional matrix som en celle bærer menes at støtte disse cellulære egenskaber 11.
Følgende protokol skal sammenfatte og demonstrere en teknik til isolering af chondrocytter fra brusk biopsier, deres proliferation in vitro og deres podning på en 3D-matrix (Chondro-Gide, GEISTLICH biomaterialer, Wollhusen, Schweiz). Endelig vil implantation af celle-matrix-konstruktioner i kunstigt skabte chondral defekter af en kanin knæled blive beskrevet. Denne teknik kan bruges som en eksperimentel indstillingtil yderligere eksperimenter brusk reparation.
Protocol
A. bruskbiopsi (Surgery Room, trin 1-5 i Non-sterile Forberedelse Room)
- Udfør en slutvægt kontrol af kanin (New Zealand White kanin, kvindelig, 3,5-4,0 kg legemsvægt, 6 måneder gammel) med henblik på at kunne dosis medicin korrekt og til at overvåge vægten efter kirurgi.
- Narkosen til kanin ved en intravenøs injektion af 10 mg / kg propofol.
- Efter intubation, opretholde anæstesi med 1,5 mg / kg / min propofol og 0,05 mg / kg fentanyl intravenøst. Overvåg anæstesi ved hjælp kapnografi, pulsoximetri og puls.
- Shave knæet skal opereres med en elektrisk clipper og vakuum pels.
- Desinficere barberet knæ grundigt og dække resten af kanin med en steril forbinding.
- Palpere knæskallen og udføre en hud incision medialt af patella.
- Åbn knæleddet ved en medial parapatellar arthrotomi under sterile betingelser. Prøv at undgå at skære enhver lille superficial blodkar.
- Fortrænge patella sideværts.
- Undersøg knæleddet for eventuelle anomalier og makroskopiske brusk læsioner.
- Træk forsigtigt små brusk stykker (2-3 mm) ud af trochlea ossis femoris med en steril skalpel (Figur 1).
- Umiddelbart placere disse brusk biopsier i et 50 ml rør med komplet medium (DMEM + 10% føtalt kalveserum (FCS) + 1% penicillin / streptomycin (Pen / Strep)) for at fortsætte med in vitro kultur lige efter operationen.
- Rengør de fejl og skyl dem med sterilt saltvand.
- Flyt patella i trochlea groove.
- Sårlukning i lag med en enkelt knap suturer (4-0 Vicryl) og en fortsat kutan sutur (4-0 Monocryl). Brug absorberbare suturmateriale.
- Endelig forsegle såret med en spray dressing gennemtrængelig for vanddamp.
B. In vitro Culture
- Behandl biopsi cartilage stykker så hurtigt som muligt efter operationen i en steril laminar flow vævskultur hætte.
- Vask steril høstede brusk 2x i PBS med efterfølgende centrifugering ved 500 xg i 3 minutter ved stuetemperatur.
- Skær brusk i stykker på 1 mm 3, overføres til en 50 ml Falcon og fordøje dem på et rysteapparat i 30 minutter med 10 ml trypsin-EDTA (0,25%) og 10 ml PBS i 30 min
- Efter 30 min, stop trypsinbehandling ved tilsætning komplet medium. Derefter rystes brusk stykker for en anden i 12 timer med collagenase A (0,21 U / mg) i serumfrit medium (DMEM + 1% Pen / Strep).
- Centrifugeres den resulterende opløsning ved 170 xg i 3 minutter ved stuetemperatur.
- Resuspender cellepellets i 5 ml komplet medium.
- Frø de isolerede chondrocytter på til 25 cm 2 vævskulturkolber i 5 ml komplet medium og opbevares i en befugtet vævskultur inkubator ved 37 ° C, 5% CO2.
- Grow chondrocytter til en densitet på 80%.
- Slip celler from kolberne ved vask i PBS 2x før udsættelse for 0,05% trypsin-EDTA i 3 minutter. Når chondrocytter frigøre, stop trypsinbehandling ved tilsætning af 10 pi komplet medium.
- Centrifugeres suspensionen ved 300 xg (3 min) og resuspender pellet i komplet medium.
- Seed celler i vævskulturkolber (75 cm2) og opdelt i et forhold på 1:3 (~ 5.000 celler / cm 2) hver 5. dag eller ved 80% konfluens.
- Bestem celletal og levedygtighed ved trypanblåt farvning.
C. cellepodning af Matrix
- Forud for implantation vask og frigivelse celler som beskrevet ovenfor. Udfør celletal og overføre 5 x 10 4 celler i et 1,5 ml mikrocentrifugerør. Centrifugeres ved 500 xg i 5 minutter ved stuetemperatur.
- Resuspender pellet i 15 pi komplet medium til en fuldstændig mætning af matrixen.
- Skær dobbeltlagets collagen stillads til den nøjagtige dimensioner af trochlear defekt ved en steril biopsipunch.
- Sted matrix til en passende størrelse vævsdyrkningsskål (fx 24-brønds plader).
- Seed celler på den porøse, celle-klæbende side af matrixen. Dette afskrækker cellemigrering væk fra matrixen.
- Efterlad celle-seedede matricer uden yderligere cellekulturmedium i en inkubator i 1 time til at tillade fuld vedhæftning af chondrocytter.
- Derefter place celle-matrix-konstruktioner i dyrkning beholdere (fx 24-brønds plader) med frisk komplet medium. Pas på ikke at vaske eventuelle celler off matrix, selvom en stærk vedhæftning forventes.
- Nu kan celle-matrix-konstruktioner blive taget til kirurgi plads til re-implantation.
D. Matrix-assisteret Autolog Chondrocyt Transplantation
- Udfør parapatellar arthrotomi til den kontralaterale knæ som beskrevet ovenfor (A. 1-8).
- Opret to isolerede chondral defekter i trochlearille med en steril luft operating boremaskine (3,6 mm i diameter).
- Rengør defekten og skyl med sterilt saltvand.
- Man bør være opmærksom på ikke at åbne marvhuleareal til enhver tid. Hvis det er nødvendigt, forsegle bunden af manglerne med elektrisk cautery mod blødninger.
- Implantere matricer podet med de dyrkede chondrocytter med den porøse nedad (figur 2). Tryk derefter på-passer ind i de bore huller og skyl den omgivende overflade.
- Forsegl implanterede matricer med en lille smule af fibrin lim (Tissucol Duo S) for at sikre en sikker fiksering.
- Efter koagulation, flyt patella inden trochlearille og anvende hele spektret af bevægelse til knæleddet et par gange.
- Fortrænge patella lateralt igen, og tjek for enhver begivenhed eller tegn på ustabil fiksering. De matricer skal holdes stadig på plads.
- Udskift patella igen og afslutte operationen med sårlukning i lag og spray dressing som beskrevet ovenfor.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den beskrevne kirurgisk teknik tillader en vellykket isolering og implantation af autologe chondrocytter i en kunstig chondral defekt. Forsøgsopstillingen resulterede i en vellykket integration af implantatet ind i den omgivende brusk.
Efter 12 ugers in vivo, blev chondral defekt fyldt med helingsvæv med en homogen og intakt overflade, hvilket reducerede forskydningsspænding og beskadigelse af implantatet (figur 4). Desuden blev der ikke hypertrofi eller forkalkning af implantatet set. Reparationen væv viste en stiv og solid kvalitet, der var sammenlignelig med det sunde omgivende bruskvæv. Dette var et vigtigt aspekt, fordi øget belastning på den tilstødende brusk grund af utilstrækkelige biomekaniske egenskaber af implantatet ville være en risiko for for tidlig degeneration. Desuden har en graft delaminering ikke har fundet sted. Efter skære membranen til den samme størrelse af defekten præoperativt, enhver fissuring eller kløfter mellem implantat og omgivende brusk blev undgået.
Figur 1. Monolag af chondrocytter primær kultur ved 80% konfluens.
Figur 2. Tage en bruskbiopsi ud af den femorale trochlea groove.
Figur 3. Kunstigt skabte trochlear bruskdefekt.
Figur 4.. Åbnet knæled 12 uger efter implantation af en membran podet med autologe chondrocytter i en præ-Boret chondral defekt (rød pil).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den præsenterede protokol giver en etableret 9,12,13 og nemt reproducerbar teknik til at isolere autologe chondrocytter til efterfølgende spredning og re-implantation i kunstigt skabte brusk defekter i kanin knæ. Anvendelsen af autologe chondrocytter for ombygning og reparation af ledbrusk læsioner er allerede i klinisk brug leverer tilfredsstillende resultater på lang sigt 6..
Store problemer for eksempel periosteal hypertrofi og forkalkning, graft delaminering eller donor site sygelighed forekom med den første og anden generation af autolog chondrocyt implantation 14. Derfor har forskere udviklet teknikker, der anvender eksogene bioresorberbare materialer til at levere chondrocytter til det defekte område. Den positive effekt af tre-dimensionelle kultur-system til vedligeholdelse af chondrocytic egenskaber er blevet påvist gentagne gange, for eksempel ved brug af agarose 15, Poly - dioxanon og polyglactin 16, polyestere poly (L-lactid) (PLLA) og poly (D, L-lactid-coglycolid) (PLGA) 17, fibrin 12, hyaluronan 18, alginat 19, collagen 20 eller collagen-matricer 9 .
Den tolags kollagenmembran Chondro-Gide anvendt i denne undersøgelse har været anvendt med succes i flere prækliniske undersøgelser før 9,21,22 og er allerede en del af kliniske anvendelser 21,23. Dobbeltlaget struktur kollagenmembranen tilbyder en stabil mikromiljø for chondrocytter integration og spredning, giver mulighed for en jævn fordeling af cellerne i matricen og eliminerer muligheden for celle lækage, som det ses i konventionel ACI 11.. Ved brug af denne MACT teknik, er de transplanterede chondrocytter lokalt bevaret med opretholdt levedygtighed. Matrix-assisteret autolog chondrocyt transplantation fører til syntesen afbrusk-lignende regeneration af væv og er klinisk relevant 21..
Den beskrevne dyremodel er godt accepteret i den eksperimentelle behandling af ledbrusken læsioner 11,24,25. Men oversættelsen til kliniske rutine af mulige resultater af forsøg med det fremlagte teknik er vanskelig af flere grunde. I en dyremodel er det næsten umuligt at opnå ikke eller delvis vægtbelastning i de første dage / uger efter operationen som helhed vil blive anbefalet at tillade de implanterede celler til at begynde med tidlig integrationsprocesser. Fuld vægtbærende umiddelbart efter operationen kan potentielt skade transplantationen og derfor kunne påvirke resultatet. Men denne indstilling var ens i alle dyremodeller sammenlignelige 9,12. Forsøg med større dyr, mere ligner den menneskelige situation, er berettiget til yderligere dyreforsøg.
Sammenfattende imidlertid en etableret experimental dyremodel, som det er beskrevet ovenfor, giver et grundlag for yderligere eksperimentelle undersøgelser af brusk reparation og måske endda lette gennemførelsen og udførelsen af komplekse studie-indstillinger. Eksperimentelle undersøgelser med vækstfaktorer, geninduktion og skiftende matrix egenskaber ved hjælp af denne dyremodel kan være en hjælp til at forbedre de etablerede kliniske omgivelser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at afsløre.
Acknowledgments
Dette projekt blev finansieret af den tyske Research Association (DFG, HE 4578/3-1).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Name of reagent/equipment | Company | Catalogue Number | Comments |
| DMEM | Biochrom AG | F 0415 | |
| Collagenase A | Roche | 10 103 586 001 | 0.21 U/mg |
| Fetal calf serum (FCS) | PAN Biotech GmbH | 3702-P103009 | |
| Propofol | Fresenius Kabi | ||
| Penicillin/Streptomycin | Biochrom AG | A 2213 | 10,000 U/ml/10,000 μg/ml |
| PBS Dulbecco (1X) | Biochrom AG | L1815 | |
| Ethanol (70%) | Merck KgaA | 410230 | |
| Trypsin-EDTA 0.25 %/0.02 % | Biochrom AG | L2163 | in PBS w/o Ca2+, Mg2+ |
| Fentanyl | Delta Select GmBH | 1819340 | |
| NaCl solution (0.9%) | Bbraun | 8333A193 | |
| Tissue culture dishes 100 mm/150 mm | TPP AG | 93100/93150 | Growth area 60.1 mm2/147.8 mm2 |
| Tissue culture flasks 25/75 mm2 | TPP AG | 90025/90075 | 25 mm2, 75 mm2 |
| Centrifuge Tubes (50 ml) | TPP AG | 91050 | Gamma-sterilized |
| Hemocytometer | Brand GmbH+Co KG | 717810 | Neubauer |
| Trypan Blue Solution 0.4% | Sigma-Aldrich | L8154 | |
| Spray dressing (OpSite) | Smith&Nephew | 66004978 | Permeable for water vapor |
| Chondro-GideÒ | Geistlich Pharma AG | 30915.5 | |
| Biopsy Punch | pfm medical ag | 48351 | |
| Tissucol Duo S | Baxter | 3419627 | 0.5 ml |
References
- Albrecht, C., et al. Gene expression and cell differentiation in matrix-associated chondrocyte transplantation grafts: a comparative study. Osteoarthritis Cartilage. 19, 1219-1227 (2011).
- Pridie, K. H. A method of resurfacing osteoarthritic knee joints. J. Bone Joint Surg. Br. 41, 618-619 (1959).
- Johnson, L. L. Arthroscopic abrasion arthroplasty historical and pathologic perspective: present status. Arthroscopy. 2, 54-69 (1986).
- Steadman, J. R., Rodkey, W. G., Singelton, S. B., Briggs, K. K. Microfracture technique for full-thickness chondral defects: technique and clinical result. Operat. Tech. Orthop. 7, 300-304 (1997).
- Brittberg, M., et al. Treatment of deep cartilage defects in the knee with autologous chondrocyte transplantation. N. Engl. J. Med. 331, 889-895 (1994).
- Peterson, L., Vasiliadis, H. S., Brittberg, M., Lindahl, A. Autologous chondrocyte implantation: a long-term follow-up. Am. J. Sports Med. 38, 1117-1124 (2010).
- Nehrer, S., et al. Chondrocyte-seeded collagen matrices implanted in a chondral defect in a canine model. Biomaterials. 19, 2313-2328 (1998).
- Frenkel, S. R., Toolan, B., Menche, D., Pitman, M. I., Pachence, J. M. Chondrocyte transplantation using a collagen bilayer matrix for cartilage repair. J. Bone. Joint Surg. Br. 79, 831-836 (1997).
- Salzmann, G. M., et al. The dependence of autologous chondrocyte transplantation on varying cellular passage, yield and culture duration. Biomaterials. 32, 5810-5818 (2011).
- Frohlich, M., Malicev, E., Gorensek, M., Knezevic, M., Kregar Velikonja, N. Evaluation of rabbit auricular chondrocyte isolation and growth parameters in cell culture. Cell Biol. Int. 31, 620-625 (2007).
- Willers, C., Chen, J., Wood, D., Xu, J., Zheng, M. H. Autologous chondrocyte implantation with collagen bioscaffold for the treatment of osteochondral defects in rabbits. Tissue Eng. 11, 1065-1076 (2005).
- Vogt, S., et al. The influence of the stable expression of BMP2 in fibrin clots on the remodelling and repair of osteochondral defects. Biomaterials. 30, 2385-2392 (2009).
- Ueblacker, P., et al. In vivo analysis of retroviral gene transfer to chondrocytes within collagen scaffolds for the treatment of osteochondral defects. Biomaterials. 28, 4480-4487 (2007).
- Marlovits, S., Zeller, P., Singer, P., Resinger, C., Vecsei, V. Cartilage repair: generations of autologous chondrocyte transplantation. Eur. J. Radiol. 57, 24-31 (2006).
- Benya, P. D., Shaffer, J. D. Dedifferentiated chondrocytes reexpress the differentiated collagen phenotype when cultured in agarose gels. Cell. 30, 215-224 (1982).
- Rudert, M., Hirschmann, F., Wirth, C. J. Growth behavior of chondrocytes on various biomaterials. Orthopade. 28, 68-75 (1999).
- Hsu, S. H., et al. Evaluation of biodegradable polyesters modified by type II collagen and Arg-Gly-Asp as Tissue Engineering scaffolding materials for cartilage regeneration. Artificial Organs. 30, 42-55 (2006).
- Brun, P., Cortivo, R., Zavan, B., Vecchiato, N., Abatangelo, G. In vitro reconstructed tissues on hyaluronan-based temporary scaffolding. J. Mater. Sci. Mater. Med. 10, 683-688 (1999).
- Domm, C., Fay, J., Schunke, M., Kurz, B. Redifferentiation of dedifferentiated joint cartilage cells in alginate culture. Effect of intermittent hydrostatic pressure and low oxygen partial pressure. Orthopade. 29, 91-99 (2000).
- Kimura, T., Yasui, N., Ohsawa, S., Ono, K. Chondrocytes embedded in collagen gels maintain cartilage phenotype during long-term cultures. Clin. Orthop. Relat. Res. , 231-239 (1984).
- Kon, E., et al. Second-generation autologous chondrocyte implantation: results in patients older than 40 years. Am. J. Sports Med. 39, 1668-1675 (2011).
- Gavenis, K., Schmidt-Rohlfing, B., Mueller-Rath, R., Andereya, S., Schneider, U. In vitro comparison of six different matrix systems for the cultivation of human chondrocytes. In Vitro Cell Dev. Biol. Anim. 42, 159-167 (2006).
- Niemeyer, P., et al. Characteristic complications after autologous chondrocyte implantation for cartilage defects of the knee joint. Am. J. Sports Med. 36, 2091-2099 (2008).
- Tay, L. X., et al. Treatment outcomes of alginate-embedded allogenic mesenchymal stem cells versus autologous chondrocytes for the repair of focal articular cartilage defects in a rabbit model. The American Journal of Sports Medicine. 40, 83-90 (2012).
- Brittberg, M., Nilsson, A., Lindahl, A., Ohlsson, C., Peterson, L. Rabbit articular cartilage defects treated with autologous cultured chondrocytes. Clin. Orthop. Relat. Res. , 270-283 (1996).
