Summary
En eksperimentell teknikk for behandling av chondral defekter i kaninens kneleddet er beskrevet. Implantasjon av autologe chondrocytes seeded på en matrise er en godt akseptert metode for ombygging og reparasjon av leddbruskskader gi tilfredsstillende langsiktige resultater. Matrix-assistert autolog chondrocyttransplantasjon transplantasjon (MACT) tilbyr et standardisert og klinisk etablert implantasjon metoden.
Abstract
Leddbrusk defekter er ansett som et stort helseproblem fordi leddbrusk har en begrenset evne til selv-regenerering en. Ubehandlet brusklesjoner føre til pågående smerte, negativt påvirke livskvalitet og disponere for slitasjegikt. I løpet av de siste tiårene har flere kirurgiske teknikker blitt utviklet for å behandle slike lesjoner. Men inntil nå var det ikke mulig å oppnå en fullstendig reparasjon når det gjelder å dekke defekten med hyalint artikulær brusk eller for å gi tilfredsstillende langvarig utvinning 2-4. Derfor leddbrusk skader fortsatt et hovedmål for regenerativ teknikker som Tissue Engineering. I motsetning til andre kirurgiske teknikker, noe som ofte fører til dannelse av fibrøst vev eller fibrocartilaginous, tar sikte Vev Engineering på fullt ut å gjenopprette den komplekse strukturen og egenskapene av den opprinnelige leddbrusk ved hjelp av chondrogenic potensialet av transplanterte celler. Recent utviklingen åpnet opp lovende muligheter for regenerative brusk terapi.
Den første cellen tilnærming for behandling av full-tykkelse brusk eller osteochondral lesjoner ble utført i 1994 av Peterson og Mats Lars Brittberg som utviklet klinisk autolog kondrocytt implantasjon (ACI) 5. I dag er den teknikk klinisk godt etablerte for behandling av store hyalin brusk-defekter i kne, opprettholder gode kliniske resultater selv 10 til 20 år etter implantasjon 6.. I de senere årene, gjennomgikk implantasjon av autologe chondrocytes en rask progresjon. Bruken av en kunstig tredimensjonal kollagen-matriks på hvilken cellene blir deretter omplantet ble mer og mer populær 7-9.
MACT består av to operasjoner: Først, for å samle kondrocytter, trenger en biopsi brusk som skal utføres fra et ikke vektbærende brusk område av than kneleddet. Deretter blir kondrocytter blir ekstrahert, renset og utvidet til et tilstrekkelig antall celle in vitro. Kondrocytter blir deretter sådd ut på en tredimensjonal matrise og kan senere re-implantert. Når du forbereder en vev-konstruert implantat, proliferasjonsrate og differensiering kapasitet er avgjørende for en vellykket vev gjenfødelse 10. Bruken av en tredimensjonal matrise som en celle bærer er tenkt å støtte disse cellulære egenskaper 11.
Følgende protokoll vil summere og demonstrerer en teknikk for isolering av kondrocytter fra brusk biopsier, deres proliferasjon in vitro og deres poding på en 3D-matrise (Chondro-Gides, Geistlich Biomaterials, Wollhusen, Sveits). Endelig vil implantering av celle-matriksinteraksjonsprosesser-konstrukter inn i kunstig skapt chondral defekter av en kanin kneleddet bli beskrevet. Denne teknikken kan brukes som en eksperimentell innstillingfor videre eksperimenter av brusk reparasjon.
Protocol
A. Brusk Biopsi (Kirurgi Room; trinn 1-5 i ikke-sterile Forberedelse Room)
- Utfør en endelig vekt kontroll av kanin (New Zealand hvit kanin, kvinnelig, 3,5-4,0 kg kroppsvekt, 6 måneder gamle) for å være i stand til å dosere medikamenter skikkelig og for å overvåke vekten påfølgende til kirurgi.
- Indusere anestesi til kaninen ved en intravenøs injeksjon av 10 mg / kg propofol.
- Etter intubasjon opprettholde anestesi med 1,5 mg / kg / min propofol og 0,05 mg / kg intravenøst fentanyl. Overvåke anestesi ved hjelp kapnografi, pulsoksymetri og puls.
- Shave kneet skal opereres med en elektrisk klipper og støvsuger pelsen.
- Desinfiser barbert kneet grundig og dekke resten av kanin med en steril bandasje.
- Palpate patella og utføre et snitt i huden medialt av patella.
- Åpne kneleddet av en medial parapatellar artrotomi under sterile forhold. Prøv å unngå å skjære noen små superficial blodkar.
- Fortrenge patella lateralt.
- Inspiser kneleddet for eventuelle avvik og makroskopiske brusk lesjoner.
- Trekk forsiktig små brusk stykker (2-3 mm) ut av trochlea ossis femoris med en steril skalpell (figur 1).
- Umiddelbart plassere disse brusk biopsier til en 50 ml tube med komplett medium (DMEM + 10% kalvefosterserum (FCS) + 1% penicillin / streptomycin (Pen / Strep)) for å fortsette med in vitro kultur rett etter operasjonen.
- Rengjør defekter og skyll dem med sterilt saltvann.
- Omplassere patella innenfor trochlea groove.
- Lukking av sår i lag med enkelt knapp suturer (4-0 Vicryl) og en fortsatt kutan sutur (4-0 Monocryl). Bruk absorberbare sutur materiale.
- Til slutt, forsegle såret med en spray dressing gjennomtrengelig for vanndamp.
B. In vitro Kultur
- Behandle biopsied cartilage stykker så snart som mulig etter operasjonen i en steril laminær vev kultur hette.
- Vask den sterile innhøstede brusk 2x i PBS med påfølgende sentrifugering ved 500 x g i 3 min ved RT.
- Skjær brusk i stykker på 1 mm 3, overføring til et 50 ml Falcon og fordøye dem på en ristemaskin i 30 min med 10 ml trypsin-EDTA (0,25%) og 10 ml PBS i 30 min
- Etter 30 minutter stopper trypsinering ved tilsetning komplett medium. Deretter riste brusk stykker for en annen i 12 timer med Collagenase A (0,21 U / mg) i serum fritt medium (DMEM + 1% Pen / Strep).
- Sentrifuger den resulterende løsning ved 170 x g i 3 min ved RT.
- Resuspender cellen pellets i 5 ml komplett medium.
- Seed de isolerte chondrocytes om til 25 cm 2 vevskulturflasker i 5 ml komplett medium og holde i en fuktet vev kultur inkubator ved 37 ° C, 5% CO 2.
- Dyrk kondrocytter til en tetthet på 80%.
- Slipp celler fROM kolber med vask i PBS 2x før utsette til 0,05% trypsin-EDTA i 3 min. Når kondrocytter løsner, stoppe trypsinering ved tilsetning av 10 pl komplett medium.
- Sentrifuger suspensjonen ved 300 xg (3 min) og resuspender pelleten i komplett medium.
- Seed celler i vevskulturflasker (75 cm 2) og deles ved et forhold på 1:03 (~ 5000 celler / cm 2) hver 5. dag, eller ved 80% konfluens.
- Bestem celle tall og levedyktighet av trypan blå flekker.
C. Cell-seeding av Matrix
- Før implantering vask og frigjøring celler som beskrevet ovenfor. Utfør celletall og overføre 5 x 10 4 celler inn i et 1,5 ml mikrosentrifugerør. Deretter sentrifuger ved 500 xg i 5 minutter ved RT.
- Resuspender pellet i 15 pl komplett medium for en fullstendig metning av matriksen.
- Skjær bilaget kollagen stillaset til de eksakte målene på trochlear defekt av en steril biopsipunch.
- Sted matrise legges i en passende vev kultur tallerken (f.eks 24-brønners plater).
- Seed celler bort på den porøse celle-klebende side av matrisen. Dette forhindrer cellemigrering bort fra matrisen.
- La celle-matriser tilsådde uten ytterligere cellekulturmedium i en inkubator i 1 time for å tillate fullstendig adhesjon av kondrocytter.
- Deretter plasserer celle-matrix-konstruksjoner til dyrking beholdere (f.eks 24-brønners plater) med fersk komplett medium. Pass på å ikke vaske ut noen celler utenfor matrisen selv om sterk tilslutning er forventet.
- Nå kan celle-matriks-konstruksjoner tas til kirurgi rom for re-implantasjon.
D. Matrix-assistert Autolog kondrocytt Transplantasjon
- Utfør parapatellar artrotomi til kontralaterale kne, som beskrevet ovenfor (A. 1-8).
- Lag to isolerte chondral defekter i trochlear groove med en steril luft operating bormaskin (3,6 mm i diameter).
- Rengjør feilen og skyll med sterilt saltvann.
- Oppmerksomhet bør vies ikke å åpne margen hulrom når som helst. Hvis det er nødvendig, forsegle bunnen av defekter med elektrisk cautery mot blødninger.
- Implantere matrisene podet med dyrkede kondrocytter med den porøse side vendt ned (figur 2). Deretter trykker-passe inn i borehullene og skyll den omkringliggende overflaten.
- Forsegle de implanterte matriser med en liten bit av fibrinlim (Tissucol Duo S) for å sikre sikker fiksering.
- Etter koagulering, omplassere patella innenfor trochlear groove og bruke hele spekteret av bevegelse til kneleddet et par ganger.
- Fortrenge patella lateralt igjen og se etter enhver hendelse eller tegn på ustabil fiksering. Matriksene må holdes på plass.
- Sett på patella igjen og avslutte operasjonen med lukking av sår i lag og spray dressing som beskrevet ovenfor.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den beskrevne kirurgiske teknikken tillater en vellykket isolasjon og implantasjon av autologe chondrocytes inn en kunstig chondral defekt. Det eksperimentelle oppsettet som resulterte i en vellykket integrering av implantatet til det omgivende brusk.
Etter 12 uker in vivo, ble det chondral defekten fylt med reparasjon vev med et homogent og intakt overflate, som reduserte skjærspenning og skade på implantatet (figur 4). Dessuten ble ingen hypertrofi eller forkalkning av implantatet sett. Reparasjonen vev viste en stiv og solid kvalitet, som var sammenlignbar med den omliggende sunt bruskvev. Dette var et viktig aspekt fordi forøket belastning på den tilstøtende brusk på grunn av utilstrekkelige biomekaniske egenskaper implantatet ville være en risiko for for tidlig degenerasjon. Videre har en pode delaminering ikke skjedd. Etter å ha kuttet membranen til den samme størrelsen på defekten preoperativt, noe fissuring eller kløfter mellom implantat og omkringliggende brusk ble unngått.
Figur 1. Monolag av chondrocytes primære kultur på 80% confluency.
Figur 2. Tar en brusk biopsi ut av femoral trochlea groove.
Figur 3. Kunstig skapt trochlear brusk defekt.
Figur 4. Åpnet kneleddet 12 uker etter implantering av en membran utsådd med autologe kondrocytter inn i en pre-Boret chondral defekt (rød pil).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den presenterte protokollen gir en etablert 9,12,13 og lett reproduserbar teknikk for å isolere autologe chondrocytes for påfølgende spredning og re-implantering i kunstig skapt brusk defekter i kanin knærne. Bruken av autologe chondrocytes for ombygging og reparasjon av leddbruskskader er allerede i klinisk bruk gir tilfredsstillende langsiktige resultater seks.
Store problemer som for eksempel periosteal hypertrofi og forkalkning, pode delaminering eller donor området sykelighet skjedde med den første og andre generasjon av autolog chondrocyttransplantasjon implantasjon 14. Derfor har forskere utviklet teknikker ved hjelp av eksogene bioresorberende materialer for å levere chondrocytes til mangelen området. Den positive effekten av tredimensjonale kultur system på vedlikehold av de chondrocytic egenskaper har gjentatte ganger blitt demonstrert, for eksempel ved bruk av agarose 15, Poly - dioxanon polyglaktin og 16, polyestere poly (L-laktid) (PLLA) og poly (D, L-laktid-coglycolide) (PLGA) 17, fibrin 12, 18 hyaluronan, alginat 19, kollagen 20 eller kollagen-matriser 9 .
Bilayer kollagenmembranen Chondro-Gide brukt i denne studien har blitt brukt i flere prekliniske studier før 9,21,22 og er allerede en del av kliniske applikasjoner 21,23. Den to-lags struktur av kollagenmembranen gir en stabil mikromiljø for kondrocytt integrasjon og proliferasjon, gir mulighet for en jevn fordeling av cellene inne i matriksen og eliminerer muligheten for lekkasje cellen som det er sett i konvensjonell ACI 11.. Ved bruk av denne MACT teknikk, er det transplanterte kondrocytter lokalt beholdt med opprettholdt levedyktighet. Matriks-assistert autologe kondrocytt transplantasjon fører til syntesen avbrusk-lignende regenerering vev og er klinisk relevant 21.
Den beskrevne dyremodell er vel akseptert i den eksperimentelle behandling av leddbruskskader 11,24,25. Imidlertid er oversettelse til klinisk rutine mulige resultater av eksperimenter ved anvendelse av teknikken presentert vanskelig av flere grunner. I en dyremodell er det nesten umulig å oppnå ikke eller delvis vektbærende i de første dager / uker etter operasjonen som ville bli generelt anbefalt å tillate de implanterte cellene til å begynne med tidlig integrering prosesser. Full vektbærende umiddelbart etter operasjonen potensielt kan skade transplantasjon og derfor kan påvirke utfallet. Men denne innstillingen var lik i alle dyremodeller sammenlignbare 9,12. Forsøk med større dyr, mer tett likner den menneskelige situasjonen, er garantert i videre studier på dyr.
I sammendrag, er imidlertid en etablert experimental dyremodell som det er beskrevet ovenfor gir grunnlag for videre eksperimentelle studier av brusk reparasjon og kan selv legge til rette for realisering og gjennomføring av komplekse studie innstillinger. Eksperimentelle undersøkelser med vekstfaktorer, genet induksjon og skiftende matrise egenskaper ved hjelp av denne dyremodell kan være nyttig for å forbedre de etablerte kliniske settinger.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noe å avsløre.
Acknowledgments
Dette prosjektet ble finansiert av den tyske Research Association (DFG, HE 4578/3-1).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Name of reagent/equipment | Company | Catalogue Number | Comments |
| DMEM | Biochrom AG | F 0415 | |
| Collagenase A | Roche | 10 103 586 001 | 0.21 U/mg |
| Fetal calf serum (FCS) | PAN Biotech GmbH | 3702-P103009 | |
| Propofol | Fresenius Kabi | ||
| Penicillin/Streptomycin | Biochrom AG | A 2213 | 10,000 U/ml/10,000 μg/ml |
| PBS Dulbecco (1X) | Biochrom AG | L1815 | |
| Ethanol (70%) | Merck KgaA | 410230 | |
| Trypsin-EDTA 0.25 %/0.02 % | Biochrom AG | L2163 | in PBS w/o Ca2+, Mg2+ |
| Fentanyl | Delta Select GmBH | 1819340 | |
| NaCl solution (0.9%) | Bbraun | 8333A193 | |
| Tissue culture dishes 100 mm/150 mm | TPP AG | 93100/93150 | Growth area 60.1 mm2/147.8 mm2 |
| Tissue culture flasks 25/75 mm2 | TPP AG | 90025/90075 | 25 mm2, 75 mm2 |
| Centrifuge Tubes (50 ml) | TPP AG | 91050 | Gamma-sterilized |
| Hemocytometer | Brand GmbH+Co KG | 717810 | Neubauer |
| Trypan Blue Solution 0.4% | Sigma-Aldrich | L8154 | |
| Spray dressing (OpSite) | Smith&Nephew | 66004978 | Permeable for water vapor |
| Chondro-GideÒ | Geistlich Pharma AG | 30915.5 | |
| Biopsy Punch | pfm medical ag | 48351 | |
| Tissucol Duo S | Baxter | 3419627 | 0.5 ml |
References
- Albrecht, C., et al. Gene expression and cell differentiation in matrix-associated chondrocyte transplantation grafts: a comparative study. Osteoarthritis Cartilage. 19, 1219-1227 (2011).
- Pridie, K. H. A method of resurfacing osteoarthritic knee joints. J. Bone Joint Surg. Br. 41, 618-619 (1959).
- Johnson, L. L. Arthroscopic abrasion arthroplasty historical and pathologic perspective: present status. Arthroscopy. 2, 54-69 (1986).
- Steadman, J. R., Rodkey, W. G., Singelton, S. B., Briggs, K. K. Microfracture technique for full-thickness chondral defects: technique and clinical result. Operat. Tech. Orthop. 7, 300-304 (1997).
- Brittberg, M., et al. Treatment of deep cartilage defects in the knee with autologous chondrocyte transplantation. N. Engl. J. Med. 331, 889-895 (1994).
- Peterson, L., Vasiliadis, H. S., Brittberg, M., Lindahl, A. Autologous chondrocyte implantation: a long-term follow-up. Am. J. Sports Med. 38, 1117-1124 (2010).
- Nehrer, S., et al. Chondrocyte-seeded collagen matrices implanted in a chondral defect in a canine model. Biomaterials. 19, 2313-2328 (1998).
- Frenkel, S. R., Toolan, B., Menche, D., Pitman, M. I., Pachence, J. M. Chondrocyte transplantation using a collagen bilayer matrix for cartilage repair. J. Bone. Joint Surg. Br. 79, 831-836 (1997).
- Salzmann, G. M., et al. The dependence of autologous chondrocyte transplantation on varying cellular passage, yield and culture duration. Biomaterials. 32, 5810-5818 (2011).
- Frohlich, M., Malicev, E., Gorensek, M., Knezevic, M., Kregar Velikonja, N. Evaluation of rabbit auricular chondrocyte isolation and growth parameters in cell culture. Cell Biol. Int. 31, 620-625 (2007).
- Willers, C., Chen, J., Wood, D., Xu, J., Zheng, M. H. Autologous chondrocyte implantation with collagen bioscaffold for the treatment of osteochondral defects in rabbits. Tissue Eng. 11, 1065-1076 (2005).
- Vogt, S., et al. The influence of the stable expression of BMP2 in fibrin clots on the remodelling and repair of osteochondral defects. Biomaterials. 30, 2385-2392 (2009).
- Ueblacker, P., et al. In vivo analysis of retroviral gene transfer to chondrocytes within collagen scaffolds for the treatment of osteochondral defects. Biomaterials. 28, 4480-4487 (2007).
- Marlovits, S., Zeller, P., Singer, P., Resinger, C., Vecsei, V. Cartilage repair: generations of autologous chondrocyte transplantation. Eur. J. Radiol. 57, 24-31 (2006).
- Benya, P. D., Shaffer, J. D. Dedifferentiated chondrocytes reexpress the differentiated collagen phenotype when cultured in agarose gels. Cell. 30, 215-224 (1982).
- Rudert, M., Hirschmann, F., Wirth, C. J. Growth behavior of chondrocytes on various biomaterials. Orthopade. 28, 68-75 (1999).
- Hsu, S. H., et al. Evaluation of biodegradable polyesters modified by type II collagen and Arg-Gly-Asp as Tissue Engineering scaffolding materials for cartilage regeneration. Artificial Organs. 30, 42-55 (2006).
- Brun, P., Cortivo, R., Zavan, B., Vecchiato, N., Abatangelo, G. In vitro reconstructed tissues on hyaluronan-based temporary scaffolding. J. Mater. Sci. Mater. Med. 10, 683-688 (1999).
- Domm, C., Fay, J., Schunke, M., Kurz, B. Redifferentiation of dedifferentiated joint cartilage cells in alginate culture. Effect of intermittent hydrostatic pressure and low oxygen partial pressure. Orthopade. 29, 91-99 (2000).
- Kimura, T., Yasui, N., Ohsawa, S., Ono, K. Chondrocytes embedded in collagen gels maintain cartilage phenotype during long-term cultures. Clin. Orthop. Relat. Res. , 231-239 (1984).
- Kon, E., et al. Second-generation autologous chondrocyte implantation: results in patients older than 40 years. Am. J. Sports Med. 39, 1668-1675 (2011).
- Gavenis, K., Schmidt-Rohlfing, B., Mueller-Rath, R., Andereya, S., Schneider, U. In vitro comparison of six different matrix systems for the cultivation of human chondrocytes. In Vitro Cell Dev. Biol. Anim. 42, 159-167 (2006).
- Niemeyer, P., et al. Characteristic complications after autologous chondrocyte implantation for cartilage defects of the knee joint. Am. J. Sports Med. 36, 2091-2099 (2008).
- Tay, L. X., et al. Treatment outcomes of alginate-embedded allogenic mesenchymal stem cells versus autologous chondrocytes for the repair of focal articular cartilage defects in a rabbit model. The American Journal of Sports Medicine. 40, 83-90 (2012).
- Brittberg, M., Nilsson, A., Lindahl, A., Ohlsson, C., Peterson, L. Rabbit articular cartilage defects treated with autologous cultured chondrocytes. Clin. Orthop. Relat. Res. , 270-283 (1996).
