Summary
Detta är en tid - och cost effective in vitro- protokoll undersöka mekanismer för förvärvad resistens mot riktade terapeutiska medel, vilket är en mycket medicinska behov i cancer management.
Abstract
De senaste två decennierna har sett en förskjutning från cytostatika till riktad terapi i medicinsk onkologi. Även om riktade terapeutiska medel har visat mer imponerande klinisk effekt och minimerade biverkningar än traditionella behandlingar, har resistens blivit den största begränsningen till deras förmåner. Flera prekliniska/in vitro- / invivo modeller av förvärvad resistens mot riktade agenter i klinisk praxis har utvecklats främst med hjälp av två strategier: i) genmanipulation för modellering genotyper av förvärvad resistens, och ii) in vitro / invivo urval av resistenta modeller. I den nuvarande arbetet föreslår vi en sammanhållande ram, för att undersöka de bakomliggande mekanismerna ansvariga för förvärvad resistens mot riktade terapeutiska medel, start från generationen av resistenta cellulära subkloner till beskrivningen av tysta förfaranden som används för att återställa känsligheten till hämmaren. Denna enkla tid och cost effective strategi är allmänt tillämplig och kunde enkelt utökas till att undersöka resistensmekanismer till andra riktade terapeutiska läkemedel i olika tumör histotypes.
Introduction
Följa upp de avgörande upptäckterna i molekylära och cellulära biologi, har ett antal nya syntetiserade anticancer molekyler utvecklats för att selektivt rikta onkogena signalvägar i ett brett spektrum av tumörtyper. Särskilt två kategorier av riktade terapeutiska medel med unika egenskaper i onkologi, nämligen syntetiska kemiska föreningar och rekombinant monoklonala antikroppar, är kända för att ha uppnått kliniska framgångar och dramatiskt förändrad cancervården i senaste decennierna1,2,3.
Ändå, trots sin imponerande initialt svar på behandling, majoriteten av cancerpatienter har utvecklat resistens mot alla riktade terapeutiska medel, monoklonala antikroppar såväl kinashämmare. Som en följd är läkemedelsresistens, det stora hindret för klassiska anti-cancer läkemedel4, fortfarande en stor utmaning för framväxande riktade terapier5,6.
Resistens mot riktad terapi kan vara inneboende (dvsprimära) eller förvärvad (dvssekundär). Inneboende resistens beskriver de novo brist på svar på behandling, medan sekundär motstånd uppstår efter en period av svar till drogen behandling7. Den senare orsakas av utbrott av små kohorter av tumörceller inom huvuddelen av primitiva tumören eller inbäddat i distala kryptiska anatomiska nischer, motstånd till en eller flera uppvisar upp till 90% och riktade terapeutiska medel. Molekylära mekanismer bakom en resistensutveckling till riktad terapi främst resultera från målet genmutationer och redundant aktivering av andra Pro överlevnad signalvägar, vars förståelse är fortfarande långt ifrån fullständig8.
I detta arbete föreslog vi en tid och cost effective metod för att undersöka in vitro- mekanismer av förvärvad resistens mot riktade terapeutiska medel, start från generationen av resistenta cellulära subkloner till beskrivningen av ljuddämpning förfaranden som används för att återställa känsligheten till den-hämmaren, ett viktigt verktyg som används för att testa och validera arbetshypoteser. I synnerhet användes vår strategi för att undersöka, i magsäckscancer, resistensmekanismer för att trastuzumab (t.ex., Herceptin), en humaniserad monoklonal antikropp som inriktning på det extracellulära området av HER2 protein9. Trastuzumab + kemoterapi är allmänt accepterade som standard första linjens behandling vid HER2-positiv metastaserad bröstcancer. Tack vare senaste prekliniska studier som visar att anti-HER2 terapier har betydande verksamhet i både in vitro- och in-vivo HER2-positiv ventrikelcancer modeller10,11, molekylär droger inriktning HER2 har varit utförligt undersökt i kliniska prövningar, är av vilka några fortfarande pågående, på patienter med gastroesofageal cancer12,13,14,15.
Dessa studier har betonat det ökande antalet patienter som upplever motstånd mot trastuzumab16, på samma sätt som vad som observerats för andra riktade terapeutiska hämmare. I synnerhet trastuzumab svar var 47% och medianvärdet för total överlevnad för patienter om trastuzumab + kemoterapi var endast 2,7 månader längre än för patienter på kemoterapi ensam17. Detta föreslog att primära trastuzumab motstånd är förhärskande, sekundära trastuzumab motstånd är oundvikligt. Av denna anledning finns det brådskande behovet av att klargöra de mekanismer som orsakar HER2-riktad terapi motståndet i magsäckscancer, vilket är ännu mer problematiskt ges intra-tumoral genetisk heterogenitet i neoplasi18.
Dessutom har resistensmekanismer till trastuzumab i magsäckscancer bevisat utmanande att förklara, delvis på grund av svårigheten att erhålla tillförlitlig prekliniska modeller representant för detta tillstånd. Oshima et al. rapporterade en vivo urval inloggningsmetod av trastuzumab-resistenta gastric cancer cellinjer, bestående av en upprepad kultur för en liten kvarstående peritoneal metastaser efter behandling med trastuzumab19. Dock bidragit behovet av en inhägnad, specifika djurhantering expertis och godkännande av djur etikkommittén till att göra det en tid och kostnad-tidskrävande metod. Den metod som vi beskriver i detta arbete är enkel och allmänt tillämpliga och kunde enkelt utökas till att undersöka resistensmekanismer för att andra terapeutiska läkemedel i olika tumör histotypes20.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Obs: Detta protokoll har anpassats specifikt för analys av mekanismerna bakom förvärvad resistens mot trastuzumab HER-positiv ventrikelcancer cellinjer. Alla laboratory instrument behövs redovisas i Tabell för material.
1. generering av riktade behandlingsresistenta subkloner
Obs: Detta är den mest kritiska och svåra att standardisera steg i protokollet på grund av att olika cellinjer kan uppvisar olika känslighet till den rikta terapeutiska hämmaren självständigt från deras tumör tidstrender eller drogen koncentration används.
- Kultur NCI-N87 cell linje i RPMI medium kompletteras med fetalt kalvserum (10%) och glutamin (2 mM, 1%), som en enskiktslager vid 37 ° C och utsäde det på 25 cm2 kultur kolvar.
- Lägga till odlingsmediet i varje kolv 10 µg/mL trastuzumab som startdosen. Exponera cellerna att startdosen tills de återupptar växer.
Obs: Startdosen av den riktad terapi-hämmaren bör vara 10-faldigt lägre än dess maximala plasmakoncentrationer. Maximal plasmakoncentration är den högsta nivån av drogen koncentration upptäckts i patientens blod vanligtvis efter multipla doser av standardbehandling. Detta värde kan hämtas från studier på farmakokinetiken. - Övervaka celltillväxt med metoden trypan blå utslagning; När celltillväxt återupptas (vanligtvis efter en period av två till tre veckor), utsätta celler till en 10-faldig högre dos koncentration av trastuzumab.
- Utsätta celler till en gradvis ökande dos av trastuzumab (från 100 µg/mL till 400 µg/mL) tills cellerna håll växer (efter ca 2 veckor) trots närvaron av en hög drog koncentration (minst 2,5 - 4-fold högre än plasma peak).
-
Utföra en clonogenic analys för att utvärdera nivån av resistens mot riktad terapi vid varje förändring i koncentrationen av den målet terapi-hämmaren i odlingsmediet och definiera relativ resistens IC50 index (RR IC50) enligt följande.
- Utsäde 500 celler i 24 flera kultur plattor.
Obs: 5 brunnar måste förberedas för varje villkorsuppsättning. - Utsätta celler för ökande mål terapi hämmare (trastuzumab) koncentrationen från 100 µg/mL upp till 400 µg/mL.
- Inkubera cellerna i en CO2 inkubator vid 37 ° C i 15 dagar.
- Efter inkubation, fixa och fläcken prover enligt följande.
- Ta bort medium och skölj celler med 10 mL 1 x PBS. Ta bort 1 x PBS och tillsätt 2-3 mL fixering lösning (acetic acid: metanol, 1:7, (vol/vol)). Ta bort den fixering lösningen och tillsätt kristallviolett lösning 0,5%. Odla i rumstemperatur för 2 h
- Ta bort kristallviolett lösningen noggrant genom att aspirera med en pipett och fördjupa plattor i kranvatten för att skölja bort rester kristallviolett lösning. Lufttorka i rumstemperatur i upp till 2 dagar.
- Räkna kolonier av mer än 50 celler med ett inverterat Mikroskop (4 X förstoring).
Obs: Två oberoende observatörer behövs för detta. - Beräkna RR IC50 som förhållandet mellan värdet IC50 mål-terapi-resistent subclone celler och värdet av de ursprungliga/naiva cellerna.
- Utsäde 500 celler i 24 flera kultur plattor.
2. valideringsprotokoll för kandidat riktad terapi motståndet genen (R-genen)
Obs: Efter karakterisering av genuttryck, signaturer är associerade med den förvärvad resistens mot målet terapi och någon kandidat gene som föraren av motstånd kommer att undersökas genom: a) RT-PCR, och b) Western blot analys.
-
Real-Time RT-PCR
- Extrahera total-RNA från cellinjer med syra guanidinium kaliumtiocyanat-fenol-kloroform blandning (se Tabell för material).
- Utföra omvänd Transkription (RT) reaktioner med slumpmässiga hexamer primers och ange termocykel följande: priming vid 25 ° C i 5 min, RT på 46 ° C i 20 min och RT inaktivering vid 95 ° C i 1 min.
- Använd 400 ng av total-RNA för en 20 µL reaktion. Förbereda reaktionsblandningen för prov enligt följande: 7 µL RNase gratis H2O, 2 µL cDNA (10 ng/µL), 1 µL 20 x lysrör-märkt mål-specifika sonden och 10 µL 2 x Mix innehållande buffert, dNTP och DNA-polymeras (se Tabell för material).
- Tillsätt 20 µL av reaktionsblandningen att varje väl platta och kör följande program: holding scenen vid 50 ° C i 2 min, vid 95 ° C i 10 min (1 cykel); sedan 40 cykler vid 95 ° C under 15 s och vid 60 ° C i 1 min.
-
Western blot
- Återställa cellsuspensioner genom att tillsätta 2 mL 0,05% trypsin/EDTA-lösning och ger 2-3 min för trypsin att arbeta.
- Lägg till 2 volymer medium innehållande 10% fetalt bovint serum att neutralisera trypsin (t.ex., 2 mL medium för varje 1 mL av trypsin) och centrifugera vid 1,200 x g för 5 min. Kassera supernatanten och tvätta cellerna med kall 1 x PBS.
- Centrifugera vid 1200 x g i 5 min och Kassera supernatanten. Återsuspendera cellpelleten med lyseringsbuffert och inkubera i en rocker vid 4 ° C i 30 min.
- Lyseringsbuffert beror på antalet celler (t.ex., 100 µL för 1 x 106 celler); Se till att förbereda färska lyseringsbuffert varje gång. För 1 mL lysis buffert förberedelse (lämna på is): Använd 975 µL M-PER däggdjur lysate buffert 15 µL proteas och fosfatas hämmare och 10 µL 100 µM PMSF-hämmare.
- Återställa proteinet supernatanten genom cell lysate centrifugering vid 13 000 x g vid 4 ° C under 15 minuter.
- Fastställa de protein koncentrationerna med hjälp av en BCA protein assay.
- Lägga till 4 x LaemmLi prov buffert protein prover (minst 20-30 µg av protein) och värme vid 100 ° C under 3 minuter.
- Använda förtillverkade 4-20% geler och ladda 20-30 µg LaemmLi protein lösning och 5 – 10 µL av protein standard per prov.
- Fyll i Western blot ringen med TRIS/GLICYNE /SDS 1 x buffert och köra gel vid 110 V för 30-60 min (när tiden stannar Kontrollera att färgen har nått slutet av gelen, annars köra några extra minuter)
- Electroblot överföra protein i PVDF membran (se Tabell för material) med hjälp av en halvtorr system.
- Blockera membranet genom blötläggning i lämpliga protein lösningen (mjölk/BSA 5%) på skakapparaten i rumstemperatur för 1 h.
- Gör en 1: 400 lösning med anti-IQGAP1 primär antikropp i en lösning med 5% i mjölk (se Tabell för material).
- Placera membranet i primär antikropp lösning på en shaker i ett kallt rum över natten.
- Följande dag, kassera lösningen antikropp och Blötlägg i T-TBS 1 x lösning (1 x T-TBS: 1 x Tris saltlösning buffert lagt till av Tween20 0,1%) på en shaker vid rumstemperatur för 7 min.
- Kassera T-TBS 1 x lösning och ersätt. Upprepa 3 gånger.
- Göra en 1:10,000 sekundära mus-antikropp lösning genom att tillsätta antikropp för standard Western blot upptäckt (se Tabell av material) och placera membranet på en shaker; lämna i rumstemperatur i 2 h.
- Kassera den antikropp lösningen och Blötlägg i T-TBS 1 x lösning på en shaker vid rumstemperatur för 7 min.
- Kassera T-TBS 1 x lösning och ersätt. Upprepa 3 gånger.
- Blötlägg membran för 5 min i en kemiluminiscent lösning och bild membranet på en chemiluminescence imager.
3. återställa målet-terapi hämmare känslighet av kandidat R-gen Knock-down
-
Cell förberedelse
- Förbered enda cellsuspension av trypsinization. Utföra transfection dag som cellerna är klädd.
- Tvätta NCI-N87 celler med PBS och inkubera vid 37 ° C med 0,05% trypsin/EDTA-lösning för 5-10 min. Tillsätt 2 volym RPMI medium innehållande 10% fetalt bovint serum att neutralisera trypsin (t.ex., 2 mL medium för varje 1 mL av trypsin).
- Räkna celler med en hemocytometer som använder trypan blå färgning. Utsäde 2,5 x 105 celler (60% confluence) på en T25 cm2 kolv för varje villkor.
Obs: Lämpligt antal celler för sådd bestäms av cellinje fördubbling tid och varaktigheten av experimentet. Syftet är att uppnå målgenen knock-down för hela experimentet. Nio T25 cm2 kolvar är idealiska för transfection förhållanden och clonogenic analysen (3 kolvar för kontroller, 3 kolvar för negativa transfection kontroller, 3 kolvar för gen-target transfection).
- Förbered enda cellsuspension av trypsinization. Utföra transfection dag som cellerna är klädd.
-
Omvänd transfection
- Förbereda gen-målet och negativ kontroll transfection mix för varje T25 cm2 kolv enligt följande.
- Späd 12,5 µL av varje gen-targeting siRNA oligonukleotider eller negativkontroll siRNA oligonukleotider i minimal väsentliga transfection medium (baserat på 1:55, se Tabell för material).
- Lägga till ett katjonaktiva Liposom transfection reagens (1:1-förhållande med gen-targeting siRNA oligonukleotider, se Tabell för material). Odla i rumstemperatur i 20 min.
Obs: Den totala volymen av transfection mixen är 700 µL. - Tillsätt 700 µL transfection mixen i varje T25 cm2 kolv. Inkubera cellerna vid 37 ° C i 1-3 dagar.
- Verifiera gen knock-down genom RT-PCR och Western blot analys. Dubbelkolla inverkan av förmodad R-gen knock-down på känslighet återställande till riktad terapeutisk agent genom kolonin bildandet experiment (Upprepa steg 1,5).
- Förbereda gen-målet och negativ kontroll transfection mix för varje T25 cm2 kolv enligt följande.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1 beskriver ramen för experimentella förfarandet. Tre gastric cancer cell-linjer att uttrycka en hög nivå av HER2 och känsliga för trastuzumab (IC50 < peak plasmanivå av drogen, figur 2A, vänstra grafen) odlades i odlingsmedium som innehåller den rikta terapeutisk agenten. En dos 10-faldigt lägre än den maximala plasmakoncentrationen av trastuzumab (10 µg/mL) sattes som startdosen, och gradvis ökas till 400 µg/mL under 8-12 månader. Efteråt fick vi tre subkloner kännetecknas av en stabil motstånd fenotyp med IC50 värden lägre än de maximala plasmanivåerna av trastuzumab (figur 2A, höger diagram). I synnerhet nådde de mest motståndskraftiga subclone, HR NCI N87, en RR IC50 värde på 28,57 (figur 2B). IQGAP1 tycks spela en central roll i motståndet fenotypen av HR NCI N87 sub linjen. Analyser av protein och gen uttryck stöds denna hypotes: IQGAP1 protein i den resistent subclone är cirka 5 gånger högre än i föräldrarnas cellerna. Likaså är korrespondent IQGAP1 genuttryck 2,5 gånger högre i HR NCI N87 sub linje än i NCI N87 linje (figur 3A).
IQGAP1 nedtystning utfördes för att utvärdera dess roll i utvecklingen av trastuzumab resistenta fenotypen. Protokollet som används för att tysta IQGAP1 genuttryck visat sig vara särskilt effektivt att slå ner IQGAP1 proteininnehållet på nästan alla celler odlas i en T25 cm2 cell kultur kolv (ca 2,5 x 105 celler) (figur 3A).
Dessutom bekräftade clonogenic analysens arbetshypotesen, visar att IQGAP1 nedtystning återställer trastuzumab känslighet i HR NCI N87 celler vilket framgår av en sänkning av IC50 värde 7 µg/ml (figur 3B).
Figur 1: ram för in vitro- analys av mekanismerna bakom förvärvade riktade terapimotstånd. Tre olika trastuzumab-resistenta subkloner härrör från tre olika trastuzumab-känsliga cancer cellinjer var genereras och kännetecknas för förändringar i HER2-signalering mekanismer av nästa generations sekvensering, immunhistokemiska, Western Blot och RT-PCR-tekniker. Alla subkloner visade en mekanism för olika motstånd. Riktad terapi känslighet återställdes i en viss subclone när kandidat förare gen för resistens tystnade. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Bestämning av relativ resistens IC50 index (RR IC50) via clonogenic assay i gastric cancer cellinjer. (A) tillväxt kurvor data för naiva (vänstra grafen) och resistenta (höger diagram)-cellinjer som genereras av kolonibildande experiment. X-axeln representerar trastuzumab koncentration. Felstaplar representera standardavvikelsen (SD). Standardavvikelsen översteg aldrig 5%. (B) representativa bilder av clonogenic analysen stöder generering av en NCI-N87-resistent subclone. Som framgår av tidslinjen, krävs generering av HR trastuzumab NCI N87 celler 12 månaders kontinuerlig exponering för riktade agenten. Denna siffra är anpassad av Arienti et al. arbete 9 Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: återställa trastuzumab känslighet av IQGAP1 gen knock-down. (A) IQGAP1 proteinhalt, genom Densitometrisk analys visas i stapeldiagrammet, i föräldrarnas NCI N87 linje och i dess resistenta och tystas-resistenta subclone (vänstra grafen). MRNA IQGAP1 uttryck nivå bekräftades också i alla tre cell-linjer genom RT-PCR-teknik (höger diagram). Data presenteras som medelvärdet ± SD. (B) Clonogenic assay visade olika känslighet av föräldrarnas NCI N87 linje och i dess resistenta och tystas-resistenta subclone till 100 µg/mL trastuzumab. Kolonin räknades efter 14 dagar av cell utsäde. Miniatyr siffror visar representativa kolonin kulturer. Denna siffra är anpassad av Arienti et al. arbete 9 Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Steg | Protokollet | T25 cm2 |
| Utsäde celler 60% konfluenta | Vidhäftande celler | 1,75 x 103 |
| Späd siRNA oligonukleotider i Minimal väsentliga Transfection medium (baserat på 1:55) | siRNA | 12.5 ΜL |
| Transfection medium | 687.5 ΜL | |
| Tillsätt Lipofectamine transfection reagens | Lipofectamine reagens | 12.5 ΜL |
| Inkubera | Odla i rumstemperatur i 20 min | |
| Tillsätt blandningen till celler | Inkubera cellerna vid 37 ° C i 1-3 d | |
Tabell 1: Rekommenderade reagens belopp och volymer för kandidat motstånd gen knock-down.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Även personlig och riktade terapier har lett till växande entusiasm, dessa så kallade ”smarta” behandlingar står inför samma stora hinder som traditionell kemoterapi droger, dvs, snabba och oförutsägbara förvärv av läkemedelsresistens. För att förbättra resultaten av riktad terapi, måste läkemedelsresistens problem lösas genom en bättre förståelse av de mekanismer som orsakar dem. Vi presenterade här, en lättillgänglig in vitro- Metod för att undersöka mekanismerna av förvärvad resistens mot riktad terapi droger i cancer cell linje modeller.
Generering av riktade behandlingsresistenta subkloner är den mest kritiska och svåra att standardisera steg i detta protokoll, på grund av den inneboende genetiska heterogeniteten mellan de cellinjer som används, och att deras olika grad av drogen känslighet. Av dessa skäl, kan den tid som krävs för att erhålla resistenta subkloner variera. Kronisk exponering för molekylär cytostatika orsakar normalt en stark tumör tillväxthämning. Men efter en variabel kontinuerlig läkemedelsexponering (8-12 månader) återupptar celler tillväxt med en hastighet som är liknande till det av kontrollgrupp celler.
Dessutom, trots att genuttryck som data har använts till hypotes gen-relaterade mål terapimotstånd, en olika uttryck nivå inte alltid återspeglar en felaktig proteinfunktion eller korrelerar med motstånd fenotypen. På grund av komplexiteten i relationen mellan ett uttryck för den förmodade resistenta genen och motståndet mot den riktad terapin behövs molekylär utredningar ytterligare, såsom bioinformatik analys, inklusive gen och protein interaktion, biologisk process anrikning och molekylär modellering.
En annan kritisk punkt kan vara specificitet och noggrannhet siRNA oligonukleotiden att minska mål uttryck. En möjlig lösning kan vara användning av designverktyg för att välja funktionella siRNA och en blandning av siRNA för samma målgenen.
Slutligen är en mindre begränsning relaterad till den metod som används för att återställa känsligheten den riktad terapi-hämmare på grund av transfection övergående varaktighet. Maximal knock-down av rikta mRNA (> 85%) rapporterades på dag 2 efter transfection och underhölls > 80% genom dagar 5-7. Betydande knock-down, om än mindre i omfattning, observerades fortfarande på dag 6. Av denna anledning bör cytotoxicitet analysen för att kontrollera återställandet av drogen känslighet utföras inom ca 5 dagar från nedtystning.
Våra protokoll är en tid - och cost effective metod för undersökning av in vitro- förvärvat resistens. Generering av resistenta subkloner, kunde spegling intra-tumör heterogenitet av cancerceller, hjälpa avslöja nya mekanismer av förvärvad resistens mot riktade cytostatika. Särskilt, är de mer lämpade för hög genomströmning genomisk eller proteomiska filmvisningar för att identifiera molekylära förändringar i resistenta celler än sina känsliga motsvarigheter.
Denna prekliniska plattform kan enkelt förlängas för att undersöka allmänna resistensmekanismer till riktade terapeutiska medel i olika tumör histotypes, som tillhandahåller ett standardförfarande för upptäckten av ytterligare målmolekyler för att övervinna läkemedelsresistens.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Författarna vill tacka Dr Veronica Zanoni för redigering manuskriptet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Trizol Reagent | Invitrogen | 15596026 | TRIzol Reagent is a reagent for isolating high-quality total RNA or simultaneously isolating RNA, DNA, and protein from a variety of biological samples |
| ISCRIPT CDNA SYNTHESIS KIT | Bio-Rad | 1708891 | The iScript cDNA synthesis kit is a sensitive and easy-to-use first-strand cDNA synthesis kit for gene expression analysis using real-time qPCR. |
| TaqMan gene expression assay | Life Technologies | 4331182 | Applied Biosystems TaqMan Gene Expression Assays consist of a pair of unlabeled PCR primers and a TaqMan probe with an Applied Biosystems FAM or VIC dye label on the 5’ end and minor groove binder (MGB) and nonfluorescent quencher (NFQ) on the 3’ end. |
| M-PER Mammalian Protein Extraction Reagent | Thermo Scientific | 78501 | Thermo Scientific M-PER Mammalian Protein Extraction Reagent is designed to provide highly efficient total soluble protein extraction from cultured mammalian cells. |
| Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail (100X) | Thermo Scientific | 78440 | Thermo Scientific Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail (100X) provides the convenience of a single solution with full protein sample protection for cell and tissue lysates. |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23225 | The Thermo Scientific Pierce BCA Protein Assay Kit is a two-component, high-precision, detergent-compatible assay reagent set to measure (A562nm) total protein concentration compared to a protein standard. |
| 4x Laemmli Sample Buffer | Bio-Rad | 1610747 | Use 4x Laemmli Sample Buffer for preparation of samples for SDS PAGE. For reduction of samples, add a reducing agent such as 2-mercaptoethanol to the buffer prior to mixing with the sample. |
| 4–20% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels | Bio-Rad | 456-1094 | Long-life TGX (Tris-Glycine eXtended) Gels have a novel formulation and can be used for both standard denaturing protein separations as well as native electrophoresis. |
| Precision Plus Protein WesternC Blotting Standards | Bio-Rad | 1610376 | Precision Plus Protein Prestained Standards are available in Dual Color, All Blue, Kaleidoscope, and Dual Xtra formats. All four have the same gel migration patterns, with 3 high-intensity reference bands (25, 50, and 75 kD). |
| 10x Tris/Glycine/SDS | Bio-Rad | 1610732 | 10x Tris/glycine/SDS is a premixed running buffer for separating protein samples by SDS-PAGE. |
| Trans-Blot Turbo Mini PVDF Transfer Packs | Bio-Rad | 1704156 | Trans-Blot Turbo Mini PVDF Transfer Packs for fast, efficient transfer of proteins from mini gels using the Trans-Blot Turbo Transfer System. Each vacuum sealed, ready-to-use transfer pack contains two buffer-saturated ion reservoir stacks and a prewetted PVDF membrane. |
| Precision Protein StrepTactin-HRP Conjugate | Bio-Rad | 1610381 | StrepTactin-Horseradish Peroxidase (HRP) Conjugate for chemiluminescent or colorimetric detection of Precision Plus Protein Unstained Protein Standards or Precision Plus Protein WesternC Protein Standards on western blots. |
| Immun-Star WesternC solution | Bio-Rad | 5572 | Immun-Star WesternC solution, a method of protein detection , detects mid-femtogram amounts of protein. |
| Universal Negative Control | Invitrogen | 12935300 | Negative Control siRNA has no significant sequence similarity to mouse, rat, or human gene sequences. The control has also been tested in cell-based screens and proven to have no significant effect on cell proliferation, viability, or morphology. |
| opti-MEM Glutamax Medium | Thermo Fisher Scientific | 51985026 | Opti-MEM Medium is an improved Minimal Essential Medium (MEM) that allows for a reduction of Fetal Bovine Serum supplementation by at least 50% with no change in growth rate or morphology. |
| Silencer Select Pre-Designed & Validated siRNA | Ambion | 4390824 | RNA interference (RNAi) is the best way to effectively knock down gene expression to study protein function in a wide range of cell types. |
| Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent | Invitrogen | 13778075 | Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent offers an advanced, efficient solution for siRNA delivery. No other siRNA specific transfection reagent provides such easy and efficient siRNA delivery in a wide variety of cell lines including common cell types, stem cells and primary cells, as well as traditionally hard-to-transfect cell types. |
| Mouse anti-IQGAP1 | Invitrigen | 33-8900 | working concentration: 1:400 in 5% milk solution |
| goat anti-mouse IgG-HRP: sc-2005 | Santa Cruz | sc-2005 | working concentration: 1:10000 in 5% milk solution |
| PMSF | Sigma Aldrich | P 7626 | this is an inhibitor of serine proteases and acetylcholinesterase |
| Thermocycler for RT-PCR | MJ Research | MJ Research PTC-200 Thermal Cycler | it allows temperature homogeneity and a ramping speed of up to 3°C/sec. The protocol can be performed also with other thermalcyclers |
| Real Time RT-PCR instrument | Applied Biosystems | 7500 RT-PCR system | This is a five-color platform that uses fluorescence-based polymerase chain reaction (PCR) reagents to provide a relative quantification using comparative CT assay type. The protocol can be performed also with other thermalcyclers |
| Microvolume Spectrophotometers | Thermo Scientific | Nanodrop | It provides an accurate and fast acid nucleid measurement using little volume of sample |
| Blotting system | Bio-Rad | Trans-Blot Turbo system | It perfoms a semy-dry transfer in a few minutes |
| Image acquisition system and gel documentation | Bio-Rad | Chemidoc image system | It is easy to use for chemiluminescent detection |
References
- Gerber, D. E. Targeted therapies: a new generation of cancer treatments. Am Fam Physician. 77 (3), 311-319 (2008).
- Zhang, J., Yang, P. L., Gray, N. S. Targeting cancer with small molecule kinase inhibitors. Nat Rev Cancer. 9 (1), 28-39 (2009).
- Nelson, A. L., Dhimolea, E., Reichert, J. M. Development trends for human monoclonal antibody therapeutics. Nat Rev Drug Discov. 9 (10), 767-774 (2010).
- Chabner, B. A., Roberts, T. G. Timeline: Chemotherapy and the war on cancer. Nat Rev Cancer. 5 (1), 65-72 (2005).
- Gilbert, L. A., Hemann, M. T. Chemotherapeutic resistance: surviving stressful situations. Cancer Res. 71 (15), 5062-5066 (2011).
- Izar, B., Rotow, J., Gainor, J., Clark, J., Chabner, B. Pharmacokinetics, clinical indications, and resistance mechanisms in molecular targeted therapies in cancer. Pharmacol Rev. 65, 1351-1395 (2013).
- Ellis, L. M., Hicklin, D. J. Resistance to Targeted Therapies: Refining Anticancer Therapy in the Era of Molecular Oncology. Clin Cancer Res. 15 (24), 7471-7478 (2009).
- Asić, K. Dominant mechanisms of primary resistance differ from dominant mechanisms of secondary resistance to targeted therapies. Crit Rev Oncol Hematol. 97, 178-196 (2016).
- Arienti, C., et al. Preclinical evidence of multiple mechanisms underlying trastuzumab resistance in gastric cancer. Oncotarget. 7 (14), 18424-18439 (2016).
- Tanner, M., et al. Amplification of HER-2 in gastric carcinoma: association with Topoisomerase IIalpha gene amplification, intestinal type, poor prognosis and sensitivity to trastuzumab. Ann Oncol. 16 (2), 273-278 (2005).
- Bang, Y. J., et al. Trastuzumab in combination with chemotherapy versus chemotherapy alone for treatment of HER2-positive advanced gastric or gastro-oesophageal junction cancer (ToGA): a phase 3, open-label, randomised controlled trial. Lancet. 376 (9742), 687-697 (2010).
- ClinicalTrials.gov. Identifier NCT01130337. A Study of Capecitabine [Xeloda] in Combination With Trastuzumab [Herceptin] and Oxaliplatine in Patients With Resectable Gastric Cancer. , Available from: http://clinicaltrials.gov/show/NCT01130337 (2017).
- ClinicalTrials.gov. Identifier NCT01748773. A Study of the Combination of Oxaliplatin, Capecitabine and Herceptin (Trastuzumab) and Chemoradiotherapy in The Adjuvant Setting in Operated Patients With HER2+ Gastric or Gastro-Esophageal Junction Cancer (TOXAG Study). , Available from: http://www.clinicaltrials.gov/show/NCT01748773 (2017).
- ClinicalTrials.gov. Identifier NCT01472029. Explorative Phase II Study of Perioperative Treatment in Patients With Adenocarcinoma of the Gastroesophageal Junction or Stomach (HerFLOT). , Available from: http://www.clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT01472029 (2017).
- ClinicalTrials.gov. Identifier NCT01196390. Radiation Therapy, Paclitaxel, and Carboplatin With or Without Trastuzumab in Treating Patients With Esophageal Cancer. , Available from: http://clinicaltrials.gov/show/NCT01196390 (2017).
- Shimoyama, S. Unraveling trastuzumab and lapatinib inefficiency in gastric cancer: Future steps (Review). Mol Clin Oncol. 2 (2), 175-181 (2014).
- Kelly, C. M., Janjigian, Y. Y. The genomics and therapeutics of HER2-positive gastric cancer-from trastuzumab and beyond. J Gastrointest Oncol. 7 (5), 750-762 (2016).
- Wong, S. S., et al. Genomic landscape and genetic heterogeneity in gastric adenocarcinoma revealed by whole-genome sequencing. Nat Commun. 5, 5477 (2014).
- Oshima, Y., et al. Lapatinib sensitivities of two novel trastuzumab-resistant HER2 gene-amplified gastric cancer cell lines. Gastric Cancer. 17 (3), 450-462 (2014).
- Pignatta, S., et al. Prolonged exposure to (R)-bicalutamide generates a LNCaP subclone with alteration of mitochondrial genome. Mol Cell Endocrinol. 382 (1), 314-324 (2014).
