Summary
Un método simple, barato y eficaz de la preparación de los embriones de Drosophila para vivir de imágenes de análisis se presenta. El protocolo proporciona la humedad y el intercambio de gases y no comprime el embrión de Drosophila. Este método es adecuado para las buenas prácticas agrarias basadas en imágenes en vivo de embriones de Drosophila utilizando un microscopio estereoscópico o el microscopio compuesto en posición vertical.
Abstract
La proteína verde fluorescente (GFP) basado en timelapse en vivo de imágenes es una técnica poderosa para el estudio de la regulación genética de procesos dinámicos, como la morfogénesis de tejidos, la adhesión célula-célula, o muerte celular. Embriones de Drosophila que expresan GFP son fácilmente imágenes utilizando microscopía estereoscópica o confocal. Uno de los objetivos del protocolo en vivo de imágenes es reducir al mínimo los efectos perjudiciales tales como la deshidratación y la hipoxia. Protocolos anteriores para la preparación de los embriones de Drosophila para vivir de imágenes de análisis que consistía en colocar los embriones dechorionated en el aceite de halocarbonos y intercalando entre ellos una halocarbonos permeables al gas de membrana y un cubreobjetos
Protocol
Preparación
- Recoger los embriones en el estándar placas de agar jugo de uva-4. Es conveniente utilizar un sistema automatizado de Drosophila huevo Collector (flymax Scientific Equipment Ltd.). El uso sincrónico realizaron colecciones embrión reducir el número de dechorionations que se deben realizar a fin de obtener un número suficiente de embriones en la etapa de desarrollo deseado.
- Prepare una diapositiva dechorionation uniendo un pedazo de cinta de doble cara a un portaobjetos de microscopio, retire el papel protector de la cinta.
- Prepare la cámara de imágenes en vivo cortando un pedazo de tejido para que quepa en el pozo de la cámara. Coloque el tejido en el pozo y mojado con agua destilada.
- Mezcle el aceite de halocarbonos (halocarbonos Products Corp.) la viscosidad de la serie 700 y serie 56 en una proporción de 1:1. La mezcla puede ser almacenada y utilizada de forma indefinida.
- Coloque varias gotas de aceite de halocarbonos en la superficie de un cubreobjetos (22 x 40 mm, n º 2). El volumen no es crítica, pero debe ser del orden de l 20-40.
Procedimiento
- Con la ayuda de un microscopio estereoscópico, recoger los embriones de la uva agar jugo de placas utilizando un par de pinzas de joyero (N º 5) o un pincel muy fino. Embriones tienden a pegarse entre sí y con puntas de la pinza ", fácilmente se reunieron en grupos.
- Con la ayuda de un microscopio estereoscópico, baje suavemente las acumulaciones de embriones que se han adherido a las puntas de la pinza sobre la superficie de la cinta en la diapositiva dechorionation.
- Una vez más utilizando el microscopio estereoscópico, suavemente empujón o un accidente cerebrovascular que los embriones con el lado de la pinza con el fin de romper el corion cerosa exterior sin romper la membrana vitelina interna (el embrión va a estallar si la membrana vitelina se rompe).
- Una vez que el corion exterior se ha roto, se burlan de el embrión del corion, el embrión dechorionated tiende a adherirse a la superficie de las pinzas. Tenga cuidado de no tocar el embrión dechorionated a la superficie de la cinta.
- Tan pronto como un embrión es dechorionated, rápidamente se traslado a la caída previamente preparado de aceite de halocarbonos en el cubreobjetos. Toque la punta de la pinza que lleva el embrión dechorionated a la superficie de la gota de aceite de halocarbonos - esto desplaza el embrión de la pinza en el aceite.
- Confirmar la transferencia del embrión a la gota de aceite. Esto se puede hacer a simple vista, siempre que se trabaja sobre un fondo negro y el uso de una fuente de iluminación de fibra óptica en un ángulo oblicuo.
- Antes de intentar dechorionate otro embrión, limpie el aceite de la pinza. Pinzas recubiertas de aceite tienen menos de compra en la superficie del corion, por lo que dechorionation más difícil.
- Dechorionated embriones son flotantes en el aceite de halocarbonos. Con unas pinzas o un pincel, y mientras se visualiza a través de un microscopio estereoscópico, empuje el embrión a la parte inferior de la gota de aceite y disponerla en la posición deseada.
- Rápidamente invertir el cubreobjetos sobre el pozo de la cámara de imágenes en vivo. Confirmar que los embriones están descansando contra el cubreobjetos en la orientación deseada. Debido a su flotabilidad en el aceite, los embriones ahora flotan en la superficie inferior del cubreobjetos. Fijar el cubreobjetos a la cámara de imágenes en vivo con cinta adhesiva. Ventilar la cámara haciendo agujeros en la cinta en la zona donde la cinta se extiende la brecha entre el final del cubreobjetos y el final del pozo de la cámara de imágenes en vivo.
- Un microscopio de fluorescencia en posición vertical o un microscopio estereoscópico de fluorescencia se puede utilizar ahora a la imagen de los embriones.
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Discussion
Se describe un nuevo método de preparación de los embriones de Drosophila para el análisis de imágenes en vivo, lo que llamamos el protocolo de gota. Por desgracia, no es posible utilizar el protocolo de gota si se trabaja con un microscopio invertido. En este caso la técnica de sándwich (como se describe en el resumen anterior) debe ser utilizado y la compresión de los embriones sigue siendo una preocupación.
En experimentos donde se mide la forma y el tamaño de la celda con el fin de calcular las fuerzas asociadas con el movimiento morfogenéticos, el uso de un microscopio vertical y el protocolo de gota se debe a la compresión preferible reducido del embrión. Además, la compresión reducido del embrión utilizando el protocolo de gota tiene como consecuencia la presentación de la superficie redondeada y sin distorsiones del embrión, mientras que la técnica de intercalar presenta una superficie plana. Cuando se utiliza la microscopía confocal es, por tanto, necesario recoger una. Amplia Z-stack (más cortes por pila) al utilizar el protocolo de gota en comparación con el método intercalando El aumento del número de cortes por Z-stack, sin embargo, aumenta el tiempo de adquisición, así como cualquier foto-toxicidad o la foto de blanqueo asociados con excitación láser. Claramente, el beneficio experimentales asociados a la compresión se reduce un poco compensado por un aumento en los tiempos de adquisición de Z-stack. A pesar de este aumento en el tiempo de adquisición de Z-stack, sin embargo, hemos observado la viabilidad de los embriones de excelente usando el protocolo de gota.
El protocolo de gota también se limita a la observación de los embriones por microscopía de fluorescencia, en el que la trayectoria de la luz incidente y la luz emitida no pasa a través de la cámara en vivo de imágenes. En vivo de imágenes de embriones mediante microscopía óptica DIC o no fluorescencia se puede lograr mediante la modificación de la cámara en vivo de imágenes para permitir a un paso de luz desde el condensador a través del embrión en suspensión.
Una preocupación cuando se utiliza la técnica de gota puede ser el movimiento no deseado o "deriva" de los embriones en el campo de visión durante la adquisición de timelapse. Al flotar contra la parte inferior del cubreobjetos invertido, nos encontramos con que los embriones son muy estables y no cambiar de posición cuando se utiliza tanto en seco como objetivos de inmersión en aceite. Multipunto adquisición timelapse con una platina del microscopio motorizado también no alterar las posiciones de los embriones que se preparan utilizando el protocolo de gota. Cualquier movimiento de embriones preparado con la técnica de gota puede ser eliminado mediante la reducción del tamaño de la gota de aceite de halocarbonos y asegurar que las gotas de aceite por separado no son la fusión o absorción a lo largo del borde de la imagen en vivo de la cámara también.
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Acknowledgments
Agradecemos el apoyo de la HRB a través de una beca de descubrimiento, así como herramientas de investigación y subvención de instrumentos de las Ciencias Naturales e Ingeniería de Investigación de Canadá (NSERC). También reconocemos H. Oda y el Bloomington Drosophila Stock Center para proporcionar materiales genéticos que se utilizaron en las secuencias de imágenes en vivo ejemplo.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Standard equipment and materials required to prepare embryos for live-imaging using the hanging drop protocol include the following items: microscope slides | |||
| coverslips (22 x 40 mm, No. 2) | |||
| double-sided tape | |||
| jeweller’s forceps (Dumont style No. 5) | |||
| halocarbon oil series 56 and series 700 (Halocarbon Products Corp.) | |||
| a utility knife or single edge razor blade | |||
| tissue paper | |||
| scissors | |||
| distilled water | |||
| general purpose tape | |||
| a pipet suitable for delivering 20-40 μl. | |||
| The live imaging protocol also requires a custom-made live imaging chamber. This is prepared by cutting a 5 mm think polycarbonate plastic sheet to the dimensions of a standard microscope slide (75 X 25 mm) and using a rotor to create a 3mm deep depression in the slide (20 X 55 mm). Access to a stereomicroscope (dissecting microscope) and a fiber-optic illumination source is also required. | |||
References
- Kiehart, D. P., Galbraith, C. G., Edwards, K. A., Rickoll, W. L., Montague, R. A. Multiple forces contribute to cell sheet morphogenesis for dorsal closure in Drosophila. J. Cell Biol. 149, 471-490 (2000).
- Schock, F., Perrimon, N. Cellular processes associated with germ band retraction in. , 248-2429 (2002).
- Reed, B. H., Wilk, R., Schock, F., Lipshitz, H. D. Integrin-dependent apposition of Drosophila extraembryonic membranes promotes morphogenesis and prevents anoikis. Curr. Biol. 14, 372-380 (2004).
- Wieschaus, E. p, Nusslein-Volhard, C. Drosophila: a practical approach. Roberts, D. B. , IRL Press Limited. Oxford, England. 199-227 (1986).
