Die Herstellung Drosophila Embryonen für Live-Imaging mit dem Hanging-Drop-Protokoll
Summary
Eine einfache, kostengünstige und effektive Methode zur Herstellung von Drosophila-Embryonen für die Live-imaging-Analyse vorgestellt. Unser Protokoll sieht vor Feuchtigkeit und Gasaustausch und komprimiert nicht die Drosophila-Embryo. Diese Methode eignet sich für GFP-basierte Live-Darstellung von Drosophila-Embryonen mit einem Stereomikroskop oder aufrecht zusammengesetzte Mikroskop.
Abstract
Das grün fluoreszierende Protein (GFP)-basierte Zeitraffer Live-imaging ist eine leistungsstarke Technik für die Untersuchung der genetischen Regulation von dynamischen Prozessen wie Gewebemorphogenese, Zell-Zell-Adhäsion oder Zelltod. Drosophila-Embryos, die GFP sind leicht abgebildet entweder mit stereoskopischen oder konfokalen Mikroskopie. Ein Ziel eines jeden Live-imaging-Protokoll ist es, schädliche Auswirkungen wie Dehydratation und Hypoxie zu minimieren. Vorherige Protokolle für die Vorbereitung Drosophila-Embryonen für die Live-imaging-Analyse beteiligt Platzierung dechorionated Embryonen in Halocarbonöl und sandwiching sie zwischen einem Halogenkohlenwasserstoff gasdurchlässige Membran und einem Deckglas<sup> 1-3</sup>. Die Einführung der Kompression durch die Montage Embryonen auf diese Weise stellt eine unerwünschte Komplikation für biomechanische-basierte Analyse der Morphogenese. Unsere Methode, die wir als die hängenden Tropfen Protokoll, ergeben sich ausgezeichnete Lebensfähigkeit von Embryonen während der Live-Bildgebung und verlangt nicht, dass Embryonen komprimiert werden. Kurz gesagt, beinhaltet die hängenden Tropfen Protokoll der Platzierung von Embryonen in einem Tropfen Halocarbonöl, die aus einem Deckglas, das ist wiederum in der Position über eine feuchte Kammer fest aufgehängt ist. Neben der Bereitstellung von Gasaustausch und verhindert Austrocknung, nimmt diese Anordnung den Vorteil des Auftriebs von Embryonen in Halocarbonöl sie davon abzuhalten, aus der Position im Zeitraffer Übernahme zu verhindern. Dieses Video beschreibt detailliert, wie zu sammeln und vorzubereiten Drosophila-Embryonen für die Live-Aufnahme nach dem hängenden Tropfen Protokoll. Dieses Protokoll eignet sich für die Bildgebung dechorionated Embryonen mit Stereomikroskopie oder aufrechte Verbindung Fluoreszenzmikroskop.
Protocol
Discussion
Wir beschreiben eine neue Methode zur Herstellung von Drosophila-Embryonen für die Live-Imaging-Analyse, die wir als die hängenden Tropfen Protokoll. Leider ist es nicht möglich, den hängenden Tropfen-Protokoll verwenden, wenn die Arbeit mit einem inversen Mikroskop. In diesem Fall wird die Sandwich-Technik (wie in der abstrakten oben beschrieben) verwendet werden muss und Kompression der Embryonen weiterhin Anlass zur Sorge.
In Experimenten, bei denen Zellen Form und Größe gemessen, u…
Acknowledgements
Wir bedanken uns für die Unterstützung zu BHR durch ein Discovery-Stipendium sowie ein Recherche-Tools und Instrumenten-Stipendium der Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC). Wir erkennen auch H. Oda und die Bloomington Drosophila Lager-Center für die Bereitstellung von genetischen Aktien, die im Beispiel Live-Imaging-Sequenzen verwendet wurden.
Materials
References
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