لإعداد ذبابة الفاكهة الأجنة لايف التصوير باستخدام بروتوكول إسقاط الشنق

Summary

ويقدم طريقة بسيطة وغير مكلفة وفعالة للتحضير للأجنة ذبابة الفاكهة تعيش التصوير التحليل. بروتوكول يتيح لنا الرطوبة والغاز والصرف لا ضغط الجنين ذبابة الفاكهة. هذا الأسلوب هو مناسبة لGFP القائم على التصوير المباشر للأجنة ذبابة الفاكهة باستخدام stereomicroscope أو تستقيم المجهر المركب.

Abstract

الأخضر ببروتين (GFP) المستندة timelapse الحية هي تقنية التصوير القوية لدراسة التنظيم الجيني للعمليات الحيوية مثل الأنسجة التشكل ، خلية التصاق الخلايا ، أو موت الخلية. يتم تصويرها بسهولة أجنة ذبابة الفاكهة معربا عن GFP باستخدام المجهر مجسمة أو مبائر. والهدف من أي بروتوكول الحية التصوير للحد من الآثار الضارة مثل الجفاف ونقص الأكسجين. وقد شملت البروتوكولات السابقة لإعداد أجنة ذبابة الفاكهة لحية التصوير تحليل وضع الأجنة dechorionated في مجال النفط والهالوكربون يقحم عليها بين الهالوكربون الغاز نفاذية الغشاء وساترة a^1-3. مقدمة للضغط المتزايد من خلال أجنة بهذه الطريقة يمثل مضاعفات غير مرغوب فيها عن أي تحليل النشاط الحيوي القائم على التشكل. لدينا الأسلوب ، الذي نسميه بروتوكول قطرة شنقا ، نتائج ممتازة في بقاء الأجنة الحية وخلال التصوير لا يتطلب أن تكون مضغوطة الأجنة. لفترة وجيزة ، وبروتوكول قطرة شنقا ينطوي على وضع الأجنة في قطرة من النفط الذي أوقف الهالوكربون من ساترة ، الذي هو ، بدوره ، أكثر من موقف ثابت في غرفة رطبة. بالإضافة إلى توفير تبادل الغاز ومنع الجفاف ، وهذا الترتيب يستفيد من الأجنة في انتعاش النفط الهالوكربون لمنعهم من الانجراف للخروج من الموقف خلال اقتناء timelapse. هذا الفيديو يصف بالتفصيل كيفية جمع وإعداد أجنة ذبابة الفاكهة للتصوير العيش باستخدام بروتوكول قطرة شنقا. هذا البروتوكول هو مناسبة لاجنة باستخدام التصوير dechorionated stereomicroscopy أو أي مركب مضان المجهر تستقيم.

Protocol

إعداد جمع الأجنة على مستوى لوحات أجار عصير العنب 4. وهو ملائمة لاستخدام الآلية ذبابة الفاكهة جامع البيض (Flymax العلمية معدات المحدودة). متزامن باستخدام نظم مجموعات الجنين وتقليل عدد dechorionations التي يجب تنفيذها من أج?…

Discussion

نحن تصف طريقة جديدة لإعداد أجنة ذبابة الفاكهة لتحليل التصوير الحي ، الذي نسميه بروتوكول قطرة شنقا. لسوء الحظ ، فإنه ليس من الممكن استخدام بروتوكول إسقاط عقوبة الاعدام شنقا اذا عمل مع مجهر مقلوب. ويجب في هذه الحالة يمكن استخدام هذه التقنية يقحم (كما هو موضح في أعلاه مج?…

Materials

Standard equipment and materials required to prepare embryos for live-imaging using the hanging drop protocol include the following items: microscope slides, coverslips (22 x 40 mm, No. 2), double-sided tape, jeweller’s forceps (Dumont style No. 5), halocarbon oil series 56 and series 700 (Halocarbon Products Corp.), a utility knife or single edge razor blade, tissue paper, scissors, distilled water, general purpose tape, and a pipet suitable for delivering 20-40 μl. The live imaging protocol also requires a custom-made live imaging chamber. This is prepared by cutting a 5 mm think polycarbonate plastic sheet to the dimensions of a standard microscope slide (75 X 25 mm) and using a rotor to create a 3mm deep depression in the slide (20 X 55 mm). Access to a stereomicroscope (dissecting microscope) and a fiber-optic illumination source is also required.