编制果蝇实时成像的胚胎使用悬滴协议

Summary

一个简单，廉价，​​有效的方法是准备住成像分析果蝇胚胎。我们的协议提供湿度和气体交换，不压缩的果蝇胚胎。这种方法适用于基于GFP的使用立体显微镜或直立复式显微镜的果蝇胚胎的实时成像。

Abstract

绿荧光蛋白质（GFP）为基础的timelapse生活成像的动态进程，如组织形态发生，细胞与细胞间的粘附，或细胞死亡的基因调控研究的一个强大的技术。果蝇胚胎表达GFP很容易使用以立体或共聚焦显微镜成像。任何带电成像协议的目标是尽量减少不利影响，如脱水和缺氧。前准备活成像分析果蝇胚胎的协议涉及dechorionated胚胎放置在卤烃油和夹层之间的卤烃气体渗透膜和盖玻片^1-3。通过引进安装胚胎的压缩，以这种方式为基础的生物力学分析任何形态发生不良并发症。我们的方法，我们称之为悬滴协议，在实时成像优秀的胚胎活力的结果，不需要胚胎被压缩。简单地说，悬滴协议涉及的胚胎在下降的卤烃油是从盖玻片，这是在潮湿室位置固定，暂停的位置。除了提供气体交换，防止脱水，这样的安排利用胚胎在卤烃油的浮力，以防止他们漂流timelapse收购期间的立场。本视频介绍了如何收集和准备现场使用悬滴协议成像果蝇胚胎细节。该协议是适合使用立体显微镜或任何正直的复合荧光显微镜成像dechorionated胚胎。

Protocol

制备收集胚胎标准的葡萄汁琼脂平板 4 。它方便地使用一个自动化的果蝇卵收集器（Flymax科学器材有限公司）。使用同步上演胚胎集合将减少必须执行，以获得足够数量的胚胎在发育阶段所需的数量dechorionations。 准备一个dechorionation幻灯片，附加了一块双面胶带载玻片;删除从磁带的支持。 准备切割一块组织，以适应在香港总商会以及实时成像室。在精心组织和湿用?…

Discussion

我们描述了一种实时成像分析，我们称之为悬滴协议的准备果蝇胚胎的新方法。不幸的是，它是不可能的使用悬滴协议，如果倒置显微镜工作。在这种情况下，夹层技术（抽象以上所述），必须使用压缩的胚胎仍然令人担忧。

在细胞的形状和大小进行测量，以计算力量与形态运动相关的实验，使用一个堂堂正正的显微镜和悬滴协议是可取的，因为胚胎压缩减少。此外，减少?…

Materials

Standard equipment and materials required to prepare embryos for live-imaging using the hanging drop protocol include the following items: microscope slides, coverslips (22 x 40 mm, No. 2), double-sided tape, jeweller’s forceps (Dumont style No. 5), halocarbon oil series 56 and series 700 (Halocarbon Products Corp.), a utility knife or single edge razor blade, tissue paper, scissors, distilled water, general purpose tape, and a pipet suitable for delivering 20-40 μl. The live imaging protocol also requires a custom-made live imaging chamber. This is prepared by cutting a 5 mm think polycarbonate plastic sheet to the dimensions of a standard microscope slide (75 X 25 mm) and using a rotor to create a 3mm deep depression in the slide (20 X 55 mm). Access to a stereomicroscope (dissecting microscope) and a fiber-optic illumination source is also required.