Hazırlanması Drosophila Embriyolar

Summary

Drosophila embriyolar canlı görüntüleme analizi hazırlama, basit, ucuz ve etkili bir yöntem sunulmuştur. Bizim protokol nem ve gaz değişimi sağlar ve Drosophila embriyo sıkıştırmak değil. Bu yöntem, GFP tabanlı bir stereomikroskopta ya da dik bileşik mikroskop kullanarak Drosophila embriyoların canlı görüntüleme için uygundur.

Abstract

Yeşil floresan proteini (GFP) timelapse canlı görüntüleme, doku morfolojilerinden, hücre-hücre adezyon veya hücre ölümü gibi dinamik süreçlerin genetik düzenleme çalışmak için güçlü bir tekniktir tabanlı. Drosophila embriyolar ifade GFP kolayca ya stereoskopik veya konfokal mikroskopi kullanılarak görüntülü. Herhangi bir canlı görüntüleme protokolü amacı, dehidratasyon ve hipoksi gibi zararlı etkileri en aza indirmek için. Drosophila embriyolar canlı görüntüleme analiz için hazırlanması için Önceki protokolleri Halokarbon yağ dechorionated embriyolar yerleştirme ve bir Halokarbon gaz geçirgen zar ve bir lamel arasında sandviç yer var^1-3. Bu şekilde montaj embriyolar ile sıkıştırma giriş morfolojilerinden herhangi bir biyomekanik tabanlı analiz için istenmeyen bir komplikasyondur temsil eder. Asılı damla protokol, canlı görüntüleme sırasında, embriyo mükemmel canlılığı sonuçları çağrı ve embriyolar sıkıştırılmış olmasını gerektirmez yöntemi. Kısaca, asılı damla protokol, nemli bir oda içinde pozisyonda sabit da, bir lamel, askıya Halokarbon petrol bir damla embriyo yerleştirme içerir. Gaz değişimi ve dehidrasyon önlenmesi için ek olarak, bu düzenlemenin timelapse satın alma sırasında pozisyon sürüklenen bunları önlemek için Halokarbon yağ embriyoların kaldırma kuvveti yararlanır. Bu video canlı görüntüleme için asılı damla protokolünü kullanarak Drosophila embriyolar toplamak ve hazırlamak için nasıl ayrıntılı olarak anlatılmaktadır. Bu protokol stereomicroscopy veya herhangi bir dik bileşik floresan mikroskop kullanarak görüntüleme dechorionated embriyolar için uygundur.

Protocol

Hazırlık Üzüm suyu standart agar plaklarına 4 embriyo toplayın. Bu otomatik bir Drosophila Yumurta Collector (flymax Bilimsel Cihazlar Ltd.) Kullanmak için uygundur. Senkron kullanarak embriyo koleksiyonları istenilen gelişimsel aşamada yeterli sayıda embriyo elde etmek için yapılmalıdır dechorionations sayısını azaltacaktır düzenledi. Çift taraflı bant, bir mikroskop lamı bir parça takarak dechorionation slayt hazırlayın; bant desteğini kaldırmak. Od…

Discussion

Biz asılı damla protokol dediğimiz canlı görüntüleme analizi, Drosophila embriyolar hazırlarken yeni bir yöntem açıklanmaktadır. Ne yazık ki, ters bir mikroskop ile çalışıyorsanız asılı damla protokolünü kullanmak mümkün değildir. Bu durumda sandviç tekniği (soyut yukarıda açıklandığı gibi) ve embriyoların sıkıştırma bir sorun olmaya devam ediyor olması gerekir.

Morfogenetik hareketi ile ilişkili güçleri hesaplamak için, hücre şekli ve büyüklü?…

Materials

Standard equipment and materials required to prepare embryos for live-imaging using the hanging drop protocol include the following items: microscope slides, coverslips (22 x 40 mm, No. 2), double-sided tape, jeweller’s forceps (Dumont style No. 5), halocarbon oil series 56 and series 700 (Halocarbon Products Corp.), a utility knife or single edge razor blade, tissue paper, scissors, distilled water, general purpose tape, and a pipet suitable for delivering 20-40 μl. The live imaging protocol also requires a custom-made live imaging chamber. This is prepared by cutting a 5 mm think polycarbonate plastic sheet to the dimensions of a standard microscope slide (75 X 25 mm) and using a rotor to create a 3mm deep depression in the slide (20 X 55 mm). Access to a stereomicroscope (dissecting microscope) and a fiber-optic illumination source is also required.