Elaboração de Drosophila Os embriões para Live-Imaging Usando o protocolo gota suspensa
Summary
Um método simples, barato e eficaz de preparação de embriões de Drosophila live-imaging análise é apresentada. Nosso protocolo fornece umidade e as trocas gasosas e não comprimir o embrião de Drosophila. Este método é adequado para GFP baseada em imagens ao vivo de embriões Drosophila usando um estereomicroscópio ou microscópio composto vertical.
Abstract
Proteína fluorescente verde (GFP) baseado em timelapse ao vivo de imagens é uma técnica poderosa para estudar a regulação genética de processos dinâmicos como a morfogênese do tecido, célula-adesão, ou morte celular. Embriões Drosophila expressando GFP são prontamente fotografada usando um microscópio estereoscópico ou confocal. A meta de qualquer protocolo de live-imaging é minimizar efeitos negativos como a desidratação e hipóxia. Protocolos anteriores para preparar os embriões de Drosophila live-imaging análise envolveram a colocação de embriões dechorionated em óleo halocarbonos e imprensando-los entre um halocarbono gás-permeáveis membrana e uma lamela<sup> 03/01</sup>. A introdução de compressão através de embriões de montagem desta forma representa uma complicação indesejável para qualquer análise biomecânica da morfogênese baseado. Nosso método, que chamamos de o protocolo gotas de suspensão, resulta em excelente viabilidade de embriões durante a imagens ao vivo e não exige que os embriões ser compactado. Resumidamente, o protocolo de gota em suspensão envolve a colocação de embriões em uma gota de óleo halocarbono que está suspensa a partir de uma lamela, que é, por sua vez, fixados em posição através de uma câmara úmida. Além de proporcionar a troca gasosa e impedindo a desidratação, esse arranjo aproveita o empuxo de embriões em óleo halocarbono para impedi-los de drifting fora de posição durante a aquisição timelapse. Este vídeo descreve em detalhes como coletar e preparar Drosophila embriões para geração de imagens ao vivo usando o protocolo de gota em suspensão. Este protocolo é adequado para embriões de imagem dechorionated usando estereomicroscopia ou qualquer microscópio de fluorescência vertical composto.
Protocol
Discussion
Descrevemos um novo método de preparação de embriões Drosophila para análise de imagens ao vivo, que chamamos de protocolo de gota em suspensão. Infelizmente, não é possível usar o protocolo de gota em suspensão se trabalhar com um microscópio invertido. Neste caso, a técnica de sanduíche (como descrito acima no abstract) deve ser utilizado e compressão dos embriões permanece uma preocupação.
Em experimentos onde a forma da célula e tamanho são medidos para calcular força…
Acknowledgements
Agradecemos o apoio de HB através de um Grant Descoberta, bem como um instrumentos de pesquisa e Grant Instrumento das Ciências Naturais e Engenharia pesquisas Council of Canada (NSERC). Reconhecemos também H. Oda eo Bloomington Drosophila ações Centro para a prestação de estoques genéticos que foram usadas no exemplo sequências de imagens ao vivo.
Materials
References
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