הכנת תסיסנית עוברים Live-הדמיה באמצעות פרוטוקול Drop Hanging
Summary
שיטה פשוטה, זולה, יעילה של הכנת עוברים תסיסנית לניתוח לחיות הדמיה מוצג. פרוטוקול שלנו מספק לחות חילוף הגזים ולא לדחוס את העובר תסיסנית. שיטה זו מתאימה עבור הדמיה GFP מבוססי לחיות עוברים תסיסנית באמצעות מיקרוסקופ stereomicroscope או תרכובת זקוף.
Abstract
חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) מבוססי timelapse לחיות הדמיה היא טכניקה רבת עוצמה ללימוד תקנה הגנטי של תהליכים דינמיים כגון המורפוגנזה רקמות, תאים תאים הידבקות, או מוות של תאים. עוברים תסיסנית להביע GFP הם צילמו בקלות או באמצעות מיקרוסקופ סטריאוסקופי או confocal. המטרה של כל פרוטוקול לחיות הדמיה היא למזער השפעות מזיקות כגון התייבשות היפוקסיה. פרוטוקולים קודמים להכנת עוברים תסיסנית לניתוח לחיות הדמיה יש מעורב הצבת עוברים dechorionated בשמן halocarbon ו הרבדה אותם בין halocarbon גז קרום חדיר ו coverslip<sup> 1-3</sup>. המבוא של דחיסה באמצעות עוברים גובר בצורה זו מהווה סיבוך בלתי רצויות לניתוח biomechanical מבוססי כל המורפוגנזה. השיטה שלנו, שאנו מכנים את פרוטוקול ירידה תלוי, תוצאות מצוינות הכדאיות של עוברים בזמן ההדמיה לחיות ואינו דורש כי עוברים להיות דחוס. בקצרה, את פרוטוקול ירידה תלוי מערבת את המיקום של עוברים בטיפת שמן halocarbon כי הוא הושעה coverslip, שהוא, בתורו, קבוע בעמדה מעל חדר לח. בנוסף לאספקת חילוף הגזים ומניעת התייבשות, הסדר זה מנצל את כושר הציפה של העוברים בשמן halocarbon כדי למנוע מהם נסחף מתוך עמדה במהלך הרכישה timelapse. וידאו זה מתאר בפירוט כיצד לאסוף ולהכין עוברים תסיסנית הדמיה לחיות באמצעות פרוטוקול ירידה תלוי. פרוטוקול זה מתאים עוברים הדמיה dechorionated באמצעות stereomicroscopy או מיקרוסקופ פלואורסצנטי זקוף המתחם.
Protocol
Discussion
אנו מתארים שיטה חדשה להכנת עוברים תסיסנית לניתוח הדמיה לחיות, שאנו מכנים את פרוטוקול ירידה תלוי. למרבה הצער, לא ניתן להשתמש בפרוטוקול ירידה תלוי אם עובדים עם מיקרוסקופ הפוכה. במקרה זה הטכניקה הרבדה (כפי שתואר לעיל מופשט) יש להשתמש דחיסה של עוברים שרידים דאגה.
<p class="jo…Acknowledgements
בהכרת תודה אנו מודים תמיכה BHR דרך גרנט דיסקברי וכן כלי מחקר גרנט כלי מן למדעי הטבע וההנדסה מועצת המחקר של קנדה (NSERC). אנחנו גם מכירים את ה אודה תסיסנית Bloomington המניות המרכז מתן מניות גנטי ששימשו את רצפי למשל לחיות הדמיה.
Materials
References
- Kiehart, D. P., Galbraith, C. G., Edwards, K. A., Rickoll, W. L., Montague, R. A. Multiple forces contribute to cell sheet morphogenesis for dorsal closure in Drosophila. J. Cell Biol. 149, 471-490 (2000).
- Schock, F., Perrimon, N. Cellular processes associated with germ band retraction in. , 248-2429 (2002).
- Reed, B. H., Wilk, R., Schock, F., Lipshitz, H. D. Integrin-dependent apposition of Drosophila extraembryonic membranes promotes morphogenesis and prevents anoikis. Curr. Biol. 14, 372-380 (2004).
- Wieschaus, E. p., Nusslein-Volhard, C., Roberts, D. B. . Drosophila: a practical approach. , 199-227 (1986).
