La préparation des Drosophile Les embryons destinés à Live-imagerie utilisant le protocole goutte suspendue
Summary
Une méthode simple, peu coûteux et efficace de préparer les embryons de drosophile pour live-imagerie analyse est présentée. Notre protocole prévoit l'échange d'humidité et de gaz et ne compresse pas l'embryon de drosophile. Cette méthode est adaptée pour la GFP imagerie basée sur des embryons de drosophile direct en utilisant un stéréomicroscope ou microscope composé debout.
Abstract
Protéine fluorescente verte (GFP) basé timelapse vivons-imagerie est une technique puissante pour étudier la régulation génétique de processus dynamiques tels que la morphogenèse des tissus, adhérence cellule-cellule, ou la mort cellulaire. Embryons de drosophile exprimant la GFP sont facilement imagée en utilisant la microscopie soit stéréoscopique ou confocale. Un but de tout protocole vivons-imagerie est de minimiser les effets néfastes tels que la déshydratation et l'hypoxie. Protocoles antérieurs pour préparer des embryons de drosophile pour live-analyse de l'imagerie ont impliqué plaçant embryons dechorionated dans l'huile d'halocarbures et de les intercaler entre un halocarbure perméables au gaz de membrane et une lamelle<sup> 1-3</sup>. L'introduction de la compression à travers embryons de montage de cette manière représente une complication indésirable pour toute analyse biomécanique basée sur la morphogenèse. Notre méthode, que nous appelons le protocole goutte suspendue, résultats dans une excellente viabilité des embryons lors de l'imagerie en direct et ne nécessite pas que les embryons soient compressées. Brièvement, le protocole goutte suspendue implique le placement d'embryons dans une goutte d'huile sur les halocarbures qui est suspendu à partir d'une lamelle, qui est, à son tour, en position fixe sur une chambre humide. En plus d'offrir l'échange de gaz et prévenir la déshydratation, cet arrangement profite de la flottabilité de l'embryon dans l'huile d'halocarbures pour les empêcher de dériver hors de position lors de l'acquisition timelapse. Cette vidéo décrit en détail la façon de recueillir et de préparer des embryons de drosophile pour l'imagerie en direct en utilisant le protocole goutte suspendue. Ce protocole est adapté pour les embryons d'imagerie utilisant dechorionated stéréomicroscopie ou microscope composé debout fluorescence.
Protocol
Discussion
Nous décrivons une nouvelle méthode de préparation des embryons de drosophile pour l'analyse de l'imagerie en direct, que nous appelons le protocole goutte suspendue. Malheureusement, il n'est pas possible d'utiliser le protocole goutte suspendue si l'on travaille avec un microscope inversé. Dans ce cas, la technique sandwich (comme décrit ci-dessus dans le résumé) doivent être utilisées et la compression des embryons reste un sujet de préoccupation.
Dans les ex…
Acknowledgements
Nous remercions le soutien à la BHR à travers une subvention à la découverte ainsi que d'un outils de recherche et Grant Instrument de recherches en sciences naturelles et en génie du Canada (CRSNG). Nous reconnaissons également H. Oda et le stock de Bloomington drosophile Centre de fournir des stocks génétiques qui ont été utilisés dans des séquences d'imagerie par exemple la vivre.
Materials
References
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