La preparazione di Drosophila Gli embrioni per Live-Imaging Utilizzando il protocollo goccia

Summary

Un metodo semplice, economico ed efficace per preparare gli embrioni di Drosophila per il live-imaging analisi è presentato. Il nostro protocollo prevede l'umidità e lo scambio di gas e non comprimere l'embrione di Drosophila. Questo metodo è adatto per GFP-based di immagini dal vivo di embrioni di Drosophila utilizzando uno stereomicroscopio o microscopio composto verticale.

Abstract

Proteina fluorescente verde (GFP)-base timelapse live-imaging è una tecnica potente per lo studio della regolazione genetica dei processi dinamici come la morfogenesi dei tessuti, l'adesione cellula-cellula, o morte cellulare. Embrioni di Drosophila che esprimono GFP sono prontamente ripreso utilizzando la microscopia confocale o stereoscopica. Un obiettivo di vivere-imaging protocollo è quello di minimizzare gli effetti dannosi, come la disidratazione e ipossia. Precedenti protocolli per la preparazione di embrioni di Drosophila per il live-imaging analisi hanno coinvolto messa embrioni dechorionated in olio alocarburi e sandwich di loro tra un alocarburi gas-permeabile membrana e un coprioggetto^1-3. L'introduzione di compressione attraverso embrioni di montaggio in questo modo rappresenta una complicazione indesiderabile per qualsiasi analisi basata biomeccanica della morfogenesi. Il nostro metodo, che noi chiamiamo il protocollo goccia, i risultati ottimi della redditività degli embrioni durante immagini dal vivo e non richiede che gli embrioni da comprimere. In breve, il protocollo goccia comporta il posizionamento di embrioni in una goccia di olio Halocarbon che è sospeso da un coprioggetti, che è, a sua volta, fissa all'altezza desiderata in una camera umida. Oltre a fornire lo scambio di gas e prevenire la disidratazione, tale sistema sfrutta la galleggiabilità di embrioni in olio Halocarbon per evitare che finiscano fuori posizione durante l'acquisizione Timelapse. Questo video descrive in dettaglio come raccogliere e preparare gli embrioni di Drosophila per l'imaging dal vivo utilizzando il protocollo goccia. Questo protocollo è adatto per gli embrioni di imaging dechorionated utilizzando stereomicroscopia o verticale microscopio a fluorescenza composto.

Protocol

Preparazione Raccogliere embrioni su standard di succo di uva piastre di agar 4. E 'conveniente usare un sistema automatizzato Drosophila Egg Collector (flymax scientifico apparecchiature Ltd.). Utilizzando sincrono messo in scena le collezioni embrione ridurrà il numero di dechorionations che devono essere eseguite in modo da ottenere un numero adeguato di embrioni allo stadio di sviluppo desiderato. Preparare una diapositiva dechorionation allegando un pezzo di nastro biadesivo ad …

Discussion

Descriviamo un nuovo metodo di preparazione di embrioni di Drosophila per l'analisi di immagini dal vivo, che noi chiamiamo il protocollo goccia. Purtroppo, non è possibile utilizzare il protocollo goccia se si lavora con un microscopio invertito. In questo caso la tecnica del sandwich (come descritto nel già astratto) deve essere utilizzato e la compressione degli embrioni rimane una preoccupazione.

Negli esperimenti in cui vengono misurate la forma delle cellule e dimensione al fine …

Materials

Standard equipment and materials required to prepare embryos for live-imaging using the hanging drop protocol include the following items: microscope slides, coverslips (22 x 40 mm, No. 2), double-sided tape, jeweller’s forceps (Dumont style No. 5), halocarbon oil series 56 and series 700 (Halocarbon Products Corp.), a utility knife or single edge razor blade, tissue paper, scissors, distilled water, general purpose tape, and a pipet suitable for delivering 20-40 μl. The live imaging protocol also requires a custom-made live imaging chamber. This is prepared by cutting a 5 mm think polycarbonate plastic sheet to the dimensions of a standard microscope slide (75 X 25 mm) and using a rotor to create a 3mm deep depression in the slide (20 X 55 mm). Access to a stereomicroscope (dissecting microscope) and a fiber-optic illumination source is also required.