Summary
Un metodo semplice, economico ed efficace per preparare gli embrioni di Drosophila per il live-imaging analisi è presentato. Il nostro protocollo prevede l'umidità e lo scambio di gas e non comprimere l'embrione di Drosophila. Questo metodo è adatto per GFP-based di immagini dal vivo di embrioni di Drosophila utilizzando uno stereomicroscopio o microscopio composto verticale.
Abstract
Proteina fluorescente verde (GFP)-base timelapse live-imaging è una tecnica potente per lo studio della regolazione genetica dei processi dinamici come la morfogenesi dei tessuti, l'adesione cellula-cellula, o morte cellulare. Embrioni di Drosophila che esprimono GFP sono prontamente ripreso utilizzando la microscopia confocale o stereoscopica. Un obiettivo di vivere-imaging protocollo è quello di minimizzare gli effetti dannosi, come la disidratazione e ipossia. Precedenti protocolli per la preparazione di embrioni di Drosophila per il live-imaging analisi hanno coinvolto messa embrioni dechorionated in olio alocarburi e sandwich di loro tra un alocarburi gas-permeabile membrana e un coprioggetto
Protocol
Preparazione
- Raccogliere embrioni su standard di succo di uva piastre di agar 4. E 'conveniente usare un sistema automatizzato Drosophila Egg Collector (flymax scientifico apparecchiature Ltd.). Utilizzando sincrono messo in scena le collezioni embrione ridurrà il numero di dechorionations che devono essere eseguite in modo da ottenere un numero adeguato di embrioni allo stadio di sviluppo desiderato.
- Preparare una diapositiva dechorionation allegando un pezzo di nastro biadesivo ad un vetrino da microscopio, rimuovere il supporto dal nastro.
- Preparare la camera di immagini dal vivo, tagliando un pezzo di tessuto per adattarsi nel pozzo della camera. Posizionare il tessuto nel bene e bagnato con acqua distillata.
- Mix alocarburi olio (Halocarbon Products Corp.) serie 700 viscosità e serie 56 con un rapporto di 1:1. La miscela possono essere memorizzati e utilizzati a tempo indeterminato.
- Luogo diverse piccole gocce di olio alocarburi sulla superficie di un coprioggetto (22 x 40 mm, n. 2). Il volume non è critica, ma dovrebbe essere nell'ordine dei microlitri 20-40.
Procedura
- Con l'aiuto di uno stereomicroscopio, raccogliere gli embrioni dal succo d'uva-agar piastre utilizzando una pinza da gioielliere (n. 5) o un pennello molto fine. Gli embrioni tendono ad attaccarsi l'un l'altro e per le pinze punte ', sono facilmente riuniti in gruppi.
- Con l'aiuto di uno stereomicroscopio, abbassare delicatamente le macchie di embrioni che hanno aderito alle punte della pinza sulla superficie del nastro sul vetrino dechorionation.
- Anche in questo caso con lo stereomicroscopio, delicatamente spingere o ictus gli embrioni con il lato della pinza in modo da rompere il corion esterno ceroso senza rottura della membrana interna vitellina (l'embrione esploderà se la membrana vitellina è rotto).
- Una volta che il corion esterno è stato rotto, stuzzicare l'embrione dal corion, l'embrione dechorionated tende ad aderire alla superficie della pinza. Fare attenzione a non toccare l'embrione dechorionated alla superficie del nastro.
- Non appena un embrione è dechorionated, rapidamente trasferimento alla goccia di olio precedentemente preparato alocarburi sul vetrino. Toccare la punta della pinza portando l'embrione dechorionated alla superficie della goccia di olio alocarburi - questo sloggia l'embrione dal forcipe nell'olio.
- Confermare il trasferimento di un embrione alla goccia di petrolio. Questo può essere fatto a occhio nudo, a condizione che si lavora su uno sfondo nero e utilizzare una fibra ottica fonte di illuminazione fissata a un angolo obliquo.
- Prima di tentare di dechorionate un altro embrione, pulire qualsiasi tipo di olio dalla pinza. Pinza rivestiti in olio hanno meno di acquisto sulla superficie corion, dechorionation rendendo più difficile.
- Dechorionated embrioni sono vivace nell'olio alocarburi. Uso di pinze o un pennello e durante la visualizzazione attraverso uno stereomicroscopio, spingere l'embrione alla parte inferiore della goccia di olio e sistemare nella posizione desiderata.
- Rapidamente invertire il coprioggetto sopra il pozzo della camera di immagini dal vivo. Confermano che gli embrioni sono a riposo contro il vetrino con l'orientamento desiderato. Grazie alla loro galleggiabilità in olio, gli embrioni ora galleggiano sulla superficie inferiore del coprioggetto. Fissare il coprioggetto alla camera di imaging dal vivo con del nastro adesivo. Ventilare la camera da taglio buchi nel nastro nella zona in cui il nastro si estende il divario tra la fine del vetrino e la fine del pozzo della camera di immagini dal vivo.
- Un microscopio a fluorescenza in posizione verticale o uno stereomicroscopio a fluorescenza possono ora essere utilizzati per l'immagine degli embrioni.
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Discussion
Descriviamo un nuovo metodo di preparazione di embrioni di Drosophila per l'analisi di immagini dal vivo, che noi chiamiamo il protocollo goccia. Purtroppo, non è possibile utilizzare il protocollo goccia se si lavora con un microscopio invertito. In questo caso la tecnica del sandwich (come descritto nel già astratto) deve essere utilizzato e la compressione degli embrioni rimane una preoccupazione.
Negli esperimenti in cui vengono misurate la forma delle cellule e dimensione al fine di calcolare le forze associate a movimenti morfogenetici, l'uso di un microscopio in posizione verticale e il protocollo goccia è preferibile a causa della compressione embrione ridotto. Inoltre, la compressione embrione ridotto utilizzando il protocollo goccia ha la conseguenza di presentare la superficie sferica senza distorsioni dell'embrione, mentre la tecnica del sandwich presenta una superficie piatta. Quando si utilizza la microscopia confocale è quindi necessario per raccogliere un ampio Z-stack (più fette per stack) quando si utilizza il protocollo goccia rispetto al metodo sandwich. Il maggior numero di fette per Z-stack, tuttavia, aumenta il tempo di acquisizione nonché le eventuali foto-tossicità o fotometabolismo associati con eccitazione laser. Chiaramente, il vantaggio sperimentale associato alla compressione ridotto è in qualche modo compensata da un aumento di Z-stack tempi di acquisizione. Nonostante l'incremento di Z-stack tempo di acquisizione, tuttavia, abbiamo osservato eccellente vitalità degli embrioni utilizzando il protocollo goccia.
Il protocollo goccia è limitato all'osservazione di embrioni al microscopio a fluorescenza, in cui il percorso di luce incidente e luce emessa non passano attraverso il live-immagini da camera. Live-immagini embrioni usando la microscopia DIC o altri non-fluorescenza ottica potrebbe essere realizzato modificando il live-camera di imaging per consentire un percorso di luce dal condensatore attraverso l'embrione sospeso.
Una preoccupazione quando si utilizza la tecnica di goccia possono essere movimenti indesiderati o "deriva" degli embrioni nel campo visivo durante l'acquisizione Timelapse. Quando galleggiante contro la parte inferiore del coprioggetto invertita, troviamo che gli embrioni sono molto stabili e non cambiamento di posizione quando si utilizza a secco o obiettivi immersione in olio. Multipunto acquisizione timelapse usando un microscopio motorizzato fase, inoltre, non disturbare le posizioni di embrioni che vengono preparati utilizzando il protocollo goccia. Qualsiasi movimento di embrioni preparata con la tecnica della goccia può essere eliminata riducendo la dimensione della goccia di olio alocarburi e garantire che gocce di olio separati non sono fusione o wicking lungo il bordo del live-imaging camera di bene.
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Acknowledgments
Siamo grati per il sostegno al BHR tramite una sovvenzione Discovery e Strumenti di ricerca e Grant strumento dalle scienze naturali e ingegneria Research Council del Canada (NSERC). Riconosciamo inoltre H. Oda e il Centro di Bloomington Drosophila magazzino per la fornitura di scorte genetiche che sono state usate nelle sequenze di immagini dal vivo esempio.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Standard equipment and materials required to prepare embryos for live-imaging using the hanging drop protocol include the following items: microscope slides | |||
| coverslips (22 x 40 mm, No. 2) | |||
| double-sided tape | |||
| jeweller’s forceps (Dumont style No. 5) | |||
| halocarbon oil series 56 and series 700 (Halocarbon Products Corp.) | |||
| a utility knife or single edge razor blade | |||
| tissue paper | |||
| scissors | |||
| distilled water | |||
| general purpose tape | |||
| a pipet suitable for delivering 20-40 μl. | |||
| The live imaging protocol also requires a custom-made live imaging chamber. This is prepared by cutting a 5 mm think polycarbonate plastic sheet to the dimensions of a standard microscope slide (75 X 25 mm) and using a rotor to create a 3mm deep depression in the slide (20 X 55 mm). Access to a stereomicroscope (dissecting microscope) and a fiber-optic illumination source is also required. | |||
References
- Kiehart, D. P., Galbraith, C. G., Edwards, K. A., Rickoll, W. L., Montague, R. A. Multiple forces contribute to cell sheet morphogenesis for dorsal closure in Drosophila. J. Cell Biol. 149, 471-490 (2000).
- Schock, F., Perrimon, N. Cellular processes associated with germ band retraction in. , 248-2429 (2002).
- Reed, B. H., Wilk, R., Schock, F., Lipshitz, H. D. Integrin-dependent apposition of Drosophila extraembryonic membranes promotes morphogenesis and prevents anoikis. Curr. Biol. 14, 372-380 (2004).
- Wieschaus, E. p, Nusslein-Volhard, C. Drosophila: a practical approach. Roberts, D. B. , IRL Press Limited. Oxford, England. 199-227 (1986).
