Summary
Простой, недорогой и эффективный способ получения эмбрионов дрозофилы для живого изображения анализ. Наш протокол обеспечивает влажность и газовый обмен и не сжимает эмбриона дрозофилы. Этот метод подходит для GFP основе живого изображения эмбрионов дрозофилы использованием стереомикроскопа или прямого микроскопа соединения.
Abstract
Зеленый флуоресцентный белок (GFP)-основанной timelapse жить-визуализации является мощным средством для изучения генетической регуляции динамических процессов, таких как ткани морфогенеза, межклеточной адгезии, или гибель клеток. Дрозофилы эмбрионов выражения GFP легко отображаемого использованием либо стереоскопических или конфокальной микроскопии. Цель любого живого изображения протокол является сведение к минимуму негативных последствий, таких как обезвоживание и гипоксии. Предыдущие протоколы для подготовки дрозофилы эмбрионов для живого изображения анализа привлекли размещения dechorionated эмбрионов в галоидоуглеводородов нефти и сэндвич их между галоидоуглеводородов газа мембраны и покровное
Protocol
Подготовка
- Сбор эмбрионов на стандартных виноградного сока агаром 4. Это удобно использовать автоматизированные дрозофилы Яйцо Collector (Flymax Научное оборудование Ltd.) Использование синхронных поставил эмбриона коллекции позволит сократить число dechorionations которые должны быть выполнены для получения достаточного количества зародышей на желаемый стадии развития.
- Подготовка dechorionation слайд путем присоединения кусок двухсторонней ленты на предметное стекло микроскопа; удалить защитную пленку с ленты.
- Подготовка жить камеры изображений за счет сокращения кусок ткани, чтобы вписаться в хорошо палаты. Место ткани хорошо и мокрый его с дистиллированной водой.
- Смешайте галоидоуглеводородов нефти (хладон Продукты корпорации) вязкость серии 700 и серии 56 в соотношении 1:1. Смесь может храниться и использоваться на неопределенный срок.
- Место несколько маленьких капель галоидоуглеводородов нефти на поверхности покровного (22 X 40 мм, № 2). Объем не является критической, но должно быть в порядке 20-40 мкл.
Процедура
- С помощью стереомикроскопа, собирать эмбрионы из виноградного сока-агар пластин с использованием либо пару щипцов ювелирного (№ 5) или очень тонкой кистью. Эмбрионы, как правило, слипаются друг с другом и советы щипцов; они легко собраны в скопления.
- С помощью стереомикроскопа, аккуратно опустите скопления эмбрионов, которые присоединились к кончикам щипцов на поверхность ленты на dechorionation слайда.
- Снова используя стереомикроскопа, мягко подтолкнуть или инсульт эмбрионов с сторону щипцы для того, чтобы вскрыть внешнюю восковой хориона без разрушения внутренней мембране желточной (эмбрион лопнет, если желточной оболочки разрывается).
- Как только внешний хориона был разорван, дразнить эмбриона от хориона; dechorionated эмбрион имеет тенденцию придерживаться поверхность щипцов. Заботьтесь, чтобы не прикасаться dechorionated эмбриона к поверхности ленты.
- Как только эмбрион dechorionated, быстро перевести его на заранее подготовленные капли галоидоуглеводородов нефти на покровное. Сенсорный кончике пинцета проведения dechorionated эмбриона поверхность капли масла галоидоуглеводородов - это выбивает эмбриона от щипцов на нефть.
- Подтверждение передачи эмбриона жировой капли. Это можно сделать невооруженным глазом, при условии, что вы работаете над черным фоном и использовать волоконно-оптический источник освещения набор под косым углом.
- Перед тем, как dechorionate другого эмбриона, чистки нефти из щипцов. Пинцет покрытием на нефть имеют меньше покупки на хориона поверхности, что делает dechorionation сложнее.
- Dechorionated эмбрионы плавучей в галоидоуглеводородов нефти. Использование щипцов или кисть и при просмотре через стереомикроскопа, нажмите эмбриона на дно падения нефти и расположить его в нужном положении.
- Быстро инвертировать покровное над колодцем живой камеры изображений. Убедитесь, что эмбрионы упираясь покровное в требуемом направлении. Из-за их плавучесть в масле, эмбрионов теперь будет плавать на нижнюю поверхность покровного стекла. Fix покровное к камере жить изображений с ленты. Вентиляция камеры вырезка отверстий в ленте в районе, где лента охватывает промежуток между окончанием покровного и конца и живой камеры изображений.
- Вертикальном флуоресцентного микроскопа или флуоресценции стереомикроскопа теперь может быть использована для изображения эмбрионов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Мы описываем новый метод подготовки дрозофилы эмбрионов для живого анализа изображений, которые мы называем висячей капли протокола. К сожалению, это не представляется возможным использовать висячей капли протокол, если работать с инвертированным микроскопом. В этом случае сэндвич технику (как описано в абстрактных выше) должны быть использованы и сжатия эмбрионов прежнему вызывает обеспокоенность.
В опытах, где форма и размеры ячейки измеряются для расчета сил, связанных с движением морфогенетических, использование прямой микроскоп и висячей капли протокол является предпочтительным из-за снижения эмбриона сжатия. Кроме того, снижение сжатия эмбриона использовании висячей капли протокол следствием представления круглые, неискаженной поверхности зародыша в то время как сэндвич техники представляет плоские поверхности. При использовании конфокальной микроскопии она есть, следовательно, необходимо собрать более широкий Z-стека (более ломтики в стеке) при использовании висячей капли протокола по сравнению с сэндвич методом. Увеличение числа срезов за один Z-стек, однако, увеличивает время приобретения, а также любые фото-токсичность или фото-отбеливание связано с лазерного возбуждения. Очевидно, что экспериментальные выгоды, связанные со снижением сжатия частично компенсируется увеличением Z-Stack раза приобретения. Несмотря на это увеличение Z-Stack приобретения время, однако, мы наблюдаем отличную жизнеспособность эмбрионов использовании висячей капли протокола.
Висячей капли протокол также ограничивается наблюдением эмбрионов путем флуоресцентной микроскопии, в которых световой поток падающих и излучаемый свет не проходит через живого изображения камеры. Live-изображения эмбрионов использованием DIC микроскопии или других не-флуоресценции оптики может быть достигнуто путем изменения живого изображения камеры, чтобы световой поток от конденсатора через приостановлено эмбриона.
Беспокойство при использовании висячей капли техника может быть нежелательным движения или "дрейфующие" эмбрионов в поле зрения во время timelapse приобретения. При плавающей против нижней перевернутой покровное, получаем, что эмбрионы удивительно стабильны и не сдвиг в положении, когда, используя либо сухой или целей нефти погружения. Многоточечные timelapse приобретение использованием моторизованных столик микроскопа также не нарушает позиции эмбрионов, которые готовятся с использованием висячей капли протокола. Любое движение эмбрионов подготовлен с использованием висячей капли техника может быть устранено за счет уменьшения размера капли масла галоидоуглеводородов и обеспечение того, чтобы отдельные капли нефти не слияния или влагу по краю живого изображения камеры хорошо.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Мы выражаем глубокую признательность поддержку BHR через Discovery Грант, а также исследовательских инструментов и инструментов Грант естественным наукам и инженерным исследованиям Совета Канады (NSERC). Мы также признаем, Х. Ода и Блумингтон дрозофилы фондового центра, предоставляющая генетические запасы, которые были использованы в пример живой последовательности изображений.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Standard equipment and materials required to prepare embryos for live-imaging using the hanging drop protocol include the following items: microscope slides | |||
| coverslips (22 x 40 mm, No. 2) | |||
| double-sided tape | |||
| jeweller’s forceps (Dumont style No. 5) | |||
| halocarbon oil series 56 and series 700 (Halocarbon Products Corp.) | |||
| a utility knife or single edge razor blade | |||
| tissue paper | |||
| scissors | |||
| distilled water | |||
| general purpose tape | |||
| a pipet suitable for delivering 20-40 μl. | |||
| The live imaging protocol also requires a custom-made live imaging chamber. This is prepared by cutting a 5 mm think polycarbonate plastic sheet to the dimensions of a standard microscope slide (75 X 25 mm) and using a rotor to create a 3mm deep depression in the slide (20 X 55 mm). Access to a stereomicroscope (dissecting microscope) and a fiber-optic illumination source is also required. | |||
References
- Kiehart, D. P., Galbraith, C. G., Edwards, K. A., Rickoll, W. L., Montague, R. A. Multiple forces contribute to cell sheet morphogenesis for dorsal closure in Drosophila. J. Cell Biol. 149, 471-490 (2000).
- Schock, F., Perrimon, N. Cellular processes associated with germ band retraction in. , 248-2429 (2002).
- Reed, B. H., Wilk, R., Schock, F., Lipshitz, H. D. Integrin-dependent apposition of Drosophila extraembryonic membranes promotes morphogenesis and prevents anoikis. Curr. Biol. 14, 372-380 (2004).
- Wieschaus, E. p, Nusslein-Volhard, C. Drosophila: a practical approach. Roberts, D. B. , IRL Press Limited. Oxford, England. 199-227 (1986).
