Подготовка Drosophila Эмбрионы для Live-визуализации с использованием висячей капли протокола
Summary
Простой, недорогой и эффективный способ получения эмбрионов дрозофилы для живого изображения анализ. Наш протокол обеспечивает влажность и газовый обмен и не сжимает эмбриона дрозофилы. Этот метод подходит для GFP основе живого изображения эмбрионов дрозофилы использованием стереомикроскопа или прямого микроскопа соединения.
Abstract
Зеленый флуоресцентный белок (GFP)-основанной timelapse жить-визуализации является мощным средством для изучения генетической регуляции динамических процессов, таких как ткани морфогенеза, межклеточной адгезии, или гибель клеток. Дрозофилы эмбрионов выражения GFP легко отображаемого использованием либо стереоскопических или конфокальной микроскопии. Цель любого живого изображения протокол является сведение к минимуму негативных последствий, таких как обезвоживание и гипоксии. Предыдущие протоколы для подготовки дрозофилы эмбрионов для живого изображения анализа привлекли размещения dechorionated эмбрионов в галоидоуглеводородов нефти и сэндвич их между галоидоуглеводородов газа мембраны и покровное<sup> 1-3</sup>. Введение сжатие через монтажные эмбрионы таким образом представляет нежелательные осложнения для любой биомеханического анализа на основе морфогенеза. Наш метод, который мы называем висячей капли протокол, результаты в отличном жизнеспособность эмбрионов во время живого изображения и не требует, чтобы эмбрионы быть сжаты. Короче говоря, висячей капли протокол включает в себя размещение эмбрионов в каплю галоидоуглеводородов нефть, которая подвешивается на покровное, которая, в свою очередь, фиксируется в положении над влажной камере. В дополнение к обеспечению газообмена, предотвращает обезвоживание, этот механизм использует плавучести эмбрионов в галоидоуглеводородов масла, чтобы предотвратить их уходить из положения во время timelapse приобретения. Это видео подробно описывает, как собрать и подготовить дрозофилы эмбрионов для живых визуализации с использованием висячей капли протокола. Этот протокол подходит для работы с изображениями dechorionated эмбрионов использованием stereomicroscopy или любой прямой микроскоп флуоресценции соединения.
Protocol
Discussion
Мы описываем новый метод подготовки дрозофилы эмбрионов для живого анализа изображений, которые мы называем висячей капли протокола. К сожалению, это не представляется возможным использовать висячей капли протокол, если работать с инвертированным микроскопом. В этом случае сэндвич т…
Acknowledgements
Мы выражаем глубокую признательность поддержку BHR через Discovery Грант, а также исследовательских инструментов и инструментов Грант естественным наукам и инженерным исследованиям Совета Канады (NSERC). Мы также признаем, Х. Ода и Блумингтон дрозофилы фондового центра, предоставляющая генетические запасы, которые были использованы в пример живой последовательности изображений.
Materials
References
- Kiehart, D. P., Galbraith, C. G., Edwards, K. A., Rickoll, W. L., Montague, R. A. Multiple forces contribute to cell sheet morphogenesis for dorsal closure in Drosophila. J. Cell Biol. 149, 471-490 (2000).
- Schock, F., Perrimon, N. Cellular processes associated with germ band retraction in. , 248-2429 (2002).
- Reed, B. H., Wilk, R., Schock, F., Lipshitz, H. D. Integrin-dependent apposition of Drosophila extraembryonic membranes promotes morphogenesis and prevents anoikis. Curr. Biol. 14, 372-380 (2004).
- Wieschaus, E. p., Nusslein-Volhard, C., Roberts, D. B. . Drosophila: a practical approach. , 199-227 (1986).
