Beredningen av Drosophila Embryon för Live-Imaging Använda droppe protokollet

Summary

En enkel, billig och effektiv metod för att förbereda Drosophila embryon för live-bildanalys presenteras. Vår protokollet ger fukt och gas utbyte och inte komprimera Drosophila embryot. Denna metod är lämplig för GFP-baserade Live avbildning av Drosophila embryon med hjälp av ett stereomikroskop eller upprätt sammansatt mikroskop.

Abstract

Grönt fluorescerande protein (GFP)-baserade timelapse live-avbildning är en kraftfull teknik för att studera den genetiska regleringen av dynamiska processer såsom vävnad morfogenes, cell-cell adhesion, eller celldöd. Drosophila embryon uttrycka GFP är lätt avbildas med antingen stereoskopiska eller konfokalmikroskopi. Ett mål för varje levande-imaging-protokollet är att minimera negativa effekter som uttorkning och hypoxi. Föregående protokollen för att förbereda Drosophila embryon för live-bildanalys har inneburit att placera dechorionated embryon i Halocarbon olja och sandwiching dem mellan ett Halocarbon gas-membran och ett täckglas^1-3. Införandet av kompression genom montering embryon på detta sätt innebär en oönskad komplikation för alla biomekanisk analys av morfogenes. Vår metod, som vi kallar droppe protokollet, resulterar i mycket bra lönsamhet för embryon under live-avbildning och kräver inte att embryon komprimeras. I korthet innebär droppe protokollet placeringen av embryon i en droppe Halocarbon olja som är upphängd på ett täckglas, som i sin tur fast i position över en fuktig kammare. Förutom att ge gasutbyte och förhindrar uttorkning, tar detta arrangemang fördel av bärighet för embryon i Halocarbon olja för att hindra dem från att driva ut från position under Timelapse förvärvet. Denna video beskriver i detalj hur man samlar in och förbereda Drosophila embryon för lever avbildning med droppe protokollet. Detta protokoll är lämplig för avbildning dechorionated embryon med stereomikroskopi eller upprätt förening fluorescensmikroskop.

Protocol

Förberedelser Samla embryon på vanliga druvsaft agarplattor 4. Det är bekvämt att använda ett automatiserat Drosophila Egg Collector (Flymax Scientific Equipment Ltd). Använda synkrona iscensatt embryo samlingar kommer att minska antalet dechorionations som måste utföras för att få tillräckligt många embryon på önskad utvecklingsstadiet. Förbered en dechorionation bild genom att fästa en bit dubbelhäftande tejp på ett objektglas, ta bort skyddspapperet från tejpen. </li…

Discussion

Vi beskriver en ny metod för att förbereda Drosophila embryon för live bildanalys, som vi kallar droppe protokollet. Tyvärr är det inte möjligt att använda den hängande droppe-protokollet om att arbeta med ett inverterat mikroskop. I detta fall sandwiching teknik (som beskrivs i abstrakta ovan) måste användas och komprimering av embryona fortfarande ett problem.

I försök där cell form och storlek mäts för att beräkna krafter som är förknippade med morfogenetiska rörelse, ?…

Materials

Standard equipment and materials required to prepare embryos for live-imaging using the hanging drop protocol include the following items: microscope slides, coverslips (22 x 40 mm, No. 2), double-sided tape, jeweller’s forceps (Dumont style No. 5), halocarbon oil series 56 and series 700 (Halocarbon Products Corp.), a utility knife or single edge razor blade, tissue paper, scissors, distilled water, general purpose tape, and a pipet suitable for delivering 20-40 μl. The live imaging protocol also requires a custom-made live imaging chamber. This is prepared by cutting a 5 mm think polycarbonate plastic sheet to the dimensions of a standard microscope slide (75 X 25 mm) and using a rotor to create a 3mm deep depression in the slide (20 X 55 mm). Access to a stereomicroscope (dissecting microscope) and a fiber-optic illumination source is also required.