La preparación de los Drosophila Los embriones para Live-Imaging utilizando el protocolo de gota
Summary
Un método simple, barato y eficaz de la preparación de los embriones de Drosophila para vivir de imágenes de análisis se presenta. El protocolo proporciona la humedad y el intercambio de gases y no comprime el embrión de Drosophila. Este método es adecuado para las buenas prácticas agrarias basadas en imágenes en vivo de embriones de Drosophila utilizando un microscopio estereoscópico o el microscopio compuesto en posición vertical.
Abstract
La proteína verde fluorescente (GFP) basado en timelapse en vivo de imágenes es una técnica poderosa para el estudio de la regulación genética de procesos dinámicos, como la morfogénesis de tejidos, la adhesión célula-célula, o muerte celular. Embriones de Drosophila que expresan GFP son fácilmente imágenes utilizando microscopía estereoscópica o confocal. Uno de los objetivos del protocolo en vivo de imágenes es reducir al mínimo los efectos perjudiciales tales como la deshidratación y la hipoxia. Protocolos anteriores para la preparación de los embriones de Drosophila para vivir de imágenes de análisis que consistía en colocar los embriones dechorionated en el aceite de halocarbonos y intercalando entre ellos una halocarbonos permeables al gas de membrana y un cubreobjetos<sup> 3.1</sup>. La introducción de compresión a través de embriones de montaje de esta manera representa una complicación indeseable para cualquier análisis biomecánico basado en la morfogénesis. Nuestro método, que llamamos el protocolo de gota, los resultados de la viabilidad de los embriones durante excelentes imágenes en vivo y no requiere que los embriones se comprime. En pocas palabras, el protocolo de gota consiste en la colocación de los embriones en una gota de aceite de halocarbonos que se suspende de un cubreobjetos, que es, a su vez, en una posición fija en una cámara húmeda. Además de proporcionar el intercambio gaseoso y prevención de la deshidratación, este sistema se aprovecha de la flotabilidad de los embriones en el aceite de halocarbonos para evitar que se deriva de su posición durante la adquisición de timelapse. Este vídeo describe en detalle cómo recoger y preparar los embriones de Drosophila para imágenes en vivo a través del protocolo de gota. Este protocolo es adecuado para los embriones de imágenes dechorionated utilizando microscopía estereoscópica o cualquier microscopio de fluorescencia compuesto en posición vertical.
Protocol
Discussion
Se describe un nuevo método de preparación de los embriones de Drosophila para el análisis de imágenes en vivo, lo que llamamos el protocolo de gota. Por desgracia, no es posible utilizar el protocolo de gota si se trabaja con un microscopio invertido. En este caso la técnica de sándwich (como se describe en el resumen anterior) debe ser utilizado y la compresión de los embriones sigue siendo una preocupación.
En experimentos donde se mide la forma y el tamaño de la celda con el fin…
Acknowledgements
Agradecemos el apoyo de la HRB a través de una beca de descubrimiento, así como herramientas de investigación y subvención de instrumentos de las Ciencias Naturales e Ingeniería de Investigación de Canadá (NSERC). También reconocemos H. Oda y el Bloomington Drosophila Stock Center para proporcionar materiales genéticos que se utilizaron en las secuencias de imágenes en vivo ejemplo.
Materials
References
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