의 준비 Drosophila 태아

Summary

라이브 영상 분석을위한 Drosophila의 배아를 준비, 간단한 저렴하고 효과적인 방법이 제공됩니다. 우리 프로토콜은 습도와 가스 교환을 제공하고 Drosophila의 배아를 압축하지 않습니다. 이 방법은 stereomicroscope 또는 수직 복합 현미경을 사용하여 Drosophila의 배아의 GFP 기반의 라이브 영상에 적합합니다.

Abstract

그린 형광 단백질 (GFP) timelapse 라이브 영상 그러한 조직 morphogenesis, 세포 – 세포 부착, 또는 세포 사망과 같은 동적 프로세스의 유전자 조절을 연구위한 강력한 기법입니다 기반. GFP를 표현 Drosophila의 배아는 즉시 중 입체 또는 공촛점 현미경을 사용하여 몇 군데 있습니다. 살아있는 영상 프로토콜의 목표는 탈수와 hypoxia로 해로운 영향을 최소화하는 것입니다. 라이브 영상 분석을위한 Drosophila의 배아를 준비 이전 프로토콜 할로 카본의 기름에 dechorionated 배아를 삽입하고 할로 카본 가스 투과 막과 coverslip 사이에 그들을 sandwiching 참여했습니다^1-3. 이러한 방식으로 장착 배아를 통해 압축의 도입은 morphogenesis의 biomechanical 기반의 분석을위한 바람직하지 않은 복잡을 나타냅니다. 우리가 매달려 드롭 프로토콜, 라이브 영상 중에 태아의 생존에 좋은 결과를 전화 배아를 압축하는 것이 필요하지 않습니다 우리의 방법. 간단히, 매​​달려 드롭 프로토콜은 습기 챔버를 통해 위치에 고정 차례입니다 coverslip,에서 일시 중지되었습니다 할로 카본 오일 드롭 태아의 위치를​​ 포함합니다. 가스 교환을 제공하고 탈수를 방지하는 것 외에도,이 협정 timelapse 취득하는 동안 위치에서 벗어나 표류에서 그들을 방지하기 위해 할로 카본 오일에서 태아의 부력을 활용합니다. 이 동영상은 매달려 드롭 프로토콜을 사용하여 라이브 영상에 대한 Drosophila의 배아를 수집하고 준비하는 방법을 자세히 설명합니다. 이 프로토콜은 stereomicroscopy 또는 수직 복합 형광 현미경을 사용하여 영상 dechorionated 배아에 적합합니다.

Protocol

준비 표준 포도 – 쥬스 한천 플레이트 4 배아를 수집합니다. 그것은 자동 Drosophila 에그 콜렉터 (Flymax 첨단 장비 회사)를 이용하시면 편리합니다. 동기를 사용하면 배아 컬렉션 원하는 발달 단계에서 배아의 충분한 숫자를 얻기 위해 수행되어야합니다 dechorionations의 수를 줄일 수 있습니다 개최. 현미경 슬라이드에 양면 테이프의 조각을 부착하여 dechorionation 슬라이드를 준비…

Discussion

우리는 우리가 매달려 드롭 프로토콜을 호출 라이브 영상 분석에 대한 Drosophila의 배아를 준비하는 새로운 방법을 설명합니다. 불행히도, 거꾸로 현미경으로 작업하는 경우 매달려 놓기 프로토콜을 사용하는 것은 불가능합니다. 이 경우에는 sandwiching 기술은 (같은 추상적 위에서 설명한) 사용하고 배아의 압축 우려 남아 있어야합니다.

세포 모양과 크기가 morphogenetic 운동과 ?…

Materials

Standard equipment and materials required to prepare embryos for live-imaging using the hanging drop protocol include the following items: microscope slides, coverslips (22 x 40 mm, No. 2), double-sided tape, jeweller’s forceps (Dumont style No. 5), halocarbon oil series 56 and series 700 (Halocarbon Products Corp.), a utility knife or single edge razor blade, tissue paper, scissors, distilled water, general purpose tape, and a pipet suitable for delivering 20-40 μl. The live imaging protocol also requires a custom-made live imaging chamber. This is prepared by cutting a 5 mm think polycarbonate plastic sheet to the dimensions of a standard microscope slide (75 X 25 mm) and using a rotor to create a 3mm deep depression in the slide (20 X 55 mm). Access to a stereomicroscope (dissecting microscope) and a fiber-optic illumination source is also required.