Summary
ड्रोसोफिला भ्रूण रहते इमेजिंग विश्लेषण के लिए तैयारी की एक सरल, सस्ता और कारगर तरीका प्रस्तुत किया है. हमारी नमी और गैस विनिमय प्रोटोकॉल प्रदान करता है और ड्रोसोफिला भ्रूण सेक नहीं है. इस विधि GFP-आधारित ड्रोसोफिला एक stereomicroscope या ईमानदार यौगिक सूक्ष्मदर्शी का उपयोग भ्रूण के रहते इमेजिंग के लिए उपयुक्त है.
Abstract
ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP) आधारित रहते हैं - इमेजिंग timelapse ऊतक morphogenesis, सेल कोशिका आसंजन, या कोशिका मृत्यु जैसे गतिशील प्रक्रियाओं की आनुवंशिक विनियमन के अध्ययन के लिए एक शक्तिशाली तकनीक है. भ्रूण ड्रोसोफिला GFP व्यक्त आसानी से या तो त्रिविम या confocal माइक्रोस्कोपी का उपयोग imaged हैं. किसी भी रहते इमेजिंग प्रोटोकॉल का एक लक्ष्य के लिए निर्जलीकरण और hypoxia जैसे हानिकारक प्रभाव को कम है. ड्रोसोफिला भ्रूण रहते इमेजिंग विश्लेषण के लिए तैयार करने के लिए पिछला प्रोटोकॉल हेलोकार्बन तेल में dechorionated भ्रूण रखने और उन्हें एक हेलोकार्बन गैस पारगम्य झिल्ली और एक coverslip के बीच sandwiching शामिल है
Protocol
तैयार
- मानक अंगूर का रस अगर 4 प्लेटों पर भ्रूण ले लीजिए . यह एक स्वचालित ड्रोसोफिला अंडा कलेक्टर (Flymax वैज्ञानिक उपकरण, लिमिटेड) का उपयोग करने के लिए सुविधाजनक है. तुल्यकालिक का उपयोग मंचन भ्रूण संग्रह dechorionations है कि आदेश में प्रदर्शन किया जाना चाहिए वांछित विकास के चरण में भ्रूण की पर्याप्त संख्या में प्राप्त की संख्या कम हो जाएगा.
- एक खुर्दबीन स्लाइड के लिए डबल पक्षीय टेप का एक टुकड़ा संलग्न द्वारा एक dechorionation स्लाइड तैयार, टेप से समर्थन निकालने.
- ऊतक का एक टुकड़ा काट करने के लिए चैम्बर की अच्छी तरह से में फिट रहते इमेजिंग कक्ष तैयार है. अच्छी तरह से में ऊतक प्लेस और यह आसुत जल के साथ गीला है.
- मिक्स हेलोकार्बन तेल दलदलापन (हेलोकार्बन उत्पाद कार्पोरेशन) श्रृंखला और 1:1 के अनुपात में 56 श्रृंखला 700. मिश्रण और भंडारित किया जा सकता है अनिश्चित काल इस्तेमाल किया.
- हेलोकार्बन तेल के कई छोटे बूँदें एक coverslip (22 एक्स 40 मिमी, नंबर 2) की सतह पर रखें. मात्रा महत्वपूर्ण नहीं है, लेकिन 20-40 μl के क्रम में किया जाना चाहिए.
प्रक्रिया
- Stereomicroscope की सहायता के साथ, अंगूर का रस अगर या तो जौहरी संदंश की एक जोड़ी (5 सं) या एक बहुत ठीक पेंट ब्रश का उपयोग कर प्लेटों से भ्रूण इकट्ठा. भ्रूण को एक दूसरे से और संदंश सुझावों के लिए छड़ी करते हैं, वे आसानी से clumps में इकट्ठा कर रहे हैं.
- Stereomicroscope की सहायता के साथ, धीरे कम भ्रूण के clumps कि dechorionation स्लाइड पर टेप की सतह पर संदंश के सुझावों का पालन किया है.
- फिर stereomicroscope का उपयोग कर, धीरे कुहनी से हलका धक्का या संदंश के पक्ष के साथ स्ट्रोक भ्रूण क्रम में भीतरी vitelline झिल्ली (भ्रूण फट जाएगा अगर vitelline झिल्ली उठी है) rupturing के बिना बाहरी मोमी chorion तोड़ने के लिए खुला.
- एक बार बाहरी chorion उठी किया गया है, chorion से भ्रूण तंग, dechorionated भ्रूण संदंश की सतह का पालन करता है. Dechorionated भ्रूण टेप की सतह को छू से बचने के लिए ध्यान रखना.
- जैसे ही एक भ्रूण के रूप में dechorionated है, जल्दी से इसे coverslip पर हेलोकार्बन तेल के पहले से तैयार ड्रॉप हस्तांतरण. हेलोकार्बन तेल ड्रॉप की सतह के लिए dechorionated भ्रूण ले जाने संदंश की नोक टच - इस संदंश से तेल में भ्रूण dislodges.
- भ्रूण के तेल ड्रॉप करने के लिए स्थानांतरण की पुष्टि करें. इस नग्न आँख है कि आप एक काले रंग की पृष्ठभूमि पर काम करते हैं और एक फाइबर ऑप्टिक रोशनी एक तिरछा कोण पर सेट स्रोत का उपयोग प्रदान के साथ किया जा सकता है.
- दूसरे भ्रूण dechorionate के प्रयास से पहले, संदंश से किसी भी तेल को साफ. तेल में लेपित संदंश chorion सतह पर कम खरीद है, dechorionation और अधिक कठिन बना रही है.
- Dechorionated भ्रूण हेलोकार्बन तेल में उछाल रहे हैं. संदंश या एक तूलिका का प्रयोग और जबकि एक stereomicroscope के माध्यम से, तेल की बूंद के नीचे देखने के लिए भ्रूण धक्का और यह इच्छित स्थान में व्यवस्था है.
- जल्दी रहते इमेजिंग चैम्बर की अच्छी तरह से अधिक coverslip पलटना. पुष्टि करें कि भ्रूण coverslip खिलाफ वांछित अभिविन्यास में आराम कर रहे हैं. अपने तेल में उछाल के कारण, भ्रूण अब coverslip के निचले सतह के खिलाफ जारी करेगी. टेप के साथ रहते इमेजिंग चैम्बर coverslip तय करो. टेप में क्षेत्र है जहां टेप spans coverslip और रहते इमेजिंग चैम्बर की अच्छी तरह से के अंत के अंत के बीच के अंतर में छेद काटने से कक्ष हवादार.
- एक ईमानदार प्रतिदीप्ति खुर्दबीन या एक प्रतिदीप्ति stereomicroscope अब भ्रूण छवि के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
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Discussion
हम रहते इमेजिंग विश्लेषण है, जो हम फांसी ड्रॉप प्रोटोकॉल फोन के लिए ड्रोसोफिला भ्रूण तैयारी की एक नई विधि का वर्णन. दुर्भाग्य से, यह संभव करने के लिए फांसी ड्रॉप प्रोटोकॉल का उपयोग अगर एक औंधा माइक्रोस्कोप के साथ काम नहीं है. Sandwiching तकनीक (के रूप में वर्णित सार ऊपर) और इस मामले में इस्तेमाल किया जाना चाहिए भ्रूण के संपीड़न एक चिंता का विषय बनी हुई है.
प्रयोगों में जहां सेल आकृति और आकार के क्रम में morphogenetic आंदोलन के साथ जुड़े बलों की गणना मापा जाता है, एक ईमानदार खुर्दबीन और फांसी ड्रॉप प्रोटोकॉल का उपयोग कम भ्रूण संपीड़न के लिए बेहतर कारण है. इसके अलावा, कम भ्रूण फांसी ड्रॉप प्रोटोकॉल का उपयोग संपीड़न दौर, भ्रूण के undistorted सतह पेश sandwiching तकनीक जबकि एक चपटी सतह प्रस्तुत करने का परिणाम है. जब confocal माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर यह है, इसलिए करने के लिए आवश्यक इकट्ठा एक व्यापक (ढेर प्रति अधिक स्लाइस) जेड ढेर जब sandwiching विधि बनाम फांसी ड्रॉप प्रोटोकॉल का उपयोग. Z ढेर प्रति स्लाइस की संख्या में वृद्धि, हालांकि, किसी भी तस्वीर विषाक्तता या तस्वीर विरंजन लेजर उत्तेजना के साथ जुड़े के रूप में अधिग्रहण के समय के रूप में अच्छी तरह से बढ़ जाती है. जाहिर है, प्रयोगात्मक कम संपीड़न के साथ जुड़े लाभ कुछ जेड ढेर अधिग्रहण बार में वृद्धि द्वारा ऑफसेट है. Z-ढेर अधिग्रहण के समय में इस वृद्धि के बावजूद, तथापि, हम फांसी ड्रॉप प्रोटोकॉल का उपयोग भ्रूण के उत्कृष्ट व्यवहार्यता मनाया.
फांसी ड्रॉप प्रोटोकॉल भी प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी द्वारा भ्रूण के अवलोकन घटना और उत्सर्जित प्रकाश का प्रकाश पथ में जो रहते इमेजिंग कक्ष के माध्यम से पारित नहीं है तक सीमित है. लाइव इमेजिंग भ्रूण डीआईसी माइक्रोस्कोपी या अन्य गैर प्रतिदीप्ति प्रकाशिकी का उपयोग रहते - इमेजिंग कक्ष को संशोधित करने के लिए निलंबित भ्रूण के माध्यम से संघनित्र से एक प्रकाश पथ की अनुमति के द्वारा प्राप्त किया जा सकता है.
एक चिंता का विषय है जब फांसी ड्रॉप तकनीक का उपयोग अवांछनीय आंदोलन या timelapse अधिग्रहण के दौरान देखने के क्षेत्र में भ्रूण की "बहती" हो सकता है. जब उल्टे coverslip के underside के खिलाफ चल, हम पाते हैं कि भ्रूण उल्लेखनीय स्थिर और बदलाव जब या तो सूखा या तेल विसर्जन उद्देश्यों का उपयोग कर की स्थिति में नहीं है. बहु timelapse एक motorized खुर्दबीन मंच का उपयोग अधिग्रहण भी भ्रूण की स्थिति है कि फांसी ड्रॉप प्रोटोकॉल का उपयोग करने के लिए तैयार हैं बाधित नहीं करता. फांसी ड्रॉप तकनीक के प्रयोग से तैयार भ्रूण के किसी भी आंदोलन हेलोकार्बन तेल बूंद के आकार को कम करने और सुनिश्चित करना है कि अलग तेल बूँदें fusing या रहते इमेजिंग कक्ष में अच्छी तरह से है की बढ़त के साथ wicking नहीं हैं के द्वारा समाप्त किया जा सकता है है.
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Acknowledgments
हम कृतज्ञता एक डिस्कवरी के रूप में के रूप में अच्छी तरह से अनुदान एक अनुसंधान उपकरण और साधन अनुदान से प्राकृतिक विज्ञान और कनाडा के इंजीनियरिंग अनुसंधान परिषद (NSERC) के माध्यम से BHR समर्थन स्वीकार करते हैं. हम भी एच. ओडीए और ब्लूमिंगटन ड्रोसोफिला स्टॉक केंद्र आनुवंशिक स्टॉक है कि उदाहरण के रहते इमेजिंग दृश्यों में इस्तेमाल किया गया प्रदान करने के लिए स्वीकार करते हैं.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Standard equipment and materials required to prepare embryos for live-imaging using the hanging drop protocol include the following items: microscope slides | |||
| coverslips (22 x 40 mm, No. 2) | |||
| double-sided tape | |||
| jeweller’s forceps (Dumont style No. 5) | |||
| halocarbon oil series 56 and series 700 (Halocarbon Products Corp.) | |||
| a utility knife or single edge razor blade | |||
| tissue paper | |||
| scissors | |||
| distilled water | |||
| general purpose tape | |||
| a pipet suitable for delivering 20-40 μl. | |||
| The live imaging protocol also requires a custom-made live imaging chamber. This is prepared by cutting a 5 mm think polycarbonate plastic sheet to the dimensions of a standard microscope slide (75 X 25 mm) and using a rotor to create a 3mm deep depression in the slide (20 X 55 mm). Access to a stereomicroscope (dissecting microscope) and a fiber-optic illumination source is also required. | |||
References
- Kiehart, D. P., Galbraith, C. G., Edwards, K. A., Rickoll, W. L., Montague, R. A. Multiple forces contribute to cell sheet morphogenesis for dorsal closure in Drosophila. J. Cell Biol. 149, 471-490 (2000).
- Schock, F., Perrimon, N. Cellular processes associated with germ band retraction in. , 248-2429 (2002).
- Reed, B. H., Wilk, R., Schock, F., Lipshitz, H. D. Integrin-dependent apposition of Drosophila extraembryonic membranes promotes morphogenesis and prevents anoikis. Curr. Biol. 14, 372-380 (2004).
- Wieschaus, E. p, Nusslein-Volhard, C. Drosophila: a practical approach. Roberts, D. B. , IRL Press Limited. Oxford, England. 199-227 (1986).
