Summary
이 프로토콜은 Sprague Dawley 쥐에서 지방 조직 유래 중간엽 줄기 세포(MSC)를 분리하고 식별하는 방법론을 설명합니다.
Abstract
성인 중간엽 세포는 최근 수십 년 동안 분자 및 세포 생물학에 혁명을 일으켰습니다. 그들은 자가 재생, 이동 및 증식을 위한 큰 능력 외에도 다양한 특수 세포 유형으로 분화할 수 있습니다. 지방 조직은 중간엽 세포의 가장 침습적이지 않고 가장 접근하기 쉬운 공급원 중 하나입니다. 또한 다른 공급원에 비해 수율이 높고 면역 조절 특성이 우수한 것으로 보고되었습니다. 최근에, 상이한 조직 공급원 및 동물 종으로부터 성체 중간엽 세포를 얻기 위한 상이한 절차가 발표되었다. 일부 저자의 기준을 평가한 후 다양한 목적에 적용할 수 있고 쉽게 재현할 수 있는 방법론을 표준화했습니다. 신장 주위 및 부고환 지방 조직의 기질 혈관 분획(SVF) 풀을 통해 최적의 형태와 기능을 갖춘 1차 배양을 개발할 수 있었습니다. 세포는 24시간 동안 플라스틱 표면에 부착된 것으로 관찰되었으며, 연장 및 콜로니 형성 경향과 함께 섬유아세포와 유사한 형태를 나타냈습니다. 유세포 분석 (FC) 및 면역 형광 (IF) 기술을 사용하여 막 마커 CD105, CD9, CD63, CD31 및 CD34의 발현을 평가했습니다. 지방 유래 줄기 세포(ASC)가 지방 유래 계통으로 분화하는 능력은 또한 인자 칵테일(4μM 인슐린, 0.5mM 3-메틸-이소-부틸-크산틴 및 1μM 덱사메타손)을 사용하여 평가되었습니다. 48시간 후, 섬유아세포양 형태의 점진적인 손실이 관찰되었고, 12일째에 오일 레드 염색에 양성인 지질 방울의 존재가 확인되었습니다. 요약하면, 재생 의학에 적용하기 위한 최적의 기능적 ASC 배양을 얻기 위한 절차가 제안됩니다.
Introduction
중간엽 줄기세포(MSC)는 자가 재생, 증식, 이동 및 다른 세포 계통으로의 분화 능력이 높기 때문에 재생 의학에 큰 영향을 미쳤습니다 1,2. 현재 많은 연구가 다양한 질병의 치료 및 진단 가능성에 초점을 맞추고 있습니다.
중간엽 세포의 출처는 골수, 골격근, 양수, 모낭, 태반, 지방 조직 등 다양합니다. 그들은 인간, 생쥐, 쥐, 개, 말3을 포함한 다양한 종에서 얻습니다. 골수 유래 중간엽 줄기세포(BMSC)는 재생 의학에서 줄기세포의 주요 공급원이자 배아 줄기 세포 사용의 대안으로 수년 동안 사용되어 왔다4. 그러나 지방 유래 중간엽 줄기 세포 또는 지방 유래 줄기 세포 (ASC)는 수집 및 분리가 용이하고 지방 조직 5,6 그램 당 얻은 세포의 수율로 인해 큰 이점을 가진 중요한 대안입니다. ASCs의 수확량은 일반적으로 BMSCs의 수확량보다 높다고 보고되었다7. 처음에는 ASC의 회복/재생 능력이 다른 세포 계통으로 분화할 수 있는 능력 때문이라고 제안되었다8. 그러나 최근 몇 년 동안의 연구는 ASC가 회복 잠재력에서 방출하는 측분비 인자의 주요 역할을 강화했습니다 9,10.
지방 조직(AT)은 에너지를 비축할 뿐만 아니라 내분비계, 신경계 및 심혈관계와 상호 작용합니다. 또한 출생 후 성장 및 발달, 조직 항상성 유지, 조직 복구 및 재생에 관여합니다. AT는 지방세포, 혈관 평활근 세포, 내피 세포, 섬유아세포, 단핵구, 대식세포, 림프구, 지방전구세포 및 ASC로 구성됩니다. 후자는 면역 원성이 낮기 때문에 재생 의학에서 중요한 역할을합니다11,12. ASC는 효소 분해 및 기계적 처리 또는 지방 조직 외식편에 의해 얻을 수 있습니다. ASC의 기본 문화는 유지 관리, 성장 및 확장이 쉽습니다. ASC의 표현형 특성 분석은 면역형광 및 유세포 분석과 같은 방법을 사용하여 특정 막 마커의 발현을 평가함으로써 세포의 정체성을 검증하는 데 필수적이다13. IFATS(International Federation for Adipose Therapeutics and Science)와 ISCT(International Society for Cellular Therapy)는 ASC가 CD73, CD90 및 CD105를 발현하는 반면 CD11b, CD14, CD19, CD45 및 HLA-DR14의 발현은 부족하다고 정의했습니다. 따라서 양성 및 음성 모두 이러한 마커는 ASC의 특성화에 신뢰할 수 있는 것으로 간주됩니다.
이 프로젝트는 쥐의 AT에서 추출한 성체 중간엽 세포의 분리 및 식별 절차를 설명하는 데 중점을 두었는데, 이 세포 공급원은 배아 줄기 세포와 달리 윤리적 문제를 나타내지 않기 때문입니다. 이것은 골수 유래 줄기 세포에 비해 접근이 용이하고 최소 침습적 방법으로 인해 실행 가능한 옵션으로 절차를 굳건히 합니다.
이 조직 공급원의 중간엽 세포는 면역 조절 능력과 낮은 면역 거부 반응으로 인해 재생 의학에서 중요한 역할을 합니다. 따라서 본 연구는 그들의 세크레톰과 당뇨병과 같은 대사 질환을 포함한 다양한 질병에서 재생 요법으로서의 적용에 대한 향후 연구의 근본적인 부분입니다.
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Protocol
모든 실험 절차는 국제 실험실 동물 관리 평가 및 인증 협회(Norma Oficial Mexicana NOM-062-200-1999, Mexico)의 권장 사항에 따라 멕시코 동물 관리 지침에 따라 수행되었습니다. 이 프로토콜은 Instituto Mexicano del Seguro Social의 건강 연구 윤리 위원회(R-2021-785-092)에서 검토, 승인 및 등록했습니다.
1. 외과적 절제술에 의한 쥐의 지방조직 제거
- 20mL의 멸균 1x 인산염 완충 식염수-항생제 항진균제(PBS-AA) 용액(1x PBS, 겐타마이신[20μg/mL] 및 암포테리신[0.5μg/mL])으로 두 개의 원뿔형 튜브를 준비하고 얼음 위에 유지합니다.
- 건강 상태가 양호한 성인 수컷 Sprague Dawley 쥐 (R. norvegicus) 두 마리를 선택합니다. 쥐가 생후 3-4개월 사이이고 코랄 무게가 350-450g인지 확인하십시오.
- 자일라진 염산염 20mg/kg으로 진정을 진행하고 5분 후 케타민 염산염 120mg/kg을 복강 주사하여 마취제를 투여합니다. 건조를 방지하기 위해 안과 용 연고로 양쪽 눈을 윤활하십시오. 그런 다음 페달 반사 부족을 통해 마취 깊이를 확인합니다.
- 복부와 사타구니 부위를 요오드 용액으로 면도하고 소독하십시오. 무균 상태를 유지하기 위해 외과 용 커튼을 적용하십시오. 그런 다음 흉골에서 고환 부위까지 중앙 세로 절개를합니다.
- 멸균 겸자로 부고환과 신장을 둘러싼 지방 조직을 제거하고 1x PBS-AA 용액에 넣습니다. 샘플을 얼음 위에 보관하십시오.
- 기관 지침에 따라 필요한 경우 절개 부위를 봉합하고 40mg/kg 펜토바르비탈 나트륨의 심장 내 용량으로 동물을 안락사시킵니다. 사망이 확인되면 제도적 절차에 따라 시체를 처리한다.
참고: 죽음은 중간엽 세포의 면역 표현형, 분화 능력 및 측분비 효과에 영향을 미치는 신호 전달 메커니즘을 유도합니다. 따라서 조직 수집은 안락사 전에 수행됩니다.
2. 지방조직에서 중간엽 세포의 분리
- 생물 안전 캐비닛 내에서 멸균 집게로 지방 조직을 제거하고 100mm 직경의 페트리 접시에 멸균 여과지에 올려 과도한 PBS를 흡수합니다.
- 지방 조직을 다른 페트리 접시로 옮기고 10mL 피펫을 사용하여 1x PBS-AA 용액 10mL로 각각 5분 동안 3회 세척을 수행합니다.
- 가위와 메스를 사용하여 조직을 약 1cm2 의 조각으로 기계적으로 분해합니다.
- 보충되지 않은 Dulbecco's modified Eagle's medium(DMEM) 20mL에 콜라게나제 IV형(0.075%)을 준비합니다. 0.22μm 주사기 필터를 통해 여과하고 37°C에서 유지합니다.
- 단계 2.4에서 제조된 콜라게나제 용액(20 mL)을 파편화된 조직과 마그네틱 바가 있는 크리스탈 비이커에 넣는다. 용기를 밀봉하고 37°C에서 서서히 연속적인 교반 하에 배양한다.
참고: 효소 분해에는 약 90분이 소요됩니다(세포막의 무결성을 유지하기 위해 천천히 저어줍니다). - 100mm 페트리 접시의 스테인리스 스틸, 40메쉬, 0.38mm 조리개 필터를 통해 균질액을 여과하고 멸균된 50mL 원뿔형 튜브에 세포 현탁액을 수집합니다.
- 따뜻하게 하고 보충된 DMEM(10% 소 태아 혈청[FBS], 2mM 글루타민, 2mM 피루브산나트륨, 100x 비필수 아미노산 용액 및 100x 항생제 항진균 용액[AA]) 20mL를 추가합니다. 기질 혈관 분획 (SVE)을 조심스럽게 중단하십시오.
- 세포 현탁액을 290 x g 에서 10분 동안 원심분리하고, 25 mL 피펫으로 상청액을 버리고, 40 mL의 비보충 DMEM 배지로 세포를 부드럽게 세척한다.
- 이 단계를 반복합니다. 단계 사이에 새로운 멸균 원추형 튜브를 사용하여 세포 찌꺼기와 지방을 최소한으로 끌어냅니다.
- 펠릿을 5mL 피펫으로 보충된 DMEM 5mL에 현탁하고 T-25cm2 병으로 옮깁니다. 37°C 및 5%CO2에서 24시간 동안 인큐베이션한다.
- 다음 날, 5mL의 데워진 1x PBS-AA로 3회 세척하고 보충되지 않은 DMEM으로 2회 세척하여 세포 파편과 비부착성 세포를 제거합니다. 5mL 피펫으로 신선하고 따뜻하게 보충된 DMEM 5mL를 추가하고 3-4일마다 배지를 교체합니다.
3. ASC 1차 문화의 유지 및 확장
- 세포가 90%-100% 합류(8± 2일)에 도달하면 보충되지 않은 DMEM 5mL로 두 번 세척합니다. 데워진 0.025% 트립신-2mM 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA) 1mL를 넣고 37°C에서 5-7분 동안 배양합니다.
- 세포 단층이 분리되면 보충된 DMEM 4mL를 추가하고 세포 현탁액을 부드럽게 분해합니다.
- 세포 현탁액을 15mL 원뿔형 튜브로 옮기고 5mL의 따뜻하고 보충된 DMEM을 추가하고 부드럽게 현탁하여 균질화합니다.
- 290 x g 에서 5분 동안 원심분리기. 상층액을 버리고 펠릿을 보충된 DMEM 1mL에 부드럽게 혼합합니다. Trypan blue로 염색한 후 Neubauer 챔버에서 세포를 계수합니다.
- 마지막으로 T-75 플라스크에서 2.5 x 103 cells/cm 2 를 1:4의 분할 비율로 시드합니다. 이 단계는 집락 형성과 높은 증식 속도를 보장합니다.
4. ASC 1차 배양의 형태학적 특성
- 도립 현미경으로 ASC의 형태를 관찰합니다.
알림: 조직학 및 ASC 식별을 위해 장착하기 전에 커버슬립을 1% 젤라틴 용액으로 처리하십시오. UV를 15분 동안 조사합니다.- 70% 에탄올 용액에서 커버슬립을 제거하고 5분 동안 건조시킵니다.
- 커버슬립을 멸균된 1% 젤라틴 용액에 담그고 물기를 빼고 실온(RT)에서 건조합니다.
- 각 커버슬립을 6웰 플레이트의 각 웰에 넣고 플레이트에 15분 동안 UV 광선을 조사합니다.
- 웰 중앙에 25 x 103 세포가 들어 있는 한 방울을 시딩하고 1분 정도 기다린 후 보충된 DMEM 배지 1mL를 추가합니다. 37°C 및 5%CO2에서 96시간 동안 인큐베이션한다.
- 배지를 제거하고 이송 피펫을 사용하여 1x PBS-AA로 3회 세척을 수행합니다.
- 3.5% 중성 포르말린 1mL를 각 웰에 넣고 RT에서 1시간 동안 배양합니다. 포르말린을 조심스럽게 제거하고 차가운 70% 에탄올 1mL를 각 웰에 추가합니다.
- 건조를 방지하기 위해 사용할 때까지 파라필름으로 플레이트를 밀봉하십시오.
참고: ASC의 세포 형태는 또한 다른 계대 동안 헤마톡실린-에오신 염색에 의해 평가됩니다. - 각 웰로부터 70% 에탄올을 제거하고, 증류수로 5분 동안 세포를 수화시킨다. 한편, 염색 용액을 여과한다.
- 물을 제거하고 Harris의 헤마톡실린 용액으로 15분 동안 천천히 교반하면서 세포를 염색합니다.
- 염색 용액을 제거하고 1x PBS로 두 번 세척합니다.
- 에오신 용액으로 세포를 1분 동안 천천히 교반하여 염색합니다. 그런 다음 용액을 제거하고 1x PBS로 두 번 세척합니다.
- 각 웰에서 커버슬립을 조심스럽게 제거하고 PBS-글리세롤 장착 용액(1:1 v/v) 한 방울에 슬라이드를 장착합니다.
- 커버슬립 주위에 네일 바니시를 한 줄 붙이고 광학 현미경으로 조직학적 슬라이드를 관찰합니다.
5. 면역형광법에 의한 ASC의 발현 마커
- 1x PBS-0.05% Tween 20을 함유하는 세척 완충액을 준비한다. RT에서 천천히 흔들어 세탁하십시오. 2mL의 완충액/웰로 플레이트를 세 번 세척합니다(세척할 때마다 3분 동안 배양).
- 1mL의 블로킹 시약(1:10)을 넣고 20분 동안 천천히 교반하면서 배양합니다.
- CD9(단클론 마우스), CD34(다클론 토끼) 및 항-CD63(다클론 염소)과 같은 1차 항체 200μL(1:50 희석)를 각 웰에 추가합니다. 4°C에서 하룻밤 동안 배양합니다.
- 플레이트를 다시 세 번 세척하고 다음 2차 항체의 200μL(1:50 희석)와 함께 배양합니다: 항-마우스 IgG FITC 접합 염소, 당나귀 항-염소 IgG DyeLight 550 및 염소 항-토끼 IgG Cy3.
- 1x PBS-0.05% Tween 20으로 3회 세척하고 100μL의 DRAQ-7(희석: 이중 증류수 1mL에 17μL)로 세포핵을 20분 동안 대조염색합니다.
- 세 번 더 씻고 4.1.12-4.1.13 단계에 따라 슬라이드를 장착합니다. 샘플을 빛으로부터 보호하고 사용할 때까지 냉동하십시오.
- 에피형광 컨포칼 현미경 하에서 이 장비에 권장되는 적절한 설정과 소프트웨어를 사용하여 샘플을 시각화합니다.
6. 유세포 분석에 의한 ASC의 발현 마커
- 트립신 처리 또는 해동된 세포(하위 계대 3 또는 4)의 단일 세포 현탁액을 1x PBS-5% FBS의 1 x 106 cells/mL 농도로 조정합니다. 1.5mL 원심분리기 튜브에 100,000개 세포와 함께 100μL를 분취합니다. 자동 형광 제어를 위해 라벨링 없이 하나의 분취량을 사용합니다.
- 제조업체의 지침에 따라 적절한 양의 Anti-CD105 AF-594 및 Anti-CD31 AF-680을 모두 추가합니다. 4°C에서 20분 동안 어두운 곳에서 배양합니다.
- 250 x g 에서 5분 동안 원심분리하여 1mL의 1x PBS-5% FBS로 초과 염색을 세척하고 1% 포르말린 300μL에 현탁합니다.
- 유세포 분석기에서 시료 수집을 수행합니다. 셀의 게이팅 전략은 FSC-A 대 SSC-A 게이팅, SSC-H 대 SSC-A를 사용하여 게이팅된 단일 셀, FSC-A 대 FSC-H를 기반으로 합니다.
- CD105 AF-594에는 Y610-mCherry-A 검출기를 사용하고 CD31 AF-680에는 R660-APC-A 검출기를 사용합니다.
7. ASC와 지방 생성 계통의 분화
- 6-웰 플레이트에서, 시드 1 x 10 cm2 당 4 세포 (P-4) 및 60-80% 합류(~72-96 h)까지 37°C, 5%CO2에서 인큐베이션한다. 4 μM 인슐린, 1 μM 덱사메타손 21-아세테이트(Dxa) 및 0.5 mM의 3-이소부틸-1-메틸크산틴(MIX)을 배양 배지에 직접 적용하여 분화를 유도합니다. 분화 배지는 2-3일마다 교체하십시오.
- 멸균 초순수 2mL에 800μM 인슐린 원액을 준비하고(완전한 용해를 위해 1N HCl 20μL 추가) -20°C에서 보관합니다. 이전에 1:100으로 희석한 인슐린 스톡 10μL를 추가하고 웰당 2mL의 최종 부피로 10μL를 적용합니다.
- 멸균 초순수 5mL에 1mM Dxa의 원액을 준비합니다(완전 용해가 일어나지 않음). 4 °C에서 보관하십시오. 40 μL/well의 1:4 희석 Dxa 스톡을 추가합니다.
- 2.5mL의 0.1N NaOH에 100mM의 MIX를 준비하고, 와동하고, 완전한 용해를 위해 40μL의 1N NaOH를 추가합니다. -70 °C에서 보관하십시오. 10 μL/well의 MIX 스톡을 추가합니다.
- 보관하기 전에 0.22μm 멸균 주사기 필터를 통해 저장 용액을 여과합니다.
- 12일째에, 세포를 1x PBS로 3회 세척하고, RT에서 1시간 동안 4% 포르말린 500 μL로 인큐베이션한다. 증류수로 각 웰을 2회 세척하고, 이어서 60% 이소프로판올을 5분 동안 건조시켰다.
- 60% 이소프로판올(500μL/웰)로 희석한 0.5% 오일 레드 O를 넣고 RT에서 20분 동안 배양합니다. 증류수 1mL로 3회 세척하고 도립 현미경으로 관찰합니다.
알림: 필요한 시약, 장비 및 재료는 재료 표를 참조하십시오.
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Representative Results
지방 조직은 생후 3-4개월의 성인 Sprague Dawley 쥐에서 얻었으며 체중은 401g± 41g(기하 평균 ± SD)입니다. 부고환 및 신장 주위 지방 조직의 평균값 3.8 g은 15 개의 실험 추출 분석에 해당한다. 배양 24시간 후, 세포 집단은 플라스틱 표면에 부착된 상태를 유지하고 이질적인 형태를 나타냈습니다. 첫 번째 계대배양은 8 ± 2일째에 실현되었으며, 총 8번의 실험에서 0.6 x 106 세포± 1.4 수율로 실현되었다. 직접 명시야 관찰(그림 1)과 헤마톡실린-에오신 염색(그림 2)은 광학 현미경으로 형태학적 특성 분석을 용이하게 했습니다. 길쭉한 연장과 풍부한 세포 내 미세 필라멘트, 중간 엽 기질 세포의 특징과 함께 광범위한 세포질이 보였습니다.
ASC는 서로 다른 하위 통로(1, 3, 7 및 9)에서 간접 면역형광에 의해 구체적으로 시각화된 표면 마커를 발현했습니다(그림 3). ASC는 시험된 모든 하위-계대에서 CD9 표면 마커에 대해 100% 양성이었다. 백분율은 무작위로 촬영된 5개의 현미경 사진에서 계수된 총 세포 수에 대한 양성 세포의 수입니다. 세포(100%)는 하위 계대 1, 3 및 9(P-1, P-3, P-9)에서 CD63 마커를 발현한 반면 P-7에서는 49.3%를 발현했습니다. CD34 마커는 계대 1, 7 및 9에서 음성이었으나, 계대 3에서 양성 표지 결과가 관찰되었다. 또한, FCM에 의한 면역표현형 분석은 세포 집단의 98.7%가 CD105에 대해 양성인 반면, 5.88%만이 CD31 마커를 발현하는 것으로 나타났다(도 4).
마지막으로, 12일 동안 분화 인자의 칵테일에 노출된 ASC는 지방 생성 계통으로 분화하는 능력을 보여주었습니다(그림 5). 48 시간 후, 우리는 형태의 첫 번째 변화를 관찰했습니다. 세포는 크기가 작아지고 둥근 모양을 나타내었다. 7일 후, 지질 소포가 보였고, 분화 12일 후 오일 레드 염색에 양성이었다.
그림 1: 쥐 지방 조직에서 추출하고 0.075% 콜라게나제로 분해한 기질 혈관 분획(SVF)(24시간 ). (ᅡ) SVF (20x). (B) SVF는 5회 세척(10x)을 따랐다. 플라스틱 표면에 부착된 세포는 둥글고 별 모양이며 섬유아세포체(도립 현미경)와 같은 이질적인 형태를 나타냅니다. 스케일 바는 100μm를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 헤마톡실린-에오신 염색을 통한 형태학적 특성화. (A) ASC, P-1(10x). (B) ASC, P-1, (C) P-3 및 (D) P-9(100x). 스케일 바는 100μm를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: IF에 의한 ASC 및 엑소좀에 대한 다양한 발현 마커 평가. 축 X: 통로 1, 3, 7 및 9. 축 Y: CD9: 항마우스 IgG FITC 공액 염소; CD63: 염소 항토끼 IgG Cy3; 및 CD34: 당나귀 항염소 IgG DyeLight 550. DraQ7(40x 배율, 1x 줌)로 파란색으로 염색된 핵. 스케일 바는 모든 패널에서 100μm를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 유세포 분석에 의한 ASC 식별. (A-C) SSC-A 대 SSC-A 게이팅, SSC-H 대 SSC-A를 사용하여 게이팅된 단일 세포, FSC-A 대 FSC-H를 기반으로 선택된 샘플. (D,E) 자가 형광 제어 (표지되지 않은 세포). (에프, 지) 항-CD105 AF-594(Y610 mCherry; 양성 마커) 및 항-CD31 AF-680(R660-APC-A 검출기; 음성 마커)으로 각각 표지된 ASC. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 쥐 지방 조직 중간엽 기질 세포의 기능 평가. (A) 대조군(10x). (B) 지방 분화 10x, (C) 20x 및 (D) 40x. 유도 12일째에 오일 레드 염료에 양성인 세포질 내 지질 방울(위상차 현미경). 스케일 바는 100μm를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
중간엽 줄기세포가 발견된 이후 지난 40년 동안 여러 그룹의 연구자들이 다양한 조직과 종에서 중간엽 줄기세포를 얻는 절차를 설명했습니다. 쥐를 동물 모델로 사용하는 장점 중 하나는 유지 관리가 쉽고 발달이 빠르며 지방 조직에서 중간엽 줄기 세포를 쉽게 얻을 수 있다는 것입니다. ASC를 얻기 위한 상이한 조직 공급원, 예컨대 내장, 주위지방, 부고환 및 피하 지방 12,13,14,15,16이 기재되어 있다.
여기에 사용 된 추출 절차와 관련하여 저자는 쥐의 체중이 350-450g 사이 여야하며 생후 첫 4 개월 동안 달성 할 수 있다고 권장합니다. 동물의 체중이 450-600g이고 생후 8개월까지일 때 쥐당 지방 조직의 양(5.5 ± 2.1, 평균 ± SD)이 더 높았습니다. 그러나 ASC의 수는 비례적으로 증가하지 않았습니다(데이터는 표시되지 않음). 이러한 관찰은 González3의 관찰과 일치하며, 그는 또한 다른 출처에 비해 피하 조직에서 얻은 배양 표면에 더 높은 생존력과 접착력을 가진 개체군을 언급했습니다. 반면, 생검 절제술로 얻은 ASC는 지방 흡입술로 얻은 ASC에 비해 더 큰 생존력, 빈도 및 복제 능력을 나타낸다7. 본 연구에서, 연구된 연령에서 래트의 피하 조직은 매우 드물었다. 따라서 우리는 외과적 절제술을 통해 포도당과 지질 조절, 염증과 관련된 아디포카인의 합성과 분비에 관여하는 부고환과 신장주위부에 인접한 지방조직을 제거하기로 결정했다16.
지방 조직 유래 중간엽 줄기세포를 분리하기 위한 현재의 프로토콜은 체외이식편 배양(explant culture)17과 같은 효소 없는 처리 절차와 거의 전체 조직 분해(18)를 달성하기 위한 효소 처리의 사용에 의존한다. 제안된 절차는 비교적 간단하고, 기계적 분해, 효소적 분해, 및 세포 현탁액에 대한 연속적인 세척을 포함한다. 후자는 전구 세포로부터 가능한 한 많은 관련없는 세포를 제거하여 표면 마커의 최소 발현 (<5 %)을 얻기 위해 수행됩니다. 흥미롭게도, 얻을 수 있는 SVF의 양은 지방 조직의 효소 분해에 사용되는 콜라게나제의 유형에 따라 달라질 수 있습니다. 유형 I 콜라게나제는 지방 세포 분리에 적극 권장되지만 유형II 19 및 유형 VIII의 사용도보고됩니다 20,21. 현재 연구에서 우리는 일반적으로 췌장 조직을 처리하는 데 사용되는 효소 활성이 낮은 콜라겐 분해 효소 유형 IV를 사용했습니다. 따라서, ASCs의 더 낮은 수율이 얻어지지만, 또한 막 손상이 적다. 이렇게 하면 일부 표면 마커의 표현이 수정되어 기능이 수정될 수 있습니다. 반면에, 문화의 확장에 사용 된 낮은 분할 비율은 식민지의 형성과 더 큰 증식 능력을 허용했다.
형태학에 따르면 중간엽 세포에는 작은 세포, 길쭉한 세포, 증식이 느린 큰 핵을 가진 크고 납작한 세포의 세 가지 주요 유형이 있습니다. 이러한 형태는 아마도 분화 잠재력22과 같은 본질적인 특성과 관련이 있을 것이다. ASC의 1차 배양에서 관찰된 형태는 이 저자가 보고한 결과와 일치합니다. 세포질의 풍부한 수의 미세 필라멘트도 평가 된 모든 단계에서 볼 수 있었으며, 이는 연구23,24,25에서 얻은 ASC의 섬유 모세포체 형태를 확증합니다. 또한, 면역표현형 분석은 분리된 세포의 중간엽 성질을 확인하는 데 필요하다. ISCT와 IFATS는 다른 대안도 가능하지만 일부 마커의 사용을 권장합니다. 중간엽 줄기세포는 특정 단백질 함량을 가진 세포외 배지로 분비되는 작은 소포인 엑소좀(exosomes)26을 다량 생산할 수 있는 것으로 알려져 있다. 엔도솜 기원으로 인해 융합 및 막 수송 단백질(GTPase, 아넥신, 플로틸린), 테트라스파닌(CD9, CD63, CD81 및 CD82)을 함유하고 있으며, 또한 이들이 유래한 세포 표면에 발현됩니다17,18. 이 연구의 한계는 광범위한 마커 패널이 평가되지 않는다는 것입니다. 그러나 동일한 테스트에서 최소 2개의 양성 및 음성 마커를 사용하는 것이 허용됩니다.
이 연구에서 엑소좀 마커를 사용한 간접 면역형광은 하위 통로 1, 3, 7 및 9에서 ASC에서 CD9 및 CD63 마커로의 양성 신호를 나타냈습니다. 통로 7에서 관찰된 신호가 약했기 때문에 더 나은 결과를 얻으려면 ISCT와 IFATS에서 권장하는 마커를 사용하는 것이 중요합니다. CD34는 내피 및 조혈 세포 마커 및 지방 조직 SVF 유래 세포의 양성 마커로 인식되는 표면 항원입니다. 그러나 천연 ASC에서의 발현은 시험관 내 세포 확장과 음의 상관관계가 있습니다 27. CD34+ 세포 비율은 지방 조직 채취 방법, 혈관 출혈 정도, 후속 소화 및 분리 기술에 따라 다릅니다. ASC는 일관되게 상이한 마커를 발현하지만, 이들의 역학은 시험관 내 확장 동안 변화하는 것으로 나타났다28,29, 제안된 방법론으로 얻은 결과에 의해 입증된 바와 같이.
현재 ASC를 얻기 위한 표준화된 프로토콜은 없습니다. 다른 요인이 형태와 기능을 수정하기 때문에 결과는 가변적입니다. 기증자의 연령과 건강 상태, 출처 및 ASC의 배양 조건은 이러한 요인 중 일부입니다. 제안된 방법론은 다양한 조사의 목적을 포괄하는 재현 가능한 방법론의 표준화에 중점을 둡니다. 과학계는 당뇨병을 포함한 다양한 대사 질환의 진단, 통제 및 치료를 위한 새로운 치료 옵션을 찾기 위해 노력하고 있습니다. 따라서 방법 론적 절차의 공개도 적절하다.
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Disclosures
저자는 이해 상충이 없다고 선언합니다.
Acknowledgments
저자는이 프로젝트를 수행하기 위해 제공 된 지원에 대해 멕시코 사회 보장 연구소 (IMSS)와 멕시코 아동 병원, 페데리코 고메즈 (HIMFG) 및 IMSS 연구 조정의 Bioterio 직원에게 감사드립니다. AOC (815290) 장학금에 대한 국립 과학 기술위원회와 시청각 자료에 대한 기술 지원에 대해 Antonio Duarte Reyes에게 감사드립니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amphotericin B | HyClone | SV30078.01 | |
| Analytical balance | Sartorius | AX224 | |
| Antibody anti- CD9 (C-4) | Santa Cruz | Sc-13118 | |
| Antibody anti-CD34 (C-18) | Santa Cruz | Sc-7045 | |
| Antibody anti-C63 | Santa Cruz | Sc-5275 | |
| Antibody anti-Endoglin/CD105 (P3D1) Alexa Fluor 594 | Santa Cruz | Sc-18838A594 | |
| Antibody anti-CD31/PECM-1 Alexa Fluor 680 | Santa Cruz | Sc-18916AF680 | |
| Antibody Goat anti-rabitt IgG (H+L) Cy3 | Novus | NB 120-6939 | |
| Antibody Donkey anti-goat IgG (H+L) DyLight 550 | Invitrogen | SA5-10087 | |
| Antibody anti-mouse IgG FITC conjugated goat F (ab´) | RD Systems. | No. F103B | |
| Bottle Top Filter Sterile | CORNING | 10718003 | |
| Cell and Tissue Culture Flasks | BIOFIL | 170718-312B | |
| Cell Counter Bright-Line Hemacytometer with cell counting chamber slides | SIGMA Aldrich | Z359629 | |
| Cell wells: 6 well with Lid | CORNING | 25810 | |
| Centrifuge conical tubes | HeTTICH | ROTANA460R | |
| Centrifuge eppendorf tubes | Fischer Scientific | M0018242_44797 | |
| Collagen IV | Worthington | LS004186 | |
| Cryovial | SPL Life Science | 43112 | |
| Culture tubes | Greiner Bio-One | 191180 | |
| CytExpert 2.0 | Beckman Coulter | Free version | |
| CytoFlex LX cytometer | Beckman Coulter | FLOW-2463VID03.17 | |
| DMEM | GIBCO | 31600-034 | |
| DMSO | SIGMA Aldrich | 67-68-5 | |
| DraQ7 Dye | Thermo Sc. | D15106 | |
| EDTA | SIGMA Aldrich | 60-00-4 | |
| Eosin yellowish | Hycel | 300 | |
| Ethanol 96% | Baker | 64-17-5 | |
| Falcon tubes 15 mL | Greiner Bio-One | 188271 | |
| Falcon tubes 50 mL | Greiner Bio-One | 227261 | |
| Fetal Bovine Serum | CORNING | 35-010-CV | |
| Gelatin | SIGMA Aldrich | 128111163 | |
| Gentamicin | GIBCO | 15750045 | |
| Glycerin-High Purity | Herschi Trading | 56-81-5 | |
| Hematoxylin | AMRESCO | 0701-25G | |
| Heracell 240i CO2 Incubator | Thermo Sc. | 50116047 | |
| Ketamin Pet (Ketamine clorhidrate) | Aranda | SV057430 | |
| L-Glutamine | GIBCO/ Thermo Sc. | 25030-081 | |
| LSM software Zen 2009 V5.5 | Free version | ||
| Biological Safety Cabinet Class II | NuAire | 12082100801 | |
| Epifluorescent microscope | Zeiss Axiovert 100M | 21.0028.001 | |
| Inverted microscope | Olympus CK40 | CK40-G100 | |
| Non-essential amino acids 100X | GIBCO | 11140050 | |
| Micro tubes 2 mL | Sarstedt | 72695400 | |
| Micro tubes 1,5 mL | Sarstedt | 72706400 | |
| Micropipettes 0.2-2 μL | Finnpipette | E97743 | |
| Micropipettes 2-20 μL | Finnpipette | F54167 | |
| Micropipettes 20-200 μL | Finnpipette | G32419 | |
| Micropipettes 100-1000 μL | Finnpipette | FJ39895 | |
| Nitrogen tank liquid | Taylor-Wharton | 681-021-06 | |
| Paraformaldehyde | SIGMA Aldrich | SLBC3029V | |
| Penicillin / Streptomycin | GIBCO/ Thermo Sc. | 15140122 | |
| Petri dish Cell culture | CORNING Inc | 480167 | |
| Pipet Tips | Axygen Scientific | 301-03-201 | |
| Pisabental (pentobarbital sodium) | PISA Agropecuaria | Q-7833-215 | |
| Potassium chloride | J.T.Baker | 7447-40-7 | |
| Potassium Phosphate Dibasic | J.T Baker | 2139900 | |
| S1 Pipette Fillers | Thermo Sc | 9531 | |
| Serological pipette 5 mL | PYREX | L010005 | |
| Serological pipette 10 mL | PYREX | L010010 | |
| Sodium bicarbonate | J.T Baker | 144-55-8 | |
| Sodium chloride | J.T.Baker | 15368426 | |
| Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous | J.T Baker | 7558-79-4 | |
| Sodium pyruvate | GIBCO BRL | 11840-048 | |
| Syringe Filter Sterile | CORNING | 431222 | |
| Spectrophotometer | PerkinElmer Lambda 25 | L6020060 | |
| Titer plate shaker | LAB-LINE | 1250 | |
| Transfer pipets | Samco/Thermo Sc | 728NL | |
| Trypan Blue stain | GIBCO | 1198566 | |
| Trypsin From Porcine Pancreas | SIGMA Aldrich | 102H0234 | |
| Tween 20 | SIGMA Aldrich | 9005-64-5 | |
| Universal Blocking Reagent 10x | BioGenex | HK085-GP | |
| Xilapet 2% (xylazine hydrochloride) | Pet's Pharma | Q-7972-025 |
References
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