Summary
该技术描述了一种有效的工作流程，使用基于荧光的实时成像可视化和定量测量HeLa细胞内的线粒体膜电位和超氧化物水平。
Abstract
线粒体是通过ATP合成 控制 能量产生，对代谢稳态至关重要的动态细胞器。为了支持细胞代谢，各种线粒体质量控制机制合作以维持健康的线粒体网络。其中一种途径是线粒体自噬，其中PTEN诱导的激酶1（PINK1）和受损线粒体的Parkin磷酸化泛素化促进自噬体隔离并随后通过溶酶体融合 从 细胞中去除。线粒体自噬对细胞稳态很重要，帕金的突变与帕金森病（PD）有关。由于这些发现，人们非常重视研究线粒体损伤和周转，以了解线粒体质量控制的分子机制和动力学。在这里，活细胞成像用于可视化HeLa细胞的线粒体网络，以量化线粒体解偶联剂羰基氰间氯苯基腙（CCCP）处理后的线粒体膜电位和超氧化物水平。此外，表达抑制帕金依赖性线粒体自噬的帕金PD连锁突变（ParkinT240R）以确定与表达野生型帕金的细胞相比突变如何影响线粒体网络。此处概述的方案描述了一种简单的工作流程，使用基于荧光的方法有效地量化线粒体膜电位和超氧化物水平。
Introduction
线粒体网络是一系列相互连接的细胞器，在能量产生1，先天免疫2，3和细胞信号传导4，5中起着至关重要的作用。线粒体失调与帕金森病（PD）等神经退行性疾病有关6，7。PD是一种进行性神经退行性疾病，影响黑质的多巴胺能神经元，影响全球近1000万人8。PD与线粒体自噬有遗传联系，线粒体自噬是维持细胞稳态所必需的线粒体质量控制途径，选择性地去除受损的线粒体9，10。研究已经确定了多种独立的线粒体自噬途径，包括含有 1 （FUNDC1） 介导的线粒体自噬的 FUN14 结构域、Bcl-2 相互作用蛋白 3 （BNIP3） 促进的线粒体自噬、NIX 依赖性线粒体自噬以及特征明确的 PTEN 诱导激酶 1 （PINK1）/帕金调节线粒体自噬10，11。PINK1（一种假定的激酶）和帕金（一种E3泛素连接酶）与磷酸泛素受损线粒体协同工作，后者驱动自噬体的形成，吞噬受损细胞器并与溶酶体融合以启动降解12，13，14，15，16。帕金的突变与PD相关的表型有关，例如通过多巴胺能神经元丢失引起的神经变性17，18。
在这里，描述了一个协议，其中HeLa细胞，常规使用的源自宫颈癌的永生化细胞，用于研究Parkin在维持线粒体网络健康中的作用。HeLa细胞表达的内源性帕金水平可以忽略不计，因此需要外源性帕金表达19。为了研究Parkin在线粒体网络健康中的作用，用野生型Parkin（ParkinWT），Parkin突变体（ParkinT240R）或空对照载体转染HeLa细胞。ParkinT240R是一种常染色体隐性幼年帕金森综合征突变，影响Parkin E3连接酶活性，显着降低线粒体自噬途径的效率20。HeLa细胞暴露于轻度（5μM）或严重（20μM）浓度的羰基氰间氯苯基腙（CCCP），一种线粒体解偶联剂。用高浓度的CCCP处理通常用于在各种细胞系中诱导帕金介导的线粒体自噬，例如HeLa和COS-7细胞21，22，23。
治疗后，该方案使用两种当前可用的线粒体靶向荧光染料对线粒体网络进行实时成像。四甲基罗丹明、乙酯、高氯酸盐 （TMRE） 是一种阳离子染料，其荧光基于线粒体膜电位24，而 MitoSOX 是一种线粒体超氧化物指示剂，其中荧光强度是超氧化物浓度25 的函数。最后，概述的方案使用基于荧光的定量和简单的工作流程来有效地量化线粒体膜电位和超氧化物水平，而用户偏差的范围最小。尽管该协议旨在研究HeLa细胞中的线粒体功能，但它可以适用于其他细胞系和原代细胞类型，以定量表征线粒体网络健康。
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Protocol
1. 生物样品的制备
注意：在生物安全柜中使用无菌技术执行以下步骤。用70%乙醇喷洒机柜表面和所有材料。
- HeLa细胞培养和转染
- 在Dulbecco的改良鹰培养基（DMEM）中培养30，000个HeLa细胞，含有4.5g / L葡萄糖，补充有10%胎牛血清和1%L-谷氨酰胺溶液（HeLa培养基;参见 材料表）。将细胞铺在含有 2 mL 预热 HeLa 培养基的 35 mm 玻璃底成像皿（参见材料 T 上）。将HeLa培养物保持在5%CO2 和37°C26，27。
- 电镀后的第二天，使用光学显微镜检查35毫米成像皿，以确保细胞~50%-60%汇合。汇合后，用空的黄色荧光蛋白（YFP）载体，YFP-ParkinWT或YFP-ParkinT240R 转染HeLa细胞（图1A）。
- 每次转染时，在无菌微量离心管中制备两种单独的混合物。通过敲击试管或轻轻上下移液进行混合。
- 在管 1 中，将 200 μL 还原血清培养基（参见 材料表）与 2 μg 质粒 DNA 混合。
- 在试管 2 中，将 200 μL 还原血清培养基与 6 μL 转染试剂混合（参见 材料表）28。
- 将试管在室温（RT）下孵育5分钟。将管2加入管1中，通过上下移液混合，并在室温下孵育20分钟。
- 将转染复合物滴加到含有HeLa细胞培养物的现有成像培养皿中，确保在整个培养皿中均匀分布。将成像培养皿置于5%CO2 和37°C培养箱中过夜。
注意：用适当的转染质粒标记每个培养皿。对于每个实验，标记三个YFP-ParkinWT 培养皿（二甲基亚砜[DMSO;见 材料表]，5μM CCCP和20μM CCCP）。用三个YFP-ParkinT240R 培养皿和三个空的YFP载体培养皿重复标签。
- CCCP和荧光染料的制备
注意：荧光染料通常对光敏感。使用铝箔或棕色离心管将染料存放在黑暗中，以减少暴露在光线下。- 通过将 5 mg CCCP 溶解在 4.89 mL DMSO 中，制备 5 mM 的 CCCP 工作储备液（参见 材料表）。通过将 5 mg CCCP 溶解在 1.22 mL DMSO 中，制备 20 mM 的 CCCP 工作储备液。
- 在 390 μL DMSO 中稀释 10 μL 1 mM MitoTracker 深红色（参见 材料表）储备溶液，制成 25 μM 工作储备液。
- 将 50 μg MitoSOX 红25 （参见 材料表）溶解在 13 μL DMSO 中，以创建 5 mM 工作储备液。
- 将 10 mg TMRE24 （参见 材料表）溶解在 19.4 mL DMSO 中，制成 1 mM 储备溶液。通过将 10 μL 1 mM TMRE 加入 990 μL DMSO 中来稀释 TMRE，制成 10 μM 工作储备液。
2. HeLa细胞中荧光探针的CCCP处理和线粒体标记
注意：快速执行以下步骤，以确保HeLa细胞不会长时间离开培养箱。
- 转染后第二天，向每个实验板中加入 2 μL 的 5 或 20 mM CCCP（终浓度：分别为 5 μM 和 20 μM）。对于对照板，加入 2 μL DMSO。将板返回到5%CO2 和37°C培养箱中1.5小时（图1A）。
注意：CCCP治疗总共2小时。然而，在CCCP治疗的最后30分钟内用荧光探针标记线粒体。 - 1.5小时后，从培养箱中取出板并将荧光探针添加到成像培养皿中。将板返回到5%CO2 和37°C培养箱中30分钟（图1A）。
- TMRE 实验：加入 2 μL 25 μM MitoTracker（终浓度：25 nM）和 2 μL 10 μM TMRE（最终浓度：10 nM）。
- MitoSOX 实验：加入 2 μL 25 μM MitoTracker（终浓度：25 nM）和 1 μL 5 mM MitoSOX（最终浓度：2.5 μM）。
- 在2小时CCCP处理后，准备HeLa细胞进行成像（图1A，B）。
- TMRE实验：HeLa细胞立即准备好成像;确保TMRE保留在HeLa细胞培养基中。
- MitoSOX 实验：用 2 mL 预热的 HeLa 培养基洗涤细胞 3 倍，以去除游离的 MitoSOX 染料。加入 2 mL 预热培养基。HeLa细胞现在已准备好成像。
注意：用新鲜的预热HeLa培养基洗涤HeLa细胞，该培养基含有与实验条件相同的DMSO或CCCP浓度;不包括 MitoSOX 或 MitoTracker。
3. 共聚焦显微镜图像采集设置
注意：使用配备63x/1.40数值孔径（NA）油浸物镜和环境室（见材料表）的共聚焦显微镜（见材料表）对HeLa细胞进行成像。
- 在成像前1小时，通过打开罐阀打开CO2。按开按钮打开显微镜的环境控制器。使用触摸板上的向上和向下箭头将温度调节到 37 °C，将 CO 2 调节到 5%。完成后按设置。
注意：确保环境室的门已关闭，并等待条件稳定下来。 - 激光设置
- 打开 白光激光器 （WLL）并将 激光 功率设置为 85%， 将 激发控制 设置为 最大功率。单击“ 获取 ”选项卡，选择 “添加激光器”，然后在出现的对话框中，将 WLL 切换为 “开”。单击 激光功率 按钮并输入 85%。单击 励磁控制 按钮，然后从下拉菜单中选择 最大功率 （图2A）。
- TMRE实验： 设置YFP，MitoTracker和TMRE的激发和发射光谱。
- 对于YFP，将激发激光设置为514 nm，将发射光谱窗口设置为524-545 nm。 在“获取”选项卡中，单击“添加新设置”按钮;然后，单击添加激光并将其拖到设置 1 中。双击激发线并在对话框中输入 514 作为波长。双击相应的检测器，输入 524 作为起始波长，输入 545 作为结束波长。
- 对于MitoTracker深红，将激发激光设置为641，将发射光谱窗口设置为650-750 nm。在“获取”选项卡中，单击“添加激光”按钮并将其拖到“设置1”中。双击激发线并在对话框中输入 641 作为波长。双击相应的检测器，输入 650 作为开始波长，输入 750 作为结束波长。
- 对于TMRE，将激发激光设置为555 nm，将发射光谱窗口设置为557-643 nm。在“获取”选项卡中，单击“添加新设置”按钮;然后，点击 添加激光 按钮并将其拖到设置 2.双击激发线，然后在对话框中输入 555 作为波长。双击相应的检测器，输入 557 作为起始波长，输入 643 作为结束波长。
- MitoSOX 实验： 设置YFP，MitoTracker和MitoSOX的激发和发射光谱（图2B）。
- 对于YFP，将激发激光设置为507 nm，将发射光谱窗口设置为517-540 nm。在“获取”选项卡中，单击“添加新设置”按钮;然后，单击 添加激光 按钮并将其拖到设置 1。双击激发线并在对话框中输入 507 作为波长。双击相应的检测器，输入 517 作为起始波长，输入 540 作为结束波长。
- 对于 MitoSOX，将 激发 激光设置为 547 nm， 将发射 光谱窗口设置为 564-636 nm。在“ 获取 ”选项卡中，单击“ 添加新设置 ”按钮;然后，点击 添加激光 按钮并将其拖到 设置 2.双击 激发线并在对话框中输入 547 作为波长。双击相应的 检测器 ，输入 564 作为起始波长，输入 636 作为结束波长。
- 对于MitoTracker深红，将激发激光设置为641 nm，将发射光谱窗口设置为652-742 nm。 在“获取”选项卡中，单击“添加新设置”按钮;点击 添加激光 按钮并将其拖到设置 3。双击激发线并在对话框中输入 641 作为波长。双击相应的检测器，输入 652 作为起始波长，输入 742 作为结束波长。
- 图像采集设置（图2C）
- 将 格式 设置为 1，024 x 1，024， 将扫描速度 设置为 600 Hz，将 线平均值 设置为 3。
- 选择“ 采集”选项卡，然后单击“ 格式 ”按钮。从下拉菜单中，选择 1，024 x 1，024。单击 速度 按钮，然后从下拉菜单中选择 600 。然后，单击 线平均值 按钮，然后从下拉菜单中选择 3。
- 打开 双向扫描 并将 相位 和 变焦系数 分别设置为 22.61 和 1.50。
- 在“ 采集”选项卡中，将“ 双向 ”按钮切换为 “开”。单击 阶段 X 设置并将其设置为 22.61。单击 缩放系数 设置并将其设置为 1.50。
- 将 格式 设置为 1，024 x 1，024， 将扫描速度 设置为 600 Hz，将 线平均值 设置为 3。
4. 图像采集
注意：实验者必须根据YFP荧光信号做出视觉判断以选择细胞。避免像素过饱和，因为它们会显着影响荧光强度定量。使用指示像素饱和度的过/欠查找表，以避免获取饱和图像。
- 单击感兴趣的 设置 ，然后按快速实时以提供荧光图像的 实时预览。
- 通过双击相应的检测器来调整增益和强度。在出现的对话框中，使用滑块调整增益。要更改强度，请双击激发线并使用弹出窗口中的向上和向下箭头更改强度。单击“停止”结束预览。
- TMRE实验：首先对DMSO控制板进行成像。调整TMRE信号的增益和强度（设置2），使线粒体网络强度略低于饱和度; 保持实验的增益和强度恒定。调整丝线虫追踪器和YFP的增益和强度（设置1），使线粒体网络可见但暗淡。
- MitoSOX 实验：首先对 DMSO 控制板进行成像。调整 MitoSOX（设置 2）信号的增益和强度，使荧光可见但暗淡;保持实验的增益和强度恒定。调整YFP（设置1）和MitoTracker（设置3）的增益和强度，使线粒体网络可见但暗淡。
注意：记录TMRE和MitoSOX的增益和强度，因为这些值在整个实验过程中必须保持不变。YFP和MitoTracker的荧光信号在该协议中未量化。因此，可以针对每个图像调整增益和强度。最有效的是具有增益和强度设置，其中细胞 易于看到但仍很暗，以确保细胞不会暴露在导致细胞损伤或光漂白的过度激光强度下。
- 增益和强度设置完成后，单击 “开始 ”以获取图像。每个实验条件获取 20 个细胞的图像（例如，五个图像，每个图像四个细胞; 图 2D）。
5. 使用 ImageJ 进行荧光强度定量
注意：图像文件保存为“.lif”，并与 ImageJ29 兼容。与 ImageJ 兼容的文件类型在其网站上指定。如果文件类型不兼容，则可能需要转换文件类型。
- 创建并保存感兴趣区域 （ROI）。
- 在 ImageJ 中，单击“ 文件”|”新品 |图像。 在弹出的对话框中，单击“ 确定”。
- 单击矩形工具按钮并绘制一个 6 微米 x 6 微米的框。通过单击“分析”|”工具 |ROI 管理器，然后等待出现带有 ROI 管理器的对话框（图 3A）。通过单击管理器对话框中的添加将矩形 ROI 添加到管理器。通过选择“更多”来保存投资回报率，然后单击“保存”按钮和“确定”。
- 测量荧光强度。
- 在图像 J 中，单击 文件 并选择 打开。在对话框中，选择实验的映像文件，然后单击“ 打开”。
- 等待 “生物格式导入选项” 窗口出现（图3B）。选择 拆分通道 ，然后单击 打开。
注意：拆分通道功能允许将图像中的每个通道作为单独的窗口打开。通道顺序对应于获取顺序。- TMRE 实验： YFP （设置 1）是第一个通道 （c = 0）; MitoTracker （设置 1）是第二个通道 （c = 1）;TMRE（设置 2）是第三个通道 （c = 2）。
- MitoSOX 实验： YFP （设置 1）是第一个通道 （c = 0）; MitoSOX （设置 2）是第二个通道 （c = 1）; MitoTracker （设置3）是第三个通道（c = 2）。
- 通过选择 “图像 |调整 |亮度 （图3C）。
注：请勿按“ 设置”或 “应用”以确保图像亮度不会永久更改。有时，荧光强度在TMRE或MitoSOX通道中不可见。调整亮度以简化可视化。改变亮度不会影响原始荧光强度值。 - 单击 分析 ，然后选择 设置测量。选中 面积 和 平均灰度值 框，然后单击 确定 （图 3D）。
注意：平均灰度值是荧光强度。 - 打开 ROI 管理器 ，然后通过单击 “分析”|”工具 |投资回报率经理。在 ROI 管理器中，单击 更多， 然后从显示的列表中单击 打开，然后选择保存的 ROI。
- 通过从ROI管理器中选择保存的ROI来测量单个细胞中五个随机区域的荧光强度，并将ROI移动到细胞内的随机位置（图3E）。按 M测量荧光强度。对另外四个不重叠区域重复此步骤。当出现包含面积和平均灰度值的对话框（图 3F）时，将这些值复制并粘贴到电子表格中进行分析。
- TMRE 实验：选择图像（c = 2）。
- MitoSOX 实验：选择图像 （c = 2）。
- 获得平均荧光强度值。使用电子表格软件（参见 材料表），平均五个平均灰度值。对每个单元格重复此过程。
- 使用统计软件程序分析和比较实验条件下的TMRE或MitoSOX平均灰度值（参见 材料表;图 4 和 图 5）。将数据显示为条形图或小提琴图。
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Representative Results
在该协议中，基于荧光的定量用于测量CCCP处理后线粒体网络的膜电位和超氧化物水平（图1）。该工作流程使用了HeLa细胞，这是一种源自宫颈癌的永生化细胞系。HeLa细胞通常用于研究线粒体生物学，并且相对平坦，因此很容易使用显微镜可视化线粒体网络。为了研究Parkin在维持线粒体网络健康中的作用，用空对照载体ParkinWT或ParkinT240R （一种破坏线粒体自噬的突变体）瞬时转染HeLa细胞21。将HeLa细胞接种在35mm玻璃底成像培养皿中，并在达到~50%-60%汇合度后转染（图1A）。由于HeLa细胞快速分裂，这通常是将细胞接种到成像培养皿中的第二天。第二天使用光学显微镜观察YFP荧光信号，以评估转染效率。实验仅在成功转染后进行。
检查后，用轻度（5μM）或重度（20μM）浓度的CCCP处理HeLa细胞以使线粒体网络去极化（步骤1.2显示了制备CCCP和荧光探针的详细说明）。CCCP处理共进行2小时。在CCCP处理的最后30分钟内，线粒体用MitoTracker和TMRE / MitoSOX标记（图1A）。需要注意的是，TMRE和MitoSOX具有重叠的荧光光谱，不能同时使用。相反，我们为TMRE和MitoSOX实验使用了单独的成像皿。对于TMRE实验，HeLa细胞在2小时CCCP处理结束时立即准备好成像。TMRE浓度必须保持恒定;因此，TMRE留在了HeLa媒体中。但是，在成像之前必须删除游离的 MitoSOX。对于MitoSOX实验，用HeLa培养基洗涤细胞三次以去除游离染料。对于此步骤，必须使用含有与实验条件相同的DMSO或CCCP浓度的HeLa培养基。Hoechst 33342是一种细胞核标记物，最初用于评估瞬时转染和CCCP处理后的HeLa细胞（图1B）。
随后，进行共聚焦显微镜以可视化TMRE和MitoSOX荧光强度，以分别测量线粒体膜电位和超氧化物水平。图像是使用63倍（1.4 NA）油浸物镜采集的，该物镜具有双向扫描参数，空间分辨率为1，024 x 1，024像素，扫描速度为600 Hz，线平均为3，相位为22.61，变焦系数为1.5（图2C）。首先对所有实验的DMSO控制板进行成像，以设置TMRE和MitoSOX的增益和强度值。为了进行跨条件的定量比较，必须在DMSO条件下设置这些值，并在整个实验过程中保持不变。CCCP诱导线粒体去极化和膜电位丧失，导致TMRE荧光强度降低。因此，对照实验的TMRE强度最高，增益和强度值设置接近饱和。相反，较高的超氧化物水平会增加MitoSOX强度。因此，对照组的MitoSOX荧光强度最低，并且在存在暗信号的地方，增益和强度值设置得很低。由于MitoTracker，TMRE和MitoSOX是重要的染料并标记所有细胞，因此在选择要成像的细胞时不应使用它们。相反，根据YFP信号选择细胞以确保它们被转染。获取单平面图像，重点是HeLa细胞的底部，那里有大量线粒体。
TMRE 和 MitoSOX 荧光强度的定量
使用ImageJ分析TMRE和MitoSOX荧光强度的定量（图3）。创建 6 微米 x 6 微米的 ROI 并将其存储在 ROI 管理器中。将ROI放置在每个单元的五个随机非重叠区域中，以测量TMRE或MitoSOX强度。荧光强度对应于ImageJ中的平均灰度值。对每个细胞的五个强度值取平均值，以计算每个细胞的平均荧光强度。绘制并分析这些值，以了解治疗条件下的统计学意义。
TMRE和MitoSOX荧光强度的结果分别如图 4 和 图5所示。正如预期的那样，与对照条件相比，使用已知的解偶联剂CCCP处理降低了TMRE荧光强度（图4A，B）。此外，严格的（20μM）CCCP处理诱导超氧化物产生并增加MitoSOX荧光强度（图5A，B）。在轻度（5 μM）CCCP胁迫条件下，与空YFP对照载体相比，ParkinWT 和ParkinT240R 的表达导致TMRE强度更高。同样，与表达YFP对照载体的细胞相比，表达ParkinWT 和ParkinT240R 的细胞中的MitoSOX强度较低（图5A，B）。这些结果表明，Parkin表达通过保持较高的线粒体膜电位和较低的超氧化物水平来帮助维持线粒体网络的健康。因此，此处概述的方案可用于准确比较荧光强度，以分析Parkin在控制线粒体膜电位和超氧化物形成中的作用。
图 1：实验工作流程。 （A） 用于转染、用 CCCP 处理和标记线粒体网络的实验工作流程示意图，以及 HeLa 细胞中的 TMRE 和 MitoSOX 荧光强度成像。（B）表达空YFP载体（顶部），YFP-ParkinWT（中）和YFP-ParkinT240R（底部;洋红色）的细胞的代表性图像。Hoechst 33342（白色）用于标记DNA。比例尺 = 10 μm。缩写：CCCP = 羰基氰间氯苯基腙;TMRE = 四甲基罗丹明-乙酯-高氯酸盐;YFP = 黄色荧光蛋白。请点击此处查看此图的大图。
图 2：用于设置共聚焦采集设置的用户界面 。 （A） 激光设置对话框。红色矩形突出显示白光激光器、功率状态、激光功率和波长。（B）为MitoSOX实验设置的实验通道。显示了YFP，MitoSOX和MitoTracker的设置，激发线和发射光谱窗口。（C） 采集设置显示格式、速度、双向性、相位 X、变焦系数和线平均值。（四）具有代表性的获得图像。HeLa细胞表达YFP（洋红色），线粒体用MitoSOX（绿色）和MitoTracker（青色）标记。比例尺 = 10 μm。缩写：WLL = 白光激光;YFP = 黄色荧光蛋白。 请点击此处查看此图的大图。
图 3：用于量化 TMRE 和 MitoSOX 荧光强度的 ImageJ 工作流程。 （A） ROI 管理器面板，其中包含 ImageJ 中的 ROI 示例。（B） 生物格式导入选项面板。红色矩形突出显示应选择的 “拆分通道 ”选项。（C） 亮度和对比度设置参数。（四）设置测量参数。红色矩形突出显示应选择的 面积 和 平均灰度值 选项。（E）用MitoSOX标记的HeLa细胞的代表性图像。红色方块表示面板 A 的投资回报率。比例尺 = 10 μm。 （F） 结果面板显示实验区域和 ROI 的平均灰度值。平均灰度值（橙色）表示荧光强度值。缩写：TMRE = 四甲基罗丹明-乙酯-高氯酸盐;ROI = 感兴趣区域。 请点击此处查看此图的大图。
图4：线粒体损伤后的TMRE荧光强度。 （A）用DMSO，5μM CCCP或20μM CCCP处理2小时以诱导线粒体损伤后HeLa细胞的代表性图像。细胞外源性表达空的YFP载体YFP-ParkinWT或YFP-ParkinT240R（洋红色），并用MitoTracker（青色）和TMRE（绿色）标记。比例尺= 30μm。 （B）在DMSO和CCCP处理条件下表达空YFP载体（蓝色），YFP-ParkinWT（橙色）和YFP-ParkinT240R（紫色）的细胞的TMRE荧光强度的定量。p 通过具有多重比较检验的双向方差分析< 0.0001。（中欧）分离来自图B的TMRE荧光强度的定量，以突出显示DMSO（C），5μM CCCP（D）和20μM CCCP（E）的差异。* p < 0.05;< 0.001;p < 0.0001 由 Kruskal-Wallis 方差分析与邓恩多重比较检验。Ns = 不显著。平均±扫描电镜;n = 79-104来自三个独立的生物学重复。缩写：CCCP = 羰基氰间氯苯基腙;TMRE = 四甲基罗丹明-乙酯-高氯酸盐;YFP = 黄色荧光蛋白;DMSO = 二甲基亚砜。请点击此处查看此图的大图。
图 5：线粒体网络受损后的 MitoSOX 荧光强度。 （A）用DMSO，5μM CCCP或20μM CCCP处理2小时的HeLa细胞的代表性图像，以解耦线粒体膜电位。用空的YFP载体YFP-ParkinWT或YFP-ParkinT240R（洋红色）转染细胞，并用MitoTracker（青色）和MitoSOX（绿色）标记。比例尺 = 30 μm。 （B） 用于对照和处理条件的表达空 YFP 载体（蓝色）、YFP-ParkinWT（橙色）和 YFP-ParkinT240R（紫色）的细胞的 MitoSOX 荧光强度的定量。p < 0.0001 通过双向方差分析与邓恩多重比较检验。（中欧）分离来自面板B的MitoSOX荧光强度的定量，以突出显示DMSO（C），5μM CCCP（D）和20μM CCCP（E）的差异。*p < 0.05;p < 0.0001 由 Kruskal-Wallis ANOVA 与 Dunn 多重比较检验。Ns = 不显著。平均±扫描电镜;n = 87-107，来自三个独立的生物学重复。缩写：CCCP = 羰基氰间氯苯基腙;TMRE = 四甲基罗丹明-乙酯-高氯酸盐;YFP = 黄色荧光蛋白;DMSO = 二甲基亚砜。请点击此处查看此图的大图。
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Discussion
此处概述的工作流程可用于使用基于荧光的成像稳定且可重复地量化线粒体膜电位和超氧化物水平30。在设计这些实验时，需要考虑重要的技术限制。用空的YFP载体YFP-ParkinWT或YFP-ParkinT240R转染HeLa细胞。空的YFP载体被用作对照，以确认实验结果是帕金特有的。对于瞬时转染，通过实验确定DNA与转染试剂的质量比为1：3，以产生最高的转染率，其中每个构建体使用2 μg质粒DNA28。保持所有构建体的YFP标签一致很重要，因为荧光蛋白的先天亮度不同31，32。如果必须使用多个荧光蛋白标签，则应选择具有相似亮度和光稳定性的荧光蛋白33。
为了测量线粒体膜电位和超氧化物水平，选择了两种有据可查的染料。TMRE的荧光信号基于线粒体膜电位，而MitoSOX荧光强度是超氧化物水平的函数。对于基于荧光的成像，荧光探针之间不应有光谱重叠。然而，最初的方案是使用mCherry-ParkinWT和mCherry-ParkinT240R进行的，它们与TMRE和MitoSOX的红移光谱重叠。为了避免光谱重叠并最大限度地减少潜在的串扰，选择了YFP标记的Parkin结构。这种调整需要将MitoTracker染料从绿色更改为远红色。此外，优化了HeLa细胞镀层密度;最初，HeLa细胞在每个成像培养皿中接种45，000个细胞，但这导致培养皿过度融合。高细胞汇合度会降低转染效率，促进细胞死亡，改变细胞代谢34，35，36。为了避免这些潜在的影响，细胞以每个成像皿30，000个细胞的密度接种。
该协议的主要限制是可能存在用户偏差，特别是在选择细胞和ROI位置时。该协议使用TMRE和MitoSOX荧光强度的变化作为膜电位和超氧化物水平的功能读数。因此，使用这些探针的细胞选择可能会使实验结果产生偏差。为了对抗这种偏见，我们选择了仅基于YFP表达的细胞。在细胞内的线粒体网络中随机选择不重叠的ROI。虽然这种方法以前用于测量荧光强度27，但可以采取额外的减少偏差的措施。首先，可以使用ImageJ中的盲分析工具对研究进行 盲法分析 ，以防止支持预期结果的ROI选择。其次，可以使用先进的图像分析软件测量荧光强度，无需ROI。
虽然该协议使用共聚焦显微镜进行基于荧光的定量，但其他方法（例如流式细胞术）可用于量化TMRE和MitoSOX37中的荧光变化。在这里，我们使用共聚焦显微镜而不是流式细胞术来可视化线粒体网络形态。概述的方案可以很容易地适应于使用流式细胞术测量TMRE和MitoSOX荧光，产生类似的实验结果。此外，氧消耗率（OCR）测定可用于检测线粒体电子传递链功能的变化，而无需阳离子染料。虽然OCR提供了线粒体功能障碍的灵敏测量，但它并不特定于膜电位或超氧化物浓度，而是提供线粒体功能的整体测量38。这些测定可以与TMRE和MitoSOX实验一起进行，以评估线粒体健康39。
尽管该协议特别关注线粒体解偶联剂CCCP40的作用，但可以使用具有替代机制的破坏性试剂。例如，抗霉素A和寡霉素A是电子传递链抑制剂，通常用于通过活性氧（ROS）产生诱导线粒体损伤38。虽然我们专门使用MitoSOX测量线粒体超氧化物水平，但可以使用CellROX测量细胞内ROS。在HeLa细胞中，由于内源性表达低，有必要过表达Parkin。未来的研究可以使用表达内源性帕金41的细胞培养系统观察帕金表达对线粒体网络健康的影响。由于线粒体是能量代谢和细胞稳态的关键调节因子，线粒体功能障碍与许多疾病有关，包括糖尿病42，阿尔茨海默病43，44，45，癌症46和肝病47。因此，该工作流程可以适用于研究相关细胞系和原代培养物中的线粒体健康和失调。
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Disclosures
作者没有竞争利益要声明。
Acknowledgments
我们感谢埃文斯实验室的成员对这份手稿的深思熟虑的反馈。这项工作得到了杜克怀特黑德学者，杜克科学和技术学者和霍华德休斯医学研究所（HHMI）汉娜格雷奖学金的支持。 图1A 是使用 BioRender.com 制作的。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals, Peptides, and Recombinant Proteins | |||
| CCCP (carbonyl cyanide m-chlorophenyl hydrazone) | Sigma-Aldrich | C2759 | |
| DMEM (1x) with 4.5 g/L glucose | Gibco | 11-965-084 | |
| DMSO, Anhydrous | ThermoFisher Scientific | D12345 | |
| Fetal Bovine Serum | Hyclone | SH3007103 | |
| FuGENE 6 (Tranfection Reagent) | Promega | E2691 | |
| GlutaMAX 100x (L-Glutamine Solution) | Gibco | 35-050-061 | |
| Hoescht 33342 | ThermoFisher Scientific | 62249 | |
| MitoSOX Red | ThermoFisher Scientific | M36008 | |
| MitoTracker Deep Red | ThermoFisher Scientific | M7514 | |
| Opti-MEM (Redued Serum media) | ThermoFisher scientific | 31985070 | |
| Tetramethylrhodamine, Ethyl Ester, Perchlorate (TMRE) | ThermoFisher Scientific | T669 | |
| Experimental models: Organisms/Strains | |||
| HeLa-M (Homo sapiens) | A. Peden (Cambridge Institute for Medical Research) | N/A | |
| Recombinant DNA | |||
| EYFP Empty Vector | N/A | N/A | |
| YFP-Parkin T240R | This Paper | Generated by site-directed mutagenesis from YFP-Parkin | |
| YFP-Parkin WT | Addgene; PMID:19029340 | RRID:Addgene_23955 | |
| Software and Algorithms | |||
| Adobe Illustrator | Adobe Inc. | https://www.adobe.com/products/illustrator | (Schindelin, 2012) |
| Excel (Spreadsheet Software) | Microsoft Office | https://www.microsoft.com/en-us/microsoft-365/excel | |
| ImageJ | https://imagej.net/software/fiji/ | ||
| Leica Application Suite (LAS X) | Leica | https://www.leica-microsystems.com/products/microscope-software/p/leica-las-x-ls/ | |
| Microsoft Excel | Microsoft Office | https://www.microsoft.com/excel | |
| Prism9 (Statistical Analysis Software) | GraphPad Software | https://www.graphpad.com | |
| Other | |||
| 35 mm Dish, No. 1.5 Coverslip, 20 mm Glass Diameter, Uncoated | MatTek | P35G-1.5-20-C | |
| Cage Incubator (Environmental Chamber) | Okolab | https://www.oko-lab.com/cage-incubator | |
| DMiL Inverted Microscope | Leica | N/A | |
| LIGHTNING Deconvolution Software | Leica | N/A | |
| STELLARIS 8 confocal microscope | Leica | N/A |
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