Quantification basée sur la fluorescence du potentiel de membrane mitochondriale et des niveaux de superoxyde à l’aide de l’imagerie en direct dans les cellules HeLa
Summary
Cette technique décrit un flux de travail efficace pour visualiser et mesurer quantitativement le potentiel de la membrane mitochondriale et les niveaux de superoxyde dans les cellules HeLa à l’aide de l’imagerie en direct basée sur la fluorescence.
Abstract
Les mitochondries sont des organites dynamiques essentiels à l’homéostasie métabolique en contrôlant la production d’énergie via la synthèse de l’ATP. Pour soutenir le métabolisme cellulaire, divers mécanismes de contrôle de la qualité mitochondriale coopèrent pour maintenir un réseau mitochondrial sain. L’une de ces voies est la mitophagie, où la kinase 1 induite par PTEN (PINK1) et la phospho-ubiquitination Parkin des mitochondries endommagées facilitent la séquestration des autophagosomes et leur élimination ultérieure de la cellule par fusion des lysosomes. La mitophagie est importante pour l’homéostasie cellulaire, et les mutations de Parkin sont liées à la maladie de Parkinson (MP). En raison de ces résultats, l’accent a été mis sur l’étude des dommages mitochondriaux et du renouvellement pour comprendre les mécanismes moléculaires et la dynamique du contrôle de la qualité mitochondriale. Ici, l’imagerie de cellules vivantes a été utilisée pour visualiser le réseau mitochondrial des cellules HeLa, pour quantifier le potentiel de la membrane mitochondriale et les niveaux de superoxyde après un traitement au cyanure de carbonyle m-chlorophénylhydrazone (CCCP), un agent de découplage mitochondrial. De plus, une mutation liée à la MP de Parkin (ParkinT240R) qui inhibe la mitophagie parkine-dépendante a été exprimée pour déterminer comment l’expression mutante affecte le réseau mitochondrial par rapport aux cellules exprimant la parkine de type sauvage. Le protocole décrit ici décrit un flux de travail simple utilisant des approches basées sur la fluorescence pour quantifier efficacement le potentiel de la membrane mitochondriale et les niveaux de superoxyde.
Introduction
Le réseau mitochondrial est une série d’organites interconnectés qui jouent un rôle crucial dans la production d’énergie1, l’immunité innée 2,3 et la signalisation cellulaire 4,5. La dysrégulation mitochondriale a été associée à des maladies neurodégénératives telles que la maladie de Parkinson (MP)6,7. La MP est une maladie neurodégénérative progressive affectant les neurones dopaminergiques de la substance noire qui touche près de 10 millions de personnes dans le monde8. La MP a été génétiquement liée à la mitophagie, une voie de contrôle de la qualité mitochondriale nécessaire au maintien de l’homéostasie cellulaire qui élimine sélectivement les mitochondries endommagées 9,10. Des études ont identifié plusieurs voies de mitophagie indépendantes, y compris le domaine FUN14 contenant la mitophagie médiée par 1 (FUNDC1), la mitophagie facilitée par la protéine 3 interagissant Bcl-2 (BNIP3), la mitophagie dépendante de NIX et la mitophagie bien caractérisée induite par PTEN 1 (PINK1)/Parkin-regulated10,11. PINK1 (une kinase putative) et Parkin (une ubiquitine ligase E3) travaillent en tandem pour phospho-ubiquitinate des mitochondries endommagées, ce qui entraîne la formation d’autophagosomes qui engloutissent l’organite endommagé et fusionnent avec les lysosomes pour initier la dégradation 12,13,14,15,16. Des mutations dans Parkin ont été associées à des phénotypes liés à la MP tels que la neurodégénérescence via la perte de neurones dopaminergiques17,18.
Ici, un protocole est décrit dans lequel les cellules HeLa, des cellules immortalisées couramment utilisées dérivées du cancer du col de l’utérus, sont utilisées pour étudier le rôle de Parkin dans le maintien de la santé du réseau mitochondrial. Les cellules HeLa expriment des niveaux négligeables de Parkin endogène et nécessitent donc une expression exogène de Parkin19. Pour étudier le rôle de Parkin dans la santé du réseau mitochondrial, les cellules HeLa sont transfectées avec soit de la Parkin de type sauvage (ParkinWT), soit un mutant Parkin (ParkinT240R) ou un vecteur témoin vide. ParkinT240R est une mutation autosomique récessive du parkinsonisme juvénile qui affecte l’activité de la parkin E3 ligase, réduisant considérablement l’efficacité de la voie de mitophagie20. Les cellules HeLa sont sujettes à des concentrations légères (5 μM) ou sévères (20 μM) de cyanure de carbonyle m-chlorophénylhydrazone (CCCP), un agent de découplage mitochondrial. Le traitement avec des concentrations sévères de CCCP est couramment utilisé pour induire la mitophagie médiée par Parkin dans diverses lignées cellulaires, telles que les cellules HeLa et COS-721,22,23.
Après le traitement, le protocole utilise l’imagerie en direct du réseau mitochondrial à l’aide de deux colorants fluorescents ciblant les mitochondries actuellement disponibles. La tétraméthylrhodamine, ester éthylique, perchlorate (TMRE) est un colorant cationique qui devient fluorescent en fonction du potentiel membranaire mitochondrial24, tandis que MitoSOX est un indicateur de superoxyde mitochondrial où l’intensité de fluorescence est fonction de la concentration de superoxyde25. Enfin, le protocole décrit utilise une quantification basée sur la fluorescence et un flux de travail simple pour quantifier efficacement le potentiel de la membrane mitochondriale et les niveaux de superoxyde avec une marge minimale de biais pour l’utilisateur. Bien que ce protocole ait été conçu pour étudier la fonction mitochondriale dans les cellules HeLa, il peut être adapté à d’autres lignées cellulaires et types de cellules primaires pour caractériser quantitativement la santé du réseau mitochondrial.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le flux de travail décrit ici peut être utilisé pour quantifier le potentiel de la membrane mitochondriale et les niveaux de superoxyde de manière robuste et reproductible à l’aide de l’imagerie basée sur la fluorescence30. Il y a d’importantes limites techniques à prendre en compte lors de la conception de ces expériences. Les cellules HeLa ont été transfectées avec un vecteur YFP vide, YFP-ParkinWT ou YFP-ParkinT240R. Le vecteur YFP vide a été utilisé co…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions les membres du laboratoire Evans pour leurs commentaires réfléchis sur ce manuscrit. Ce travail est soutenu par Duke Whitehead Scholars, Duke Science and Technology Scholars et Howard Hughes Medical Institute (HHMI) Hanna Gray Fellowship. La figure 1A a été réalisée à l’aide de BioRender.com.
Materials
| Chemicals, Peptides, and Recombinant Proteins | |||
| CCCP (carbonyl cyanide m-chlorophenyl hydrazone) | Sigma-Aldrich | C2759 | |
| DMEM (1x) with 4.5 g/L glucose | Gibco | 11-965-084 | |
| DMSO, Anhydrous | ThermoFisher Scientific | D12345 | |
| Fetal Bovine Serum | Hyclone | SH3007103 | |
| FuGENE 6 (Tranfection Reagent) | Promega | E2691 | |
| GlutaMAX 100x (L-Glutamine Solution) | Gibco | 35-050-061 | |
| Hoescht 33342 | ThermoFisher Scientific | 62249 | |
| MitoSOX Red | ThermoFisher Scientific | M36008 | |
| MitoTracker Deep Red | ThermoFisher Scientific | M7514 | |
| Opti-MEM (Redued Serum media) | ThermoFisher scientific | 31985070 | |
| Tetramethylrhodamine, Ethyl Ester, Perchlorate (TMRE) | ThermoFisher Scientific | T669 | |
| Experimental models: Organisms/Strains | |||
| HeLa-M (Homo sapiens) | A. Peden (Cambridge Institute for Medical Research) | N/A | |
| Recombinant DNA | |||
| EYFP Empty Vector | N/A | N/A | |
| YFP-Parkin T240R | This Paper | Generated by site-directed mutagenesis from YFP-Parkin | |
| YFP-Parkin WT | Addgene; PMID:19029340 | RRID:Addgene_23955 | |
| Software and Algorithms | |||
| Adobe Illustrator | Adobe Inc. | https://www.adobe.com/products/illustrator | (Schindelin, 2012) |
| Excel (Spreadsheet Software) | Microsoft Office | https://www.microsoft.com/en-us/microsoft-365/excel | |
| ImageJ | https://imagej.net/software/fiji/ | ||
| Leica Application Suite (LAS X) | Leica | https://www.leica-microsystems.com/products/microscope-software/p/leica-las-x-ls/ | |
| Microsoft Excel | Microsoft Office | https://www.microsoft.com/excel | |
| Prism9 (Statistical Analysis Software) | GraphPad Software | https://www.graphpad.com | |
| Other | |||
| 35 mm Dish, No. 1.5 Coverslip, 20 mm Glass Diameter, Uncoated | MatTek | P35G-1.5-20-C | |
| Cage Incubator (Environmental Chamber) | Okolab | https://www.oko-lab.com/cage-incubator | |
| DMiL Inverted Microscope | Leica | N/A | |
| LIGHTNING Deconvolution Software | Leica | N/A | |
| STELLARIS 8 confocal microscope | Leica | N/A |
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