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Biology

Quantification basée sur la fluorescence du potentiel de membrane mitochondriale et des niveaux de superoxyde à l’aide de l’imagerie en direct dans les cellules HeLa

Published: May 12, 2023 doi: 10.3791/65304
Automatic Translation
1, 1
1Department of Cell Biology, Duke University Medical Center

Summary

Cette technique décrit un flux de travail efficace pour visualiser et mesurer quantitativement le potentiel de la membrane mitochondriale et les niveaux de superoxyde dans les cellules HeLa à l’aide de l’imagerie en direct basée sur la fluorescence.

Abstract

Les mitochondries sont des organites dynamiques essentiels à l’homéostasie métabolique en contrôlant la production d’énergie via la synthèse de l’ATP. Pour soutenir le métabolisme cellulaire, divers mécanismes de contrôle de la qualité mitochondriale coopèrent pour maintenir un réseau mitochondrial sain. L’une de ces voies est la mitophagie, où la kinase 1 induite par PTEN (PINK1) et la phospho-ubiquitination Parkin des mitochondries endommagées facilitent la séquestration des autophagosomes et leur élimination ultérieure de la cellule par fusion des lysosomes. La mitophagie est importante pour l’homéostasie cellulaire, et les mutations de Parkin sont liées à la maladie de Parkinson (MP). En raison de ces résultats, l’accent a été mis sur l’étude des dommages mitochondriaux et du renouvellement pour comprendre les mécanismes moléculaires et la dynamique du contrôle de la qualité mitochondriale. Ici, l’imagerie de cellules vivantes a été utilisée pour visualiser le réseau mitochondrial des cellules HeLa, pour quantifier le potentiel de la membrane mitochondriale et les niveaux de superoxyde après un traitement au cyanure de carbonyle m-chlorophénylhydrazone (CCCP), un agent de découplage mitochondrial. De plus, une mutation liée à la MP de Parkin (ParkinT240R) qui inhibe la mitophagie parkine-dépendante a été exprimée pour déterminer comment l’expression mutante affecte le réseau mitochondrial par rapport aux cellules exprimant la parkine de type sauvage. Le protocole décrit ici décrit un flux de travail simple utilisant des approches basées sur la fluorescence pour quantifier efficacement le potentiel de la membrane mitochondriale et les niveaux de superoxyde.

Introduction

Le réseau mitochondrial est une série d’organites interconnectés qui jouent un rôle crucial dans la production d’énergie1, l’immunité innée 2,3 et la signalisation cellulaire 4,5. La dysrégulation mitochondriale a été associée à des maladies neurodégénératives telles que la maladie de Parkinson (MP)6,7. La MP est une maladie neurodégénérative progressive affectant les neurones dopaminergiques de la substance noire qui touche près de 10 millions de personnes dans le monde8. La MP a été génétiquement liée à la mitophagie, une voie de contrôle de la qualité mitochondriale nécessaire au maintien de l’homéostasie cellulaire qui élimine sélectivement les mitochondries endommagées 9,10. Des études ont identifié plusieurs voies de mitophagie indépendantes, y compris le domaine FUN14 contenant la mitophagie médiée par 1 (FUNDC1), la mitophagie facilitée par la protéine 3 interagissant Bcl-2 (BNIP3), la mitophagie dépendante de NIX et la mitophagie bien caractérisée induite par PTEN 1 (PINK1)/Parkin-regulated10,11. PINK1 (une kinase putative) et Parkin (une ubiquitine ligase E3) travaillent en tandem pour phospho-ubiquitinate des mitochondries endommagées, ce qui entraîne la formation d’autophagosomes qui engloutissent l’organite endommagé et fusionnent avec les lysosomes pour initier la dégradation 12,13,14,15,16. Des mutations dans Parkin ont été associées à des phénotypes liés à la MP tels que la neurodégénérescence via la perte de neurones dopaminergiques17,18.

Ici, un protocole est décrit dans lequel les cellules HeLa, des cellules immortalisées couramment utilisées dérivées du cancer du col de l’utérus, sont utilisées pour étudier le rôle de Parkin dans le maintien de la santé du réseau mitochondrial. Les cellules HeLa expriment des niveaux négligeables de Parkin endogène et nécessitent donc une expression exogène de Parkin19. Pour étudier le rôle de Parkin dans la santé du réseau mitochondrial, les cellules HeLa sont transfectées avec soit de la Parkin de type sauvage (ParkinWT), soit un mutant Parkin (ParkinT240R) ou un vecteur témoin vide. ParkinT240R est une mutation autosomique récessive du parkinsonisme juvénile qui affecte l’activité de la parkin E3 ligase, réduisant considérablement l’efficacité de la voie de mitophagie20. Les cellules HeLa sont sujettes à des concentrations légères (5 μM) ou sévères (20 μM) de cyanure de carbonyle m-chlorophénylhydrazone (CCCP), un agent de découplage mitochondrial. Le traitement avec des concentrations sévères de CCCP est couramment utilisé pour induire la mitophagie médiée par Parkin dans diverses lignées cellulaires, telles que les cellules HeLa et COS-721,22,23.

Après le traitement, le protocole utilise l’imagerie en direct du réseau mitochondrial à l’aide de deux colorants fluorescents ciblant les mitochondries actuellement disponibles. La tétraméthylrhodamine, ester éthylique, perchlorate (TMRE) est un colorant cationique qui devient fluorescent en fonction du potentiel membranaire mitochondrial24, tandis que MitoSOX est un indicateur de superoxyde mitochondrial où l’intensité de fluorescence est fonction de la concentration de superoxyde25. Enfin, le protocole décrit utilise une quantification basée sur la fluorescence et un flux de travail simple pour quantifier efficacement le potentiel de la membrane mitochondriale et les niveaux de superoxyde avec une marge minimale de biais pour l’utilisateur. Bien que ce protocole ait été conçu pour étudier la fonction mitochondriale dans les cellules HeLa, il peut être adapté à d’autres lignées cellulaires et types de cellules primaires pour caractériser quantitativement la santé du réseau mitochondrial.

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Protocol

1. Préparation des échantillons biologiques

REMARQUE: Effectuez les étapes suivantes en utilisant une technique stérile dans une enceinte de biosécurité. Pulvérisez la surface de l’armoire et tous les matériaux avec de l’éthanol à 70%.

  1. Culture et transfection de cellules HeLa
    1. Culture de 30 000 cellules HeLa dans le milieu aigle modifié (DMEM) de Dulbecco contenant 4,5 g/L de glucose additionné de 10 % de sérum fœtal bovin et de 1 % de solution de L-glutamine (milieu HeLa; voir le tableau des matières). Plaquer les cellules sur des antennes paraboliques d’imagerie à fond de verre de 35 mm (voirT able des matériaux) contenant 2 mL de milieu HeLa préchauffé. Maintenir les cultures HeLa à 5 % de CO2 et à 37 °C26,27.
    2. Le lendemain du placage, inspectez les antennes d’imagerie de 35 mm à l’aide d’un microscope optique pour vous assurer que les cellules sont ~50%-60% confluentes. Une fois confluentes, transfecter les cellules HeLa avec le vecteur vide de la protéine fluorescente jaune (YFP), YFP-ParkinWT ou YFP-ParkinT240R (Figure 1A).
    3. Préparer deux mélanges séparés dans des tubes à microcentrifugation stériles pour chaque transfection. Mélanger en tapotant le tube ou en pipetant doucement de haut en bas.
      1. Dans le tube 1, mélanger 200 μL de milieu sérique réduit (voir le tableau des matériaux) avec 2 μg d’ADN plasmidique.
      2. Dans le tube 2, mélanger 200 μL de milieu sérique réduit avec 6 μL de réactif de transfection (voir le tableau des matières)28.
    4. Incuber les tubes pendant 5 min à température ambiante (RT). Ajouter le tube 2 au tube 1, mélanger en pipetant de haut en bas et incuber pendant 20 min à TA.
    5. Ajoutez les complexes de transfection goutte à goutte aux antennes d’imagerie existantes contenant les cultures cellulaires HeLa, assurant une répartition égale sur l’ensemble de la boîte. Placez les antennes d’imagerie dans l’incubateur à 5 % de CO2 et 37 °C pendant la nuit.
      NOTE: Étiqueter chaque plat avec le plasmide transfecté approprié. Pour chaque expérience, étiquetez les trois boîtes YFP-ParkinWT (diméthylsulfoxyde [DMSO; voir le tableau des matériaux], 5 μM CCCP et 20 μM CCCP). Répétez l’étiquetage avec les trois boîtes YFP-ParkinT240R et les trois boîtes vectorielles YFP vides.
  2. Préparation du CCCP et des colorants fluorescents
    ATTENTION : Les colorants fluorescents sont souvent sensibles à la lumière. Conservez les colorants dans l’obscurité à l’aide de papier d’aluminium ou de tubes centrifugés bruns pour réduire l’exposition à la lumière.
    1. Faire un stock de travail de 5 mM de PCCC (voir le tableau des matières) en dissolvant 5 mg de PCCC dans 4,89 mL de DMSO. Faire un stock de travail de 20 mM de CCCP en dissolvant 5 mg de CCCP dans 1,22 mL de DMSO.
    2. Diluer 10 μL d’une solution mère MitoTracker Deep Red (voir Tableau des matériaux) de 1 mM dans 390 μL de DMSO pour obtenir un stock de travail de 25 μM.
    3. Dissoudre 50 μg de MitoSOX Red25 (voir le tableau des matériaux) dans 13 μL de DMSO pour créer un stock de travail de 5 mM.
    4. Dissoudre 10 mg de TMRE24 (voir le tableau des matières) dans 19,4 mL de DMSO pour obtenir une solution mère de 1 mM. Diluer l’EMRT en ajoutant 10 μL de TMRE 1 mM dans 990 μL de DMSO pour obtenir un stock de travail de 10 μM.

2. Traitement CCCP et marquage mitochondrial avec des sondes fluorescentes dans les cellules HeLa

ATTENTION : Effectuez rapidement les étapes suivantes pour vous assurer que les cellules HeLa ne sont pas hors de l’incubateur pendant une période prolongée.

  1. Le lendemain de la transfection, ajouter 2 μL de 5 ou 20 mM CCCP (concentration finale : 5 μM et 20 μM, respectivement) à chaque plaque expérimentale. Pour les plaques de contrôle, ajoutez 2 μL de DMSO. Remettre les plaques dans l’incubateur à 5 % de CO2 et 37 °C pendant 1,5 h (figure 1A).
    NOTE: Le traitement CCCP est pour un total de 2 h. Cependant, les mitochondries sont marquées avec des sondes fluorescentes pendant les 30 dernières minutes du traitement CCCP.
  2. Après 1,5 h, retirez les plaques de l’incubateur et ajoutez des sondes fluorescentes aux antennes d’imagerie. Remettre les plaques dans l’incubateur à 5 % de CO2 et 37 °C pendant 30 min (Figure 1A).
    1. Expérience TMRE : Ajouter 2 μL de MitoTracker 25 μM (concentration finale : 25 nM) et 2 μL de TMRE 10 μM (concentration finale : 10 nM).
    2. Expérience MitoSOX : Ajouter 2 μL de MitoTracker 25 μM (concentration finale : 25 nM) et 1 μL de MitoSOX 5 mM (concentration finale : 2,5 μM).
  3. Après le traitement CCCP de 2 h, préparer les cellules HeLa pour l’imagerie (Figure 1A,B).
    1. Expérience TMRE : les cellules HeLa sont immédiatement prêtes à être imagées ; s’assurer que l’ERMC reste dans le milieu de culture cellulaire HeLa.
    2. Expérience MitoSOX : Lavez les cellules 3x avec 2 mL de milieu HeLa préchauffé pour éliminer le colorant MitoSOX libre. Ajouter 2 mL de média préchauffé. Les cellules HeLa sont maintenant prêtes à être imagées.
      REMARQUE : Laver les cellules HeLa avec un milieu HeLa frais préchauffé qui contient la même concentration de DMSO ou de PCCC que la condition expérimentale; n’incluent pas MitoSOX ou MitoTracker.

3. Configuration d’acquisition d’images de microscope confocal

REMARQUE : Imagez les cellules HeLa à l’aide d’un microscope confocal (voir le tableau des matériaux) équipé d’un objectif d’immersion dans l’huile à ouverture numérique (NA) 63x/1,40 et d’une chambre environnementale (voir le tableau des matériaux).

  1. A 1 h avant l’imagerie, allumez le CO2 en ouvrant la vanne du réservoir. Appuyez sur le bouton On pour activer le contrôleur environnemental du microscope. Utilisez les flèches haut et bas sur le pavé tactile pour régler la température à 37 °C et le CO2 à 5%. Appuyez sur Définir lorsque vous avez terminé.
    REMARQUE : Assurez-vous que les portes de la chambre environnementale sont fermées et attendez que les conditions se stabilisent.
  2. Réglages laser
    1. Allumez le laser à lumière blanche (WLL) et réglez la puissance laser sur 85% et le contrôle d’excitation sur la puissance maximale. Cliquez sur l’onglet Acquérir , sélectionnez Ajouter un laser et, dans la boîte de dialogue qui s’affiche, basculez le WLL sur Activé. Cliquez sur le bouton Laser Power (Alimentation laser ) et entrez 85 %. Cliquez sur le bouton Excitation Control (Contrôle de l’excitation) et sélectionnez Maximum Power (Puissance maximale ) dans le menu déroulant (Figure 2A).
    2. Expérience TMRE : Définissez les spectres d’excitation et d’émission pour YFP, MitoTracker et TMRE.
      1. Pour YFP, réglez le laser d’excitation sur 514 nm et la fenêtre des spectres d’émission sur 524-545 nm. Dans l’onglet Acquérir, cliquez sur le bouton Ajouter un nouveau paramètre ; puis, cliquez sur Ajouter un laser et faites-le glisser dans le paramètre 1. Double-cliquez sur la ligne d’excitation et entrez 514 comme longueur d’onde dans la boîte de dialogue. Double-cliquez sur le détecteur correspondant et entrez 524 pour le début et 545 pour la longueur d’onde finale.
      2. Pour MitoTracker Deep Red, réglez le laser d’excitation sur 641 et la fenêtre des spectres d’émission sur 650-750 nm. Dans l’onglet Acquérir, cliquez sur le bouton Ajouter un laser et faites-le glisser dans le paramètre 1. Double-cliquez sur la ligne d’excitation et entrez 641 comme longueur d’onde dans la boîte de dialogue. Double-cliquez sur le détecteur correspondant et entrez 650 pour le début et 750 pour la longueur d’onde finale.
      3. Pour TMRE, réglez le laser d’excitation sur 555 nm et la fenêtre des spectres d’émission sur 557-643 nm. Dans l’onglet Acquérir, cliquez sur le bouton Ajouter un nouveau paramètre ; ensuite, cliquez sur le bouton Ajouter un laser et faites-le glisser dans le paramètre 2. Double-cliquez sur la ligne d’excitation et entrez 555 comme longueur d’onde dans la boîte de dialogue. Double-cliquez sur le détecteur correspondant et entrez 557 pour le début et 643 pour la longueur d’onde finale.
    3. Expérience MitoSOX : Définissez les spectres d’excitation et d’émission pour YFP, MitoTracker et MitoSOX (Figure 2B).
      1. Pour YFP, réglez le laser d’excitation sur 507 nm et la fenêtre des spectres d’émission sur 517-540 nm. Dans l’onglet Acquérir, cliquez sur le bouton Ajouter un nouveau paramètre ; ensuite, cliquez sur le bouton Ajouter un laser et faites-le glisser dans le paramètre 1. Double-cliquez sur la ligne d’excitation et entrez 507 comme longueur d’onde dans la boîte de dialogue. Double-cliquez sur le détecteur correspondant et entrez 517 pour le début et 540 pour la longueur d’onde finale.
      2. Pour MitoSOX, réglez le laser d’excitation sur 547 nm et la fenêtre des spectres d’émission sur 564-636 nm. Dans l’onglet Acquérir , cliquez sur le bouton Ajouter un nouveau paramètre ; ensuite, cliquez sur le bouton Ajouter un laser et faites-le glisser dans le paramètre 2. Double-cliquez sur la ligne d’excitation et entrez 547 comme longueur d’onde dans la boîte de dialogue. Double-cliquez sur le détecteur correspondant et entrez 564 pour le début et 636 pour la longueur d’onde finale.
      3. Pour MitoTracker Deep Red, réglez le laser d’excitation sur 641 nm et la fenêtre des spectres d’émission sur 652-742 nm. Dans l’onglet Acquérir, cliquez sur le bouton Ajouter un nouveau paramètre ; cliquez sur le bouton Ajouter un laser et faites-le glisser dans le paramètre 3. Double-cliquez sur la ligne d’excitation et entrez 641 comme longueur d’onde dans la boîte de dialogue. Double-cliquez sur le détecteur correspondant et entrez 652 pour le début et 742 pour la longueur d’onde finale.
  3. Paramètres d’acquisition d’images (Figure 2C)
    1. Définissez le format sur 1 024 x 1 024, la vitesse de numérisation sur 600 Hz et la moyenne de la ligne sur 3.
      1. Sélectionnez l’onglet Acquisition et cliquez sur le bouton Format . Dans le menu déroulant, sélectionnez 1 024 x 1 024. Cliquez sur le bouton Vitesse et sélectionnez 600 dans le menu déroulant. Ensuite, cliquez sur le bouton Moyenne des lignes , puis dans le menu déroulant, sélectionnez 3.
      2. Activez le balayage bidirectionnel et réglez le facteur de phase et de zoom sur 22,61 et 1,50, respectivement.
        1. Dans l’onglet Acquisition, basculez le bouton bidirectionnel sur Activé. Cliquez sur le paramètre Phase X et réglez-le sur 22,61. Cliquez sur le paramètre Facteur de zoom et réglez-le sur 1,50.

4. Acquisition d’images

ATTENTION : L’expérimentateur doit porter un jugement visuel pour sélectionner les cellules en fonction du signal de fluorescence YFP. Évitez les pixels sursaturés, car ils peuvent affecter de manière significative la quantification de l’intensité de fluorescence. Utilisez une table de consultation over/under qui indique la saturation en pixels pour éviter d’acquérir des images saturées.

  1. Cliquez sur le paramètre d’intérêt et appuyez sur Fast Live pour fournir un aperçu en direct de l’image de fluorescence.
  2. Ajustez le gain et l’intensité en double-cliquant sur le détecteur correspondant. Dans la boîte de dialogue qui s’affiche, réglez le gain à l’aide du curseur. Pour modifier l’intensité, double-cliquez sur la ligne d’excitation et utilisez les flèches haut et bas dans la fenêtre contextuelle pour modifier l’intensité. Cliquez sur Arrêter pour mettre fin à l’aperçu.
    1. Expérience TMRE : imagez d’abord la plaque de contrôle DMSO. Ajuster le gain et l’intensité du signal TMRE (réglage 2) de sorte que l’intensité du réseau mitochondrial soit juste en dessous de la saturation; Gardez le gain et l’intensité constants pour l’expérience. Ajustez le gain et l’intensité du MitoTracker et du YFP (réglage 1) afin que le réseau mitochondrial soit visible mais faible.
    2. Expérience MitoSOX : imagez d’abord la plaque de contrôle DMSO. Ajuster le gain et l’intensité du signal MitoSOX (réglage 2) de sorte que la fluorescence soit visible mais faible; Gardez le gain et l’intensité constants pour l’expérience. Ajustez le gain et l’intensité du YFP (réglage 1) et du MitoTracker (réglage 3) afin que le réseau mitochondrial soit visible mais faible.
      REMARQUE : Enregistrez le gain et l’intensité de TMRE et de MitoSOX, car ces valeurs doivent rester constantes tout au long de l’expérience. Les signaux de fluorescence de YFP et MitoTracker ne sont pas quantifiés dans ce protocole. Par conséquent, le gain et l’intensité peuvent être ajustés pour chaque image. Il est plus efficace d’avoir les réglages de gain et d’intensité où les cellules sont faciles à voir mais encore faibles, pour s’assurer que les cellules ne sont pas exposées à des intensités laser excessives qui causent des dommages cellulaires ou un photoblanchiment.
  3. Une fois les réglages de gain et d’intensité terminés, cliquez sur Démarrer pour acquérir une image. Acquérir des images de 20 cellules par condition expérimentale (p. ex., cinq images avec quatre cellules par image; Figure 2D).

5. Quantification de l’intensité de fluorescence à l’aide d’ImageJ

REMARQUE: Les fichiers d’imagerie sont enregistrés sous « .lif » et sont compatibles avec ImageJ29. Les types de fichiers compatibles avec ImageJ sont spécifiés sur leur site Web. Il peut être nécessaire de convertir le type de fichier s’il est incompatible.

  1. Créez et enregistrez une région d’intérêt (ROI).
    1. Dans ImageJ, cliquez sur Fichier | Nouveau | L’image. Dans la boîte de dialogue qui s’affiche, cliquez sur OK.
    2. Cliquez sur le bouton Outil Rectangle et dessinez une boîte de 6 microns x 6 microns. Ouvrez le gestionnaire de retour sur investissement en cliquant sur Analyser | Outils | ROI Manager et attendez qu’une boîte de dialogue avec le gestionnaire de ROI apparaisse (Figure 3A). Ajoutez le retour sur investissement rectangulaire au gestionnaire en cliquant sur Ajouter dans la boîte de dialogue du gestionnaire. Enregistrez le retour sur investissement en sélectionnant Plus, puis cliquez sur le bouton Enregistrer et OK.
  2. Mesurer l’intensité de fluorescence.
    1. Dans l’image J, cliquez sur Fichier et sélectionnez Ouvrir. Dans la boîte de dialogue, sélectionnez les fichiers d’imagerie pour l’expérience et cliquez sur Ouvrir.
    2. Attendez que la fenêtre Options d’importation des formats biographiques s’affiche (Figure 3B). Sélectionnez Split Channels (Fractionner les canaux ) et cliquez sur Open (Ouvrir).
      REMARQUE: La fonction de canaux fractionnés permet d’ouvrir chaque canal de l’image dans une fenêtre distincte. L’ordre de canal correspond à l’ordre d’acquisition.
      1. Expériences TMRE : YFP (réglage 1) est le premier canal (c = 0); MitoTracker (réglage 1) est le deuxième canal (c = 1); et TMRE (réglage 2) est le troisième canal (c = 2).
      2. Expériences MitoSOX : YFP (réglage 1) est le premier canal (c = 0) ; MitoSOX (réglage 2) est le deuxième canal (c = 1); et MitoTracker (réglage 3) est le troisième canal (c = 2).
    3. Ajustez la luminosité en sélectionnant Image | Ajuster | Luminosité (Figure 3C).
      REMARQUE: N’appuyez pas sur Définir ou Appliquer pour vous assurer que la luminosité de l’image n’est pas modifiée de manière permanente. Parfois, l’intensité de fluorescence n’est pas visible dans les canaux TMRE ou MitoSOX. Ajustez la luminosité pour faciliter la visualisation. La modification de la luminosité n’affecte pas les valeurs brutes d’intensité de fluorescence.
    4. Cliquez sur Analyser et sélectionnez Définir les mesures. Cochez les cases Zone et Valeur moyenne du gris et cliquez sur OK (Figure 3D).
      REMARQUE: La valeur moyenne de gris est l’intensité de fluorescence.
    5. Ouvrez le gestionnaire de retour sur investissement et chargez le retour sur investissement enregistré à l’étape 5.1 en cliquant sur Analyser | Outils | Gestionnaire de retour sur investissement. Dans le Gestionnaire de retour sur investissement, cliquez sur Plus, puis sur Ouvrir dans la liste qui s’affiche, puis sélectionnez le ROI enregistré.
    6. Mesurez l’intensité de fluorescence de cinq régions aléatoires dans une seule cellule en sélectionnant le retour sur investissement enregistré dans le gestionnaire de retour sur investissement et déplacez le retour sur investissement vers un emplacement aléatoire dans une cellule (Figure 3E). Mesurer l’intensité de fluorescence en appuyant sur M. Répétez cette étape avec quatre régions supplémentaires qui ne se chevauchent pas. Lorsqu’une boîte de dialogue avec les valeurs de surface et de gris moyen s’affiche (Figure 3F), copiez et collez les valeurs dans une feuille de calcul pour analyse.
      1. Expérience TMRE : Sélectionnez l’image (c = 2).
      2. Expérience MitoSOX : Sélectionnez l’image (c = 2).
    7. Obtenir les valeurs moyennes d’intensité de fluorescence. À l’aide d’un tableur (voir le tableau des matières), faites la moyenne des cinq valeurs moyennes de gris. Répétez ce processus pour chaque cellule.
    8. Analyser et comparer les valeurs moyennes de gris TMRE ou MitoSOX dans des conditions expérimentales à l’aide d’un logiciel statistique (voir le tableau des matériaux; Figure 4 et Figure 5). Présentez les données sous forme de graphiques à barres ou de tracés de violon.

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Representative Results

Dans ce protocole, une quantification basée sur la fluorescence a été utilisée pour mesurer le potentiel membranaire et les niveaux de superoxyde du réseau mitochondrial après le traitement CCCP (Figure 1). Ce flux de travail utilisait des cellules HeLa, une lignée cellulaire immortalisée dérivée du cancer du col de l’utérus. Les cellules HeLa sont couramment utilisées pour étudier la biologie mitochondriale et sont relativement plates, ce qui facilite la visualisation du réseau mitochondrial à l’aide de la microscopie. Pour étudier le rôle de Parkin dans le maintien de la santé du réseau mitochondrial, les cellules HeLa ont été transfectées transitoirement avec un vecteur témoin vide, ParkinWT, ou ParkinT240R (un mutant qui perturbe la mitophagie)21. Les cellules HeLa ont été plaquées dans des antennes d’imagerie à fond de verre de 35 mm et ont été transfectées une fois que la confluence de ~50%-60% a été atteinte (Figure 1A). Étant donné que les cellules HeLa se divisent rapidement, c’est généralement le lendemain du placage des cellules dans les antennes d’imagerie. Un microscope optique a été utilisé pour observer le signal de fluorescence YFP le lendemain afin d’évaluer l’efficacité de la transfection. Les expériences n’ont été réalisées qu’après une transfection réussie.

Après inspection, les cellules HeLa ont été traitées avec des concentrations légères (5 μM) ou sévères (20 μM) de CCCP pour dépolariser le réseau mitochondrial (l’étape 1.2 montre des instructions détaillées pour la préparation des sondes CCCP et fluorescentes). Le traitement CCCP a été effectué pendant un total de 2 heures. Au cours des 30 dernières minutes du traitement CCCP, les mitochondries ont été marquées avec MitoTracker et TMRE/MitoSOX (Figure 1A). Il convient de noter que TMRE et MitoSOX ont des spectres de fluorescence qui se chevauchent et ne peuvent pas être utilisés simultanément. Au lieu de cela, nous avons utilisé des antennes d’imagerie séparées pour les expériences TMRE et MitoSOX. Pour les expériences TMRE, les cellules HeLa étaient immédiatement prêtes à imager à la fin du traitement CCCP de 2 heures. La concentration en TMRE doit rester constante; par conséquent, l’ERMT est demeurée dans les médias HeLa. Cependant, MitoSOX libre doit être retiré avant l’imagerie. Pour les expériences MitoSOX, les cellules ont été lavées trois fois avec le milieu HeLa pour éliminer le colorant libre. Pour cette étape, il est essentiel d’utiliser des milieux HeLa contenant la même concentration de DMSO ou de CCCP que les conditions expérimentales. Hoechst 33342, un marqueur de noyaux, a été initialement utilisé pour évaluer les cellules HeLa après la transfection transitoire et le traitement CCCP (Figure 1B).

Par la suite, une microscopie confocale a été réalisée pour visualiser les intensités de fluorescence TMRE et MitoSOX, pour mesurer le potentiel de la membrane mitochondriale et les niveaux de superoxyde, respectivement. Les images ont été acquises à l’aide d’un objectif d’immersion dans l’huile 63x (1,4 NA) avec des paramètres de balayage bidirectionnel, une résolution spatiale de 1 024 x 1 024 pixels, une vitesse de balayage de 600 Hz, une moyenne linéaire de 3, une phase de 22,61 et un facteur de zoom de 1,5 (Figure 2C). La plaque de contrôle DMSO a été imagée en premier pour toutes les expériences afin de définir les valeurs de gain et d’intensité pour TMRE et MitoSOX. Pour effectuer des comparaisons quantitatives entre les conditions, ces valeurs doivent être définies dans la condition DMSO et rester constantes tout au long de l’expérience. CCCP induit une dépolarisation mitochondriale et une perte de potentiel membranaire, ce qui entraîne une réduction de l’intensité de fluorescence TMRE. Par conséquent, les expériences de contrôle avaient l’intensité TMRE la plus élevée, et les valeurs de gain et d’intensité ont été fixées près de la saturation. En revanche, des niveaux plus élevés de superoxyde augmentent l’intensité de MitoSOX. Par conséquent, le contrôle avait l’intensité de fluorescence MitoSOX la plus faible, et les valeurs de gain et d’intensité étaient basses lorsqu’un signal faible était présent. Étant donné que MitoTracker, TMRE et MitoSOX sont des colorants essentiels et marquent toutes les cellules, ils ne doivent pas être utilisés lors de la sélection des cellules à imager. Au lieu de cela, les cellules ont été sélectionnées en fonction du signal YFP pour s’assurer qu’elles étaient transfectées. Des images monoplan ont été acquises, en se concentrant sur le fond de la cellule HeLa, où se trouvait une grande population de mitochondries.

Quantification de l’intensité de fluorescence TMRE et MitoSOX
La quantification des intensités de fluorescence TMRE et MitoSOX a été analysée à l’aide d’ImageJ (Figure 3). Un retour sur investissement de 6 microns x 6 microns a été créé et stocké dans le gestionnaire de retour sur investissement. Le retour sur investissement a été placé dans cinq régions aléatoires qui ne se chevauchent pas de chaque cellule pour mesurer l’intensité de l’ERMT ou du MitoSOX. L’intensité de fluorescence correspond à la valeur moyenne de gris dans ImageJ. Les cinq valeurs d’intensité ont été moyennées pour chaque cellule afin de calculer l’intensité moyenne de fluorescence par cellule. Ces valeurs ont été tracées et analysées pour déterminer leur signification statistique dans toutes les conditions de traitement.

Les résultats pour les intensités de fluorescence TMRE et MitoSOX sont présentés à la figure 4 et à la figure 5, respectivement. Comme prévu, le traitement avec l’agent de découplage connu CCCP a diminué l’intensité de fluorescence TMRE par rapport aux conditions témoins (Figure 4A,B). De plus, un traitement CCCP sévère (20 μM) a induit la production de superoxyde et a augmenté l’intensité de fluorescence MitoSOX (Figure 5A,B). Dans des conditions de stress CCCP légères (5 μM), l’expression de ParkinWT et ParkinT240R a entraîné une intensité TMRE plus élevée par rapport au vecteur témoin YFP vide. De même, l’intensité de MitoSOX était plus faible dans les cellules exprimant ParkinWT et ParkinT240R que dans les cellules exprimant le vecteur témoin YFP (Figure 5A,B). Ces résultats suggèrent que l’expression de Parkin aide à maintenir la santé du réseau mitochondrial en préservant des potentiels de membrane mitochondriale plus élevés et de faibles niveaux de superoxyde. Ainsi, le protocole décrit ici peut être utilisé pour comparer avec précision l’intensité de fluorescence afin d’analyser le rôle de Parkin dans le contrôle du potentiel de membrane mitochondriale et de la formation de superoxydes.

Figure 1
Figure 1 : Flux de travail expérimental. (A) Schéma du flux de travail expérimental utilisé pour transfecter, traiter avec CCCP et marquer le réseau mitochondrial, et image TMRE et intensité de fluorescence MitoSOX dans les cellules HeLa. (B) Images représentatives de cellules exprimant un vecteur YFP vide (en haut), YFP-ParkinWT (au milieu) et YFP-ParkinT240R (en bas; magenta). Hoechst 33342 (blanc) est utilisé pour marquer l’ADN. Barre d’échelle = 10 μm. Abréviations : PCCC = cyanure de carbonyle m-chlorophénylhydrazone; TMRE = ester de tétraméthylrhodamine-éthyl-perchlorate; YFP = protéine fluorescente jaune. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Interface utilisateur permettant de configurer les paramètres d’acquisition confocale. (A) Boîte de dialogue Paramètres laser. Le rectangle rouge met en évidence le laser de lumière blanche, l’état de puissance, la puissance du laser et les longueurs d’onde. (B) Canal expérimental mis en place pour une expérience MitoSOX. Les paramètres, les raies d’excitation et les fenêtres de spectres d’émission sont affichés pour YFP, MitoSOX et MitoTracker. (C) Les paramètres d’acquisition indiquent le format, la vitesse, la bidirectionnalité, la phase X, le facteur de zoom et la moyenne des lignes. (D) Une image acquise par un représentant. Les cellules HeLa expriment YFP (magenta), et les mitochondries sont marquées avec MitoSOX (vert) et MitoTracker (cyan). Barre d’échelle = 10 μm. Abréviations : WLL = laser à lumière blanche; YFP = protéine fluorescente jaune. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : Flux de travail ImageJ pour quantifier les intensités de fluorescence TMRE et MitoSOX. (A) Le panneau du gestionnaire de retour sur investissement avec un exemple de retour sur investissement dans ImageJ. (B) Panneau d’options d’importation de bioformats. Le rectangle rouge met en surbrillance l’option Fractionner les canaux qui doit être sélectionnée. (C) Paramètres de réglage de la luminosité et du contraste. (D) Définir le paramètre de mesure. Les rectangles rouges mettent en surbrillance les options Zone et Valeur moyenne du gris qui doivent être sélectionnées. (E) Image représentative d’une cellule HeLa marquée avec MitoSOX. Le carré rouge illustre le retour sur investissement du panneau A. Barre d’échelle = 10 μm. (F) Panel de résultats montrant la zone expérimentale et les valeurs moyennes de gris des ROI. La valeur moyenne de gris (orange) représente les valeurs d’intensité de fluorescence. Abréviations : TMRE = ester de tétraméthylrhodamine-éthyl-perchlorate; ROI = région d’intérêt. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4 : Intensité de fluorescence TMRE après lésion mitochondriale. (A) Images représentatives de cellules HeLa après un traitement de 2 heures avec du DMSO, 5 μM CCCP ou 20 μM CCCP pour induire des dommages mitochondriaux. Les cellules expriment de manière exogène un vecteur YFP vide, YFP-ParkinWT ou YFP-ParkinT240R (magenta), et marquées avec MitoTracker (cyan) et TMRE (vert). Barre d’échelle = 30 μm. (B) Quantification de l’intensité de fluorescence TMRE pour les cellules exprimant le vecteur YFP vide (bleu), YFP-ParkinWT (orange) et YFP-ParkinT240R (violet) dans des conditions traitées par DMSO et CCCP. p < 0,0001 par ANOVA bidirectionnelle avec un test de comparaison multiple. (C-E) La quantification des intensités de fluorescence TMRE du panel B est séparée pour mettre en évidence les différences entre le DMSO (C), le CCCP de 5 μM (D) et le CCCP de 20 μM (E). * p < 0,05; p < 0,001; p < 0,0001 par l’ANOVA de Kruskal-Wallis avec le test de comparaison multiple de Dunn. Ns = non significatif. Moyenne ± SEM; n = 79-104 à partir de trois réplicas biologiques indépendants. Abréviations : PCCC = cyanure de carbonyle m-chlorophénylhydrazone; TMRE = ester de tétraméthylrhodamine-éthyl-perchlorate; YFP = protéine fluorescente jaune; DMSO = diméthylsulfoxyde. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 5
Figure 5 : Intensité de fluorescence MitoSOX suite à une lésion du réseau mitochondrial. (A) Images représentatives de cellules HeLa traitées pendant 2 h avec du DMSO, 5 μM CCCP ou 20 μM CCCP pour découpler le potentiel membranaire mitochondrial. Les cellules ont été transfectées avec le vecteur YFP vide, YFP-ParkinWT ou YFP-ParkinT240R (magenta), et marquées avec MitoTracker (cyan) et MitoSOX (vert). Barre d’échelle = 30 μm. (B) Quantification de l’intensité de fluorescence MitoSOX pour les cellules exprimant le vecteur YFP vide (bleu), YFP-ParkinWT (orange) et YFP-ParkinT240R (violet) pour les conditions témoins et traitées. p < 0,0001 par ANOVA bidirectionnelle avec le test de comparaison multiple de Dunn. (C-E) La quantification des intensités de fluorescence MitoSOX du panel B est séparée pour mettre en évidence les différences de DMSO (C), 5 μM CCCP (D) et 20 μM CCCP (E). *p < 0,05; p < 0,0001 par l’ANOVA de Kruskal-Wallis avec le test de comparaison multiple de Dunn. Ns = non significatif. Moyenne ± SEM; n = 87-107 à partir de trois réplicas biologiques indépendants. Abréviations : PCCC = cyanure de carbonyle m-chlorophénylhydrazone; TMRE = ester de tétraméthylrhodamine-éthyl-perchlorate; YFP = protéine fluorescente jaune; DMSO = diméthylsulfoxyde. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Discussion

Le flux de travail décrit ici peut être utilisé pour quantifier le potentiel de la membrane mitochondriale et les niveaux de superoxyde de manière robuste et reproductible à l’aide de l’imagerie basée sur la fluorescence30. Il y a d’importantes limites techniques à prendre en compte lors de la conception de ces expériences. Les cellules HeLa ont été transfectées avec un vecteur YFP vide, YFP-ParkinWT ou YFP-ParkinT240R. Le vecteur YFP vide a été utilisé comme témoin pour confirmer que les résultats expérimentaux étaient spécifiques à Parkin. Pour la transfection transitoire, un rapport de masse de 1:3 pour l’ADN au réactif de transfection a été déterminé expérimentalement pour obtenir le taux de transfection le plus élevé, où 2 μg d’ADN plasmidique ont été utilisés pour chaque construction28. Il était important de maintenir la cohérence de l’étiquette YFP pour toutes les constructions, car les protéines fluorescentes diffèrent par leur luminosité innée31,32. Si plusieurs marqueurs de protéines fluorescentes doivent être utilisés, des protéines fluorescentes ayant une luminosité et une photostabilité similaires doivent être sélectionnées33.

Pour mesurer le potentiel de la membrane mitochondriale et les niveaux de superoxyde, deux colorants bien documentés ont été sélectionnés. Le signal de fluorescence de TMRE est basé sur le potentiel de membrane mitochondriale, tandis que l’intensité de fluorescence MitoSOX est fonction des niveaux de superoxyde. Pour l’imagerie basée sur la fluorescence, il ne devrait pas y avoir de chevauchement spectral entre les sondes fluorescentes. Cependant, le protocole initial a été réalisé en utilisant mCherry-ParkinWT et mCherry-ParkinT240R, qui chevauchaient les spectres décalés vers le rouge de TMRE et MitoSOX. Pour éviter le chevauchement spectral et minimiser la diaphonie potentielle, des constructions Parkin marquées YFP ont été sélectionnées. Cet ajustement a nécessité de modifier le colorant MitoTracker du vert au rouge lointain. De plus, la densité de placage des cellules HeLa a été optimisée; initialement, les cellules HeLa ont été plaquées à 45 000 cellules par antenne d’imagerie, mais cela a entraîné des plats trop confluents. Une confluence cellulaire élevée peut réduire l’efficacité de la transfection, favoriser la mort cellulaire et modifier le métabolisme cellulaire34,35,36. Pour éviter ces impacts potentiels, les cellules ont été plaquées à une densité de 30 000 cellules par antenne d’imagerie.

La principale limite de ce protocole est le potentiel de biais de l’utilisateur, en particulier lors de la sélection des cellules et des emplacements de retour sur investissement. Le protocole utilise les changements dans les intensités de fluorescence TMRE et MitoSOX comme lecture fonctionnelle du potentiel membranaire et des niveaux de superoxyde. Par conséquent, la sélection cellulaire à l’aide de ces sondes pourrait potentiellement biaiser les résultats expérimentaux. Pour lutter contre ce biais, nous avons choisi des cellules basées uniquement sur l’expression de YFP. Les ROI sans chevauchement ont été sélectionnés au hasard dans le réseau mitochondrial au sein de la cellule. Bien que cette méthode ait déjà été utilisée pour mesurer l’intensité de fluorescence27, des mesures supplémentaires de réduction des biais pourraient être prises. Tout d’abord, l’étude pourrait être mise en aveugle à l’aide des outils d’analyse à l’aveugle d’ImageJ pour empêcher la sélection du retour sur investissement qui soutient les résultats attendus. Deuxièmement, les intensités de fluorescence pourraient être mesurées à l’aide d’un logiciel d’analyse d’image avancé qui élimine le besoin de retour sur investissement.

Bien que ce protocole utilise la microscopie confocale pour la quantification basée sur la fluorescence, d’autres méthodes, telles que la cytométrie en flux, pourraient être utilisées pour quantifier les changements de fluorescence dans TMRE et MitoSOX37. Ici, nous avons utilisé la microscopie confocale plutôt que la cytométrie en flux pour visualiser la morphologie du réseau mitochondrial. Le protocole décrit pourrait facilement être adapté pour mesurer la fluorescence TMRE et MitoSOX avec une cytométrie en flux donnant des résultats expérimentaux similaires. En outre, les tests de taux de consommation d’oxygène (OCR) pourraient être utilisés pour détecter les changements dans la fonction de la chaîne de transport d’électrons mitochondriale sans colorants cationiques. Bien que l’OCR fournisse une mesure sensible du dysfonctionnement mitochondrial, elle n’est pas spécifique au potentiel membranaire ou à la concentration de superoxyde, mais fournit plutôt une mesure globale de la fonction mitochondriale38. Ces tests pourraient être effectués conjointement avec des expériences TMRE et MitoSOX pour évaluer la santé mitochondriale39.

Bien que ce protocole se concentre spécifiquement sur l’effet du découpleur mitochondrial CCCP40, des réactifs dommageables avec des mécanismes alternatifs pourraient être utilisés. Par exemple, l’antimycine A et l’oligomycine A sont des inhibiteurs de chaîne de transport d’électrons couramment utilisés pour induire des dommages mitochondriaux via la production d’espèces réactives de l’oxygène (ROS)38. Alors que nous avons spécifiquement mesuré les niveaux de superoxyde mitochondrial en utilisant MitoSOX, les ROS intracellulaires ont pu être mesurés à l’aide de CellROX. Dans les cellules HeLa, il a été nécessaire de surexprimer Parkin en raison de la faible expression endogène. Des études futures pourraient observer les effets de l’expression de Parkin sur la santé du réseau mitochondrial en utilisant des systèmes de culture cellulaire qui expriment la Parkin41 endogène. Étant donné que les mitochondries sont des régulateurs essentiels du métabolisme énergétique et de l’homéostasie cellulaire, le dysfonctionnement mitochondrial est associé à de nombreuses maladies, notamment le diabète42, la maladie d’Alzheimer 43,44,45, le cancer 46 et les maladies du foie 47. Par conséquent, ce flux de travail pourrait être adapté pour étudier la santé mitochondriale et la dysrégulation dans les lignées cellulaires pertinentes et les cultures primaires.

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Disclosures

Les auteurs n’ont pas d’intérêts concurrents à déclarer.

Acknowledgments

Nous remercions les membres du laboratoire Evans pour leurs commentaires réfléchis sur ce manuscrit. Ce travail est soutenu par Duke Whitehead Scholars, Duke Science and Technology Scholars et Howard Hughes Medical Institute (HHMI) Hanna Gray Fellowship. La figure 1A a été réalisée à l’aide de BioRender.com.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Chemicals, Peptides, and Recombinant Proteins
CCCP (carbonyl cyanide m-chlorophenyl hydrazone)  Sigma-Aldrich C2759
DMEM (1x) with 4.5 g/L glucose Gibco 11-965-084
DMSO, Anhydrous ThermoFisher Scientific D12345
Fetal Bovine Serum Hyclone SH3007103
FuGENE 6 (Tranfection Reagent) Promega E2691
GlutaMAX 100x (L-Glutamine Solution)  Gibco  35-050-061
Hoescht 33342 ThermoFisher Scientific 62249
MitoSOX  Red  ThermoFisher Scientific M36008
MitoTracker Deep Red ThermoFisher Scientific M7514
Opti-MEM (Redued Serum media) ThermoFisher scientific 31985070
Tetramethylrhodamine, Ethyl Ester, Perchlorate (TMRE)  ThermoFisher Scientific T669
Experimental models: Organisms/Strains
HeLa-M (Homo sapiens) A. Peden (Cambridge Institute for Medical Research) N/A
Recombinant DNA
EYFP Empty Vector N/A N/A
YFP-Parkin T240R This Paper Generated by site-directed mutagenesis from YFP-Parkin
YFP-Parkin WT Addgene; PMID:19029340 RRID:Addgene_23955
Software and Algorithms
Adobe Illustrator Adobe Inc. https://www.adobe.com/products/illustrator (Schindelin, 2012)
Excel (Spreadsheet Software) Microsoft Office  https://www.microsoft.com/en-us/microsoft-365/excel
ImageJ https://imagej.net/software/fiji/
Leica Application Suite (LAS X) Leica https://www.leica-microsystems.com/products/microscope-software/p/leica-las-x-ls/
Microsoft Excel Microsoft Office https://www.microsoft.com/excel
Prism9 (Statistical Analysis Software) GraphPad Software https://www.graphpad.com
Other
35 mm Dish, No. 1.5 Coverslip, 20 mm Glass Diameter, Uncoated MatTek P35G-1.5-20-C
Cage Incubator (Environmental Chamber) Okolab https://www.oko-lab.com/cage-incubator
DMiL Inverted Microscope Leica N/A
LIGHTNING Deconvolution Software Leica N/A
STELLARIS 8 confocal microscope Leica N/A

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Fazli, M., Evans, C. S. Fluorescence-Based Quantification of Mitochondrial Membrane Potential and Superoxide Levels Using Live Imaging in HeLa Cells. J. Vis. Exp. (195), e65304, doi:10.3791/65304 (2023).

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