हेला कोशिकाओं में लाइव इमेजिंग का उपयोग करके माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली क्षमता और सुपरऑक्साइड स्तरों का प्रतिदीप्ति-आधारित परिमाणीकरण
Summary
यह तकनीक प्रतिदीप्ति-आधारित लाइव इमेजिंग का उपयोग करके हेला कोशिकाओं के भीतर माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली क्षमता और सुपरऑक्साइड के स्तर को देखने और मात्रात्मक रूप से मापने के लिए एक प्रभावी वर्कफ़्लो का वर्णन करती है।
Abstract
माइटोकॉन्ड्रिया एटीपी संश्लेषण के माध्यम से ऊर्जा उत्पादन को नियंत्रित करके चयापचय होमियोस्टैसिस के लिए महत्वपूर्ण गतिशील अंग हैं। सेलुलर चयापचय का समर्थन करने के लिए, विभिन्न माइटोकॉन्ड्रियल गुणवत्ता नियंत्रण तंत्र एक स्वस्थ माइटोकॉन्ड्रियल नेटवर्क को बनाए रखने के लिए सहयोग करते हैं। ऐसा ही एक मार्ग माइटोफैगी है, जहां पीटीईएन-प्रेरित काइनेज 1 (पिंक 1) और क्षतिग्रस्त माइटोकॉन्ड्रिया के पार्किन फॉस्फो-सर्वव्यापी ऑटोफैगोसोम अनुक्रम ण और बाद में लाइसोसोम संलयन के माध्यम से सेल से हटाने की सुविधा प्रदान करते हैं। सेलुलर होमियोस्टैसिस के लिए माइटोफैगी महत्वपूर्ण है, और पार्किन में उत्परिवर्तन पार्किंसंस रोग (पीडी) से जुड़े हैं। इन निष्कर्षों के कारण, माइटोकॉन्ड्रियल गुणवत्ता नियंत्रण के आणविक तंत्र और गतिशीलता को समझने के लिए माइटोकॉन्ड्रियल क्षति और कारोबार की जांच पर महत्वपूर्ण जोर दिया गया है। यहां, लाइव-सेल इमेजिंग का उपयोग हेला कोशिकाओं के माइटोकॉन्ड्रियल नेटवर्क की कल्पना करने के लिए किया गया था, ताकि कार्बोनिल साइनाइड एम-क्लोरोफिनाइल हाइड्राज़ोन (सीसीसीपी), माइटोकॉन्ड्रियल अनकपलिंग एजेंट के साथ उपचार के बाद माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली क्षमता और सुपरऑक्साइड के स्तर को निर्धारित किया जा सके। इसके अलावा, पार्किन (पार्किनटी 240 आर) का पीडी-लिंक्ड उत्परिवर्तन जो पार्किन-निर्भर माइटोफैगी को रोकता है, यह निर्धारित करने के लिए व्यक्त किया गया था कि जंगली प्रकार के पार्किन को व्यक्त करने वाली कोशिकाओं की तुलना में उत्परिवर्ती अभिव्यक्ति माइटोकॉन्ड्रियल नेटवर्क को कैसे प्रभावित करती है। यहां उल्लिखित प्रोटोकॉल माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली क्षमता और सुपरऑक्साइड स्तरों को प्रभावी ढंग से निर्धारित करने के लिए प्रतिदीप्ति-आधारित दृष्टिकोण का उपयोग करके एक सरल वर्कफ़्लो का वर्णन करता है।
Introduction
माइटोकॉन्ड्रियल नेटवर्क परस्पर जुड़े हुए जीवों की एक श्रृंखला है जो ऊर्जा उत्पादन1, जन्मजात प्रतिरक्षा 2,3 और सेल सिग्नलिंग 4,5 में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। माइटोकॉन्ड्रियल डिसरेग्यूलेशन को पार्किंसंस रोग (पीडी) 6,7 जैसे न्यूरोडीजेनेरेटिव रोगों से जोड़ा गया है। पीडी एक प्रगतिशील न्यूरोडीजेनेरेटिव विकार है जो सब्सटेंशिया नाइग्रा के डोपामिनर्जिक न्यूरॉन्स को प्रभावित करता हैजो दुनिया भर में लगभग 10 मिलियन लोगों को प्रभावित करता है। पीडी को आनुवंशिक रूप से माइटोफैगी से जोड़ा गया है, जो सेलुलर होमियोस्टैसिस को बनाए रखने के लिए आवश्यक एक माइटोकॉन्ड्रियल गुणवत्ता नियंत्रण मार्ग है जो चुनिंदा रूप से क्षतिग्रस्त माइटोकॉन्ड्रिया 9,10 को हटा देता है। अध्ययनों ने कई स्वतंत्र माइटोफैगी मार्गों की पहचान की है, जिनमें FUN14 डोमेन जिसमें 1 (FUNDC1)-मध्यस्थता माइटोफैगी, बीसीएल -2 इंटरैक्टिंग प्रोटीन 3 (BNIP3) -सुविधाजनक माइटोफैगी, NIX-निर्भर माइटोफैगी, और अच्छी तरह से विशेषता वाले PTEN-प्रेरित काइनेज 1 (PINK1)/Parkin-विनियमित माइटोफैगी10,11 शामिल हैं। पिंक 1 (एक कथित काइनेज) और पार्किन (एक ई 3 यूबिकिटिन लिगेज) फॉस्फो-यूबिकिटेट क्षतिग्रस्त माइटोकॉन्ड्रिया के साथ मिलकर काम करते हैं, जो ऑटोफैगोसोम के गठन को चलाता है जो क्षतिग्रस्त ऑर्गेनेल को घेरता है और लाइसोसोम के साथ मिलकर गिरावट शुरू करता है 12,13,14,15,16। पार्किन में उत्परिवर्तन पीडी-लिंक्ड फेनोटाइप्स से जुड़े हुए हैं जैसे कि डोपामिनर्जिक न्यूरॉन्स17,18 के नुकसान के माध्यम से न्यूरोडीजेनेरेशन।
यहां, एक प्रोटोकॉल का वर्णन किया गया है जिसमें हेला कोशिकाएं, नियमित रूप से गर्भाशय ग्रीवा के कैंसर से प्राप्त अमर कोशिकाओं का उपयोग करती हैं, माइटोकॉन्ड्रियल नेटवर्क स्वास्थ्य को बनाए रखने में पार्किन की भूमिका की जांच करने के लिए उपयोग की जाती हैं। हेला कोशिकाएं अंतर्जात पार्किन के नगण्य स्तर को व्यक्त करती हैं और इसलिए बहिर्जात पार्किन अभिव्यक्तिकी आवश्यकता होती है। माइटोकॉन्ड्रियल नेटवर्क स्वास्थ्य में पार्किन की भूमिका का अध्ययन करने के लिए, हेला कोशिकाओं को या तो जंगली-प्रकार पार्किन (पार्किन डब्ल्यूटी), एक पार्किन उत्परिवर्ती (पार्किनटी 240 आर), या एक खाली नियंत्रण वेक्टर के साथ स्थानांतरित किया जाताहै। पार्किनटी 240 आर एक ऑटोसोमल रिसेसिव किशोर पार्किंसनिज़्म उत्परिवर्तन है जो पार्किन ई 3 लिगेज गतिविधि को प्रभावित करता है, जिससे माइटोफैगी मार्ग20 की दक्षता काफी कम हो जाती है। हेला कोशिकाएं कार्बोनिल साइनाइड एम-क्लोरोफिनाइल हाइड्राज़ोन (सीसीसीपी), एक माइटोकॉन्ड्रियल अनकपलिंग एजेंट के हल्के (5 μM) या गंभीर (20 μM) सांद्रता के अधीन हैं। सीसीसीपी की गंभीर सांद्रता के साथ उपचार नियमित रूप से विभिन्न सेल लाइनों में पार्किन-मध्यस्थता माइटोफैगी को प्रेरित करने के लिए उपयोग किया जाता है, जैसे कि हेला और सीओएस -7 कोशिकाएं21,22,23।
उपचार के बाद, प्रोटोकॉल वर्तमान में उपलब्ध दो माइटोकॉन्ड्रियल-लक्षित फ्लोरोसेंट रंगों का उपयोग करके माइटोकॉन्ड्रियल नेटवर्क की लाइव इमेजिंग को नियोजित करता है। टेट्रामिथाइलरोडामाइन, एथिल एस्टर, परक्लोरेट (टीएमआरई) एक धनिक डाई है जो माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली क्षमता24 के आधार पर फ्लोरेस करता है, जबकि माइटोएसओएक्स एक माइटोकॉन्ड्रियल सुपरऑक्साइड संकेतक है जहां प्रतिदीप्ति तीव्रता सुपरऑक्साइड एकाग्रता25 का एक कार्य है। अंत में, उल्लिखित प्रोटोकॉल उपयोगकर्ता पूर्वाग्रह के लिए न्यूनतम गुंजाइश के साथ माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली क्षमता और सुपरऑक्साइड स्तरों को प्रभावी ढंग से निर्धारित करने के लिए प्रतिदीप्ति-आधारित परिमाणीकरण और सरल वर्कफ़्लो का उपयोग करता है। यद्यपि इस प्रोटोकॉल को हेला कोशिकाओं में माइटोकॉन्ड्रियल फ़ंक्शन का अध्ययन करने के लिए डिज़ाइन किया गया था, लेकिन इसे माइटोकॉन्ड्रियल नेटवर्क स्वास्थ्य को मात्रात्मक रूप से चिह्नित करने के लिए अतिरिक्त सेल लाइनों और प्राथमिक सेल प्रकारों के लिए अनुकूलित किया जा सकता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
यहां उल्लिखित वर्कफ़्लो का उपयोग माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली क्षमता और सुपरऑक्साइड के स्तर को प्रतिदीप्ति-आधारित इमेजिंग30 का उपयोग करके मजबूत और पुन: निर्धारित करने के लिए किया जा सकता है। इन प्…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम इस पांडुलिपि पर उनकी विचारशील प्रतिक्रिया के लिए इवांस प्रयोगशाला के सदस्यों को धन्यवाद देते हैं। यह काम ड्यूक व्हाइटहेड स्कॉलर्स, ड्यूक साइंस एंड टेक्नोलॉजी स्कॉलर्स और हॉवर्ड ह्यूजेस मेडिकल इंस्टीट्यूट (एचएचएमआई) हैना ग्रे फैलोशिप द्वारा समर्थित है। चित्र 1 ए BioRender.com का उपयोग करके बनाया गया था।
Materials
| Chemicals, Peptides, and Recombinant Proteins | |||
| CCCP (carbonyl cyanide m-chlorophenyl hydrazone) | Sigma-Aldrich | C2759 | |
| DMEM (1x) with 4.5 g/L glucose | Gibco | 11-965-084 | |
| DMSO, Anhydrous | ThermoFisher Scientific | D12345 | |
| Fetal Bovine Serum | Hyclone | SH3007103 | |
| FuGENE 6 (Tranfection Reagent) | Promega | E2691 | |
| GlutaMAX 100x (L-Glutamine Solution) | Gibco | 35-050-061 | |
| Hoescht 33342 | ThermoFisher Scientific | 62249 | |
| MitoSOX Red | ThermoFisher Scientific | M36008 | |
| MitoTracker Deep Red | ThermoFisher Scientific | M7514 | |
| Opti-MEM (Redued Serum media) | ThermoFisher scientific | 31985070 | |
| Tetramethylrhodamine, Ethyl Ester, Perchlorate (TMRE) | ThermoFisher Scientific | T669 | |
| Experimental models: Organisms/Strains | |||
| HeLa-M (Homo sapiens) | A. Peden (Cambridge Institute for Medical Research) | N/A | |
| Recombinant DNA | |||
| EYFP Empty Vector | N/A | N/A | |
| YFP-Parkin T240R | This Paper | Generated by site-directed mutagenesis from YFP-Parkin | |
| YFP-Parkin WT | Addgene; PMID:19029340 | RRID:Addgene_23955 | |
| Software and Algorithms | |||
| Adobe Illustrator | Adobe Inc. | https://www.adobe.com/products/illustrator | (Schindelin, 2012) |
| Excel (Spreadsheet Software) | Microsoft Office | https://www.microsoft.com/en-us/microsoft-365/excel | |
| ImageJ | https://imagej.net/software/fiji/ | ||
| Leica Application Suite (LAS X) | Leica | https://www.leica-microsystems.com/products/microscope-software/p/leica-las-x-ls/ | |
| Microsoft Excel | Microsoft Office | https://www.microsoft.com/excel | |
| Prism9 (Statistical Analysis Software) | GraphPad Software | https://www.graphpad.com | |
| Other | |||
| 35 mm Dish, No. 1.5 Coverslip, 20 mm Glass Diameter, Uncoated | MatTek | P35G-1.5-20-C | |
| Cage Incubator (Environmental Chamber) | Okolab | https://www.oko-lab.com/cage-incubator | |
| DMiL Inverted Microscope | Leica | N/A | |
| LIGHTNING Deconvolution Software | Leica | N/A | |
| STELLARIS 8 confocal microscope | Leica | N/A |
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