Fluorescensbasert kvantifisering av mitokondriemembranpotensial og superoksidnivåer ved bruk av levende avbildning i HeLa-celler
Summary
Denne teknikken beskriver en effektiv arbeidsflyt for å visualisere og kvantitativt måle mitokondriemembranpotensial og superoksidnivåer i HeLa-celler ved hjelp av fluorescensbasert levende bildebehandling.
Abstract
Mitokondrier er dynamiske organeller som er kritiske for metabolsk homeostase ved å kontrollere energiproduksjon via ATP-syntese. For å støtte cellulær metabolisme samarbeider ulike mitokondrielle kvalitetskontrollmekanismer for å opprettholde et sunt mitokondrielt nettverk. En slik vei er mitofagi, hvor PTEN-indusert kinase 1 (PINK1) og Parkin-fosfo-ubiquitinering av skadede mitokondrier letter autofagosomsekvestrasjon og påfølgende fjerning fra cellen via lysosomfusjon. Mitofagi er viktig for cellulær homeostase, og mutasjoner i Parkin er knyttet til Parkinsons sykdom (PD). På grunn av disse funnene har det vært betydelig vekt på å undersøke mitokondriell skade og omsetning for å forstå molekylære mekanismer og dynamikk i mitokondriell kvalitetskontroll. Her ble levende celleavbildning brukt til å visualisere det mitokondrielle nettverket av HeLa-celler, for å kvantifisere mitokondriemembranpotensialet og superoksidnivåene etter behandling med karbonylcyanid m-klorfenylhydrazon (CCCP), et mitokondrielt frakoblingsmiddel. I tillegg ble en PD-bundet mutasjon av Parkin (ParkinT240R) som hemmer Parkin-avhengig mitofagi uttrykt for å bestemme hvordan mutant uttrykk påvirker mitokondrienettverket sammenlignet med celler som uttrykker villtype Parkin. Protokollen som er skissert her, beskriver en enkel arbeidsflyt ved hjelp av fluorescensbaserte tilnærminger for å kvantifisere mitokondriemembranpotensial og superoksidnivåer effektivt.
Introduction
Mitokondrienettverket er en serie sammenkoblede organeller som spiller en avgjørende rolle i energiproduksjon1, medfødt immunitet2,3 og cellesignalering 4,5. Mitokondriell dysregulering har vært assosiert med nevrodegenerative sykdommer som Parkinsons sykdom (PD)6,7. PD er en progressiv nevrodegenerativ lidelse som påvirker dopaminerge nevroner av substantia nigra som påvirker nesten 10 millioner mennesker over hele verden8. PD har vært genetisk knyttet til mitofagi, en mitokondriell kvalitetskontrollvei som er nødvendig for å opprettholde cellulær homeostase som selektivt fjerner skadede mitokondrier 9,10. Studier har identifisert flere uavhengige mitofagiveier, inkludert FUN14-domene som inneholder 1 (FUNDC1)-mediert mitofagi, Bcl-2 interagerende protein 3 (BNIP3)-tilrettelagt mitofagi, NIX-avhengig mitofagi og den velkarakteriserte PTEN-induserte kinase 1 (PINK1)/Parkin-regulerte mitofagi10,11. PINK1 (en antatt kinase) og Parkin (en E3 ubiquitin ligase) arbeider sammen med fosfo-ubiquitinat skadede mitokondrier, som driver dannelsen av autofagosomer som sluker den skadede organellen og smelter sammen med lysosomer for å initiere nedbrytning 12,13,14,15,16. Mutasjoner i Parkin har vært assosiert med PD-koblede fenotyper som nevrodegenerasjon via tap av dopaminerge nevroner17,18.
Her beskrives en protokoll der HeLa-celler, rutinemessig brukte udødeliggjorte celler avledet fra livmorhalskreft, brukes til å undersøke Parkins rolle i å opprettholde mitokondriell nettverkshelse. HeLa-celler uttrykker ubetydelige nivåer av endogent Parkin og krever derfor eksogent Parkin-uttrykk19. For å studere rollen til Parkin i mitokondriell nettverkshelse, blir HeLa-celler transfektert med enten villtype Parkin (ParkinWT), en Parkin-mutant (ParkinT240R) eller en tom kontrollvektor. ParkinT240R er en autosomal recessiv juvenil parkinsonismemutasjon som påvirker Parkin E3-ligaseaktiviteten, noe som reduserer effektiviteten til mitofagibanen20 betydelig. HeLa-celler utsettes for milde (5 μM) eller alvorlige (20 μM) konsentrasjoner av karbonylcyanid m-klorfenylhydrazon (CCCP), et mitokondrielt frakoblingsmiddel. Behandling med alvorlige konsentrasjoner av CCCP brukes rutinemessig til å indusere Parkin-mediert mitofagi i forskjellige cellelinjer, slik som HeLa og COS-7 celler21,22,23.
Etter behandling benytter protokollen levende avbildning av mitokondrienettverket ved bruk av to tilgjengelige mitokondriemålrettede fluorescerende fargestoffer. Tetrametylrhodamin, etylester, perklorat (TMRE) er et kationisk fargestoff som fluorescerer basert på mitokondriemembranpotensial24, mens MitoSOX er en mitokondriell superoksidindikator hvor fluorescensintensiteten er en funksjon av superoksydkonsentrasjon25. Til slutt bruker den skisserte protokollen en fluorescensbasert kvantifisering og enkel arbeidsflyt for effektivt å kvantifisere mitokondriemembranpotensialet og superoksidnivåene med minimalt rom for brukerskjevhet. Selv om denne protokollen ble designet for å studere mitokondriell funksjon i HeLa-celler, kan den tilpasses for flere cellelinjer og primære celletyper for kvantitativt å karakterisere mitokondriell nettverkshelse.
Protocol
Representative Results
Discussion
Arbeidsflyten som er skissert her, kan brukes til å kvantifisere mitokondriemembranpotensial og superoksidnivåer robust og reproduserbart ved hjelp av fluorescensbasert avbildning30. Det er viktige tekniske begrensninger å vurdere når du designer disse eksperimentene. HeLa-celler ble transfektert med en tom YFP-vektor, YFP-ParkinWT, eller YFP-ParkinT240R. Den tomme YFP-vektoren ble brukt som en kontroll for å bekrefte at de eksperimentelle funnene var spesifikke for Park…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker medlemmene av Evans-laboratoriet for gjennomtenkte tilbakemeldinger på dette manuskriptet. Dette arbeidet støttes av Duke Whitehead Scholars, Duke Science and Technology Scholars, og Howard Hughes Medical Institute (HHMI) Hanna Gray Fellowship. Figur 1A ble laget med BioRender.com.
Materials
| Chemicals, Peptides, and Recombinant Proteins | |||
| CCCP (carbonyl cyanide m-chlorophenyl hydrazone) | Sigma-Aldrich | C2759 | |
| DMEM (1x) with 4.5 g/L glucose | Gibco | 11-965-084 | |
| DMSO, Anhydrous | ThermoFisher Scientific | D12345 | |
| Fetal Bovine Serum | Hyclone | SH3007103 | |
| FuGENE 6 (Tranfection Reagent) | Promega | E2691 | |
| GlutaMAX 100x (L-Glutamine Solution) | Gibco | 35-050-061 | |
| Hoescht 33342 | ThermoFisher Scientific | 62249 | |
| MitoSOX Red | ThermoFisher Scientific | M36008 | |
| MitoTracker Deep Red | ThermoFisher Scientific | M7514 | |
| Opti-MEM (Redued Serum media) | ThermoFisher scientific | 31985070 | |
| Tetramethylrhodamine, Ethyl Ester, Perchlorate (TMRE) | ThermoFisher Scientific | T669 | |
| Experimental models: Organisms/Strains | |||
| HeLa-M (Homo sapiens) | A. Peden (Cambridge Institute for Medical Research) | N/A | |
| Recombinant DNA | |||
| EYFP Empty Vector | N/A | N/A | |
| YFP-Parkin T240R | This Paper | Generated by site-directed mutagenesis from YFP-Parkin | |
| YFP-Parkin WT | Addgene; PMID:19029340 | RRID:Addgene_23955 | |
| Software and Algorithms | |||
| Adobe Illustrator | Adobe Inc. | https://www.adobe.com/products/illustrator | (Schindelin, 2012) |
| Excel (Spreadsheet Software) | Microsoft Office | https://www.microsoft.com/en-us/microsoft-365/excel | |
| ImageJ | https://imagej.net/software/fiji/ | ||
| Leica Application Suite (LAS X) | Leica | https://www.leica-microsystems.com/products/microscope-software/p/leica-las-x-ls/ | |
| Microsoft Excel | Microsoft Office | https://www.microsoft.com/excel | |
| Prism9 (Statistical Analysis Software) | GraphPad Software | https://www.graphpad.com | |
| Other | |||
| 35 mm Dish, No. 1.5 Coverslip, 20 mm Glass Diameter, Uncoated | MatTek | P35G-1.5-20-C | |
| Cage Incubator (Environmental Chamber) | Okolab | https://www.oko-lab.com/cage-incubator | |
| DMiL Inverted Microscope | Leica | N/A | |
| LIGHTNING Deconvolution Software | Leica | N/A | |
| STELLARIS 8 confocal microscope | Leica | N/A |
References
- Spinelli, J. B., Haigis, M. C. The multifaceted contributions of mitochondria to cellular metabolism. Nature Cell Biology. 20 (7), 745-754 (2018).
- West, A. P., Shadel, G. S., Ghosh, S. Mitochondria in innate immune responses. Nature Reviews. Immunology. 11 (6), 389-402 (2011).
- Seth, R. B., Sun, L., Ea, C. K., Chen, Z. J. Identification and characterization of MAVS, a mitochondrial antiviral signaling protein that activates NF-kappaB and IRF 3. Cell. 122 (5), 669-682 (2005).
- Tait, S. W. G., Green, D. R. Mitochondria and cell signalling. Journal of Cell Science. 125, 807-815 (2012).
- Antico Arciuch, V. G., Elguero, M. E., Poderoso, J. J., Carreras, M. C. Mitochondrial regulation of cell cycle and proliferation. Antioxidants and Redox Signaling. 16 (10), 1150-1180 (2012).
- Grunewald, A., Kumar, K. R., Sue, C. M. New insights into the complex role of mitochondria in Parkinson’s disease. Progress in Neurobiology. 177, 73-93 (2019).
- Borsche, M., Pereira, S. L., Klein, C., Grunewald, A. Mitochondria and Parkinson’s disease: clinical, molecular, and translational aspects. Journal of Parkinson’s Disease. 11 (1), 45-60 (2021).
- Ou, Z., et al. Global trends in the incidence, prevalence, and years lived with disability of Parkinson’s disease in 204 countries/territories from 1990 to 2019. Frontiers in Public Health. 9, 776847 (2021).
- Martinez-Vicente, M. Neuronal mitophagy in neurodegenerative diseases. Frontiers in Molecular Neuroscience. 10, 64 (2017).
- Youle, R. J., Narendra, D. P. Mechanisms of mitophagy. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 12 (1), 9-14 (2011).
- Villa, E., Marchetti, S., Ricci, J. E. No Parkin zone: mitophagy without Parkin. Trends in Cell Biology. 28 (11), 882-895 (2018).
- Geisler, S., et al. The PINK1/Parkin-mediated mitophagy is compromised by PD-associated mutations. Autophagy. 6 (7), 871-878 (2010).
- Kane, L. A., et al. PINK1 phosphorylates ubiquitin to activate Parkin E3 ubiquitin ligase activity. The Journal of Cell Biology. 205 (2), 143-153 (2014).
- Koyano, F., et al. Ubiquitin is phosphorylated by PINK1 to activate parkin. Nature. 510 (7503), 162-166 (2014).
- Ordureau, A., et al. Defining roles of PARKIN and ubiquitin phosphorylation by PINK1 in mitochondrial quality control using a ubiquitin replacement strategy. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (21), 6637-6642 (2015).
- Ordureau, A., et al. Quantitative proteomics reveal a feedforward mechanism for mitochondrial PARKIN translocation and ubiquitin chain synthesis. Molecular Cell. 56 (3), 360-375 (2014).
- Kitada, T., et al. Mutations in the parkin gene cause autosomal recessive juvenile parkinsonism. Nature. 392 (6676), 605-608 (1998).
- Valente, E. M., et al. PARK6 is a common cause of familial parkinsonism. Neurological Sciences. 23, S117-S118 (2002).
- Matsuda, N., et al. PINK1 stabilized by mitochondrial depolarization recruits Parkin to damaged mitochondria and activates latent Parkin for mitophagy. The Journal of Cell Biology. 189 (2), 211-221 (2010).
- Sriram, S. R., et al. Familial-associated mutations differentially disrupt the solubility, localization, binding and ubiquitination properties of parkin. Human Molecular Genetics. 14 (17), 2571-2586 (2005).
- Vives-Bauza, C., et al. PINK1-dependent recruitment of Parkin to mitochondria in mitophagy. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (1), 378-383 (2010).
- Wong, Y. C., Holzbaur, E. L. F. Optineurin is an autophagy receptor for damaged mitochondria in parkin-mediated mitophagy that is disrupted by an ALS-linked mutation. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (42), E4439-E4448 (2014).
- Bertolin, G., et al. Parkin maintains mitochondrial levels of the protective Parkinson’s disease-related enzyme 17-beta hydroxysteroid dehydrogenase type 10. Cell Death and Differentiation. 22 (10), 1563-1576 (2015).
- Crowley, L. C., Christensen, M. E., Waterhouse, N. J. Measuring mitochondrial transmembrane potential by TMRE staining. Cold Spring Harbor Protocols. 2016 (12), (2016).
- Kuznetsov, A. V., et al. Mitochondrial ROS production under cellular stress: comparison of different detection methods. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 400 (8), 2383-2390 (2011).
- Moore, A. S., Holzbaur, E. L. F. Dynamic recruitment and activation of ALS-associated TBK1 with its target optineurin are required for efficient mitophagy. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (24), E3349-E3358 (2016).
- Evans, C. S., Holzbaur, E. L. F. Degradation of engulfed mitochondria is rate-limiting in Optineurin-mediated mitophagy in neurons. eLife. 9, e50260 (2020).
- Jacobsen, L. B., Calvin, S. A., Colvin, K. E., Wright, M. FuGENE 6 Transfection Reagent: the gentle power. Methods. 33 (2), 104-112 (2004).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Mitra, K., Lippincott-Schwartz, J. Analysis of mitochondrial dynamics and functions using imaging approaches. Current Protocols in Cell Biology. , 1-21 (2010).
- Lin, H. C., Liu, S. Y., Lai, H. S., Lai, I. R. Isolated mitochondria infusion mitigates ischemia-reperfusion injury of the liver in rats. Shock. 39 (3), 304-310 (2013).
- Kholmukhamedov, A., Schwartz, J. M., Lemasters, J. J. Isolated mitochondria infusion mitigates ischemia-reperfusion injury of the liver in rats: mitotracker probes and mitochondrial membrane potential. Shock. 39 (6), 543 (2013).
- Thorn, K. Genetically encoded fluorescent tags. Molecular Biology of the Cell. 28 (7), 848-857 (2017).
- Pavel, M., et al. Contact inhibition controls cell survival and proliferation via YAP/TAZ-autophagy axis. Nature Communications. 9 (1), 2961 (2018).
- Rossignol, R., et al. Energy substrate modulates mitochondrial structure and oxidative capacity in cancer cells. Cancer Research. 64 (3), 985-993 (2004).
- Schornack, P. A., Gillies, R. J. Contributions of cell metabolism and H+ diffusion to the acidic pH of tumors. Neoplasia. 5 (2), 135-145 (2003).
- Christensen, M. E., Jansen, E. S., Sanchez, W., Waterhouse, N. J. Flow cytometry based assays for the measurement of apoptosis-associated mitochondrial membrane depolarisation and cytochrome c release. Methods. 61 (2), 138-145 (2013).
- Muller, B., et al. Application of extracellular flux analysis for determining mitochondrial function in mammalian oocytes and early embryos. Scientific Reports. 9 (1), 16778 (2019).
- Connolly, N. M. C., et al. Guidelines on experimental methods to assess mitochondrial dysfunction in cellular models of neurodegenerative diseases. Cell Death and Differentiation. 25 (3), 542-572 (2018).
- Demine, S., Renard, P., Arnould, T. Mitochondrial uncoupling: a key controller of biological processes in physiology and diseases. Cells. 8 (8), 795 (2019).
- Narendra, D., Tanaka, A., Suen, D. F., Youle, R. J. Parkin is recruited selectively to impaired mitochondria and promotes their autophagy. The Journal of Cell Biology. 183 (5), 795-803 (2008).
- Kwak, S. H., Park, K. S., Lee, K. U., Lee, H. K. Mitochondrial metabolism and diabetes. Journal of Diabetes Investigation. 1 (5), 161-169 (2010).
- Reddy, P. H. Role of mitochondria in neurodegenerative diseases: mitochondria as a therapeutic target in Alzheimer’s disease. CNS Spectrums. 14 (8), 8-13 (2009).
- Wang, W., Zhao, F., Ma, X., Perry, G., Zhu, X. Mitochondria dysfunction in the pathogenesis of Alzheimer’s disease: recent advances. Molecular Neurodegeneration. 15 (1), 30 (2020).
- Baloyannis, S. J. Mitochondrial alterations in Alzheimer’s disease. Journal of Alzheimer’s Disease. 9 (2), 119-126 (2006).
- Wallace, D. C. Mitochondria and cancer. Nature Reviews. Cancer. 12 (10), 685-698 (2012).
- Middleton, P., Vergis, N. Mitochondrial dysfunction and liver disease: role, relevance, and potential for therapeutic modulation. Therapeutic Advances in Gastroenterology. 14, 17562848211031394 (2021).
