Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

القياس الكمي القائم على التألق لإمكانات غشاء الميتوكوندريا ومستويات الأكسيد الفائق باستخدام التصوير المباشر في خلايا هيلا

Published: May 12, 2023 doi: 10.3791/65304
Automatic Translation
1, 1
1Department of Cell Biology, Duke University Medical Center

Summary

تصف هذه التقنية سير عمل فعال لتصور وقياس إمكانات غشاء الميتوكوندريا ومستويات الأكسيد الفائق داخل خلايا هيلا باستخدام التصوير الحي القائم على التألق.

Abstract

الميتوكوندريا عضيات ديناميكية ضرورية للاتزان الداخلي الأيضي من خلال التحكم في إنتاج الطاقة عن طريق تخليق الأدينوسين الثلاثي الفوسفات (ATP). لدعم التمثيل الغذائي الخلوي ، تتعاون آليات مراقبة جودة الميتوكوندريا المختلفة للحفاظ على شبكة ميتوكوندريا صحية. أحد هذه المسارات هو الميتوفاجي ، حيث يسهل كيناز 1 الناجم عن PTEN (PINK1) و Parkin phospho-ubiquitination للميتوكوندريا التالفة عزل البلعمة الذاتية والإزالة اللاحقة من الخلية عن طريق اندماج الليزوزوم. الميتوفاجي مهم للاتزان الخلوي ، وترتبط الطفرات في باركين بمرض باركنسون (PD). بسبب هذه النتائج ، كان هناك تركيز كبير على التحقيق في تلف الميتوكوندريا ودورانها لفهم الآليات الجزيئية وديناميكيات مراقبة جودة الميتوكوندريا. هنا ، تم استخدام تصوير الخلايا الحية لتصور شبكة الميتوكوندريا لخلايا HeLa ، لتحديد إمكانات غشاء الميتوكوندريا ومستويات الأكسيد الفائق بعد العلاج باستخدام سيانيد الكربونيل m-chlorophenyl hydrazone (CCCP) ، وهو عامل فك ارتباط الميتوكوندريا. بالإضافة إلى ذلك ، تم التعبير عن طفرة مرتبطة بمرض باركين (ParkinT240R) والتي تثبط الميتوفاجي المعتمد على باركين لتحديد كيفية تأثير التعبير الطافر على شبكة الميتوكوندريا مقارنة بالخلايا التي تعبر عن باركين من النوع البري. يصف البروتوكول الموضح هنا سير عمل بسيط باستخدام مناهج قائمة على التألق لتحديد إمكانات غشاء الميتوكوندريا ومستويات الأكسيد الفائق بشكل فعال.

Introduction

شبكة الميتوكوندريا عبارة عن سلسلة من العضيات المترابطة التي تلعب دورا حاسما في إنتاج الطاقة1 ، والمناعة الفطرية2,3 ، وإشارات الخلية 4,5. ارتبط عدم تنظيم الميتوكوندريا بالأمراض التنكسية العصبية مثل مرض باركنسون (PD)6,7. PD هو اضطراب تنكسي عصبي تدريجي يؤثر على الخلايا العصبية الدوبامينية للمادة السوداء التي تؤثر على ما يقرب من 10 ملايين شخص في جميع أنحاء العالم8. تم ربط PD وراثيا ب mitophagy ، وهو مسار لمراقبة جودة الميتوكوندريا ضروري للحفاظ على التوازن الخلوي الذي يزيل بشكل انتقائي الميتوكوندرياالتالفة 9,10. حددت الدراسات العديد من مسارات الميتوفاجي المستقلة ، بما في ذلك مجال FUN14 الذي يحتوي على ميتوفاجي بوساطة 1 (FUNDC1) ، وبروتين Bcl-2 المتفاعل 3 (BNIP3) الميسر ، والميتوفاجي المعتمد على NIX ، والكيناز 1 الناجم عن PTEN (PINK1) / الميتوفاجي المنظم بمرض باركين10،11. يعمل PINK1 (كيناز مفترض) وباركين (E3 ubiquitin ligase) جنبا إلى جنب مع الميتوكوندريا التالفة من فوسفو-يوبيكوتينات ، والتي تدفع إلى تكوين البلعمة الذاتية التي تبتلع العضية التالفة وتندمج مع الليزوزومات لبدء التدهور12،13،14،15،16. ارتبطت الطفرات في باركين بالأنماط الظاهرية المرتبطة بمرض باركين مثل التنكس العصبي عن طريق فقدان الخلايا العصبية الدوبامينية17,18.

هنا ، يتم وصف بروتوكول تستخدم فيه خلايا HeLa ، وهي خلايا خلدة تستخدم بشكل روتيني مشتقة من سرطان عنق الرحم ، للتحقيق في دور Parkin في الحفاظ على صحة شبكة الميتوكوندريا. تعبر خلايا هيلا عن مستويات ضئيلة من باركين داخلي المنشأ وبالتالي تتطلب تعبير باركين خارجيالمنشأ 19. لدراسة دور باركين في صحة شبكة الميتوكوندريا ، يتم نقل خلايا هيلا إما باستخدام باركين من النوع البري (ParkinWT) ، أو متحور باركين (ParkinT240R) ، أو ناقل تحكم فارغ. ParkinT240R هو طفرة وراثية جسدية متنحية في مرض باركنسون الأحداث تؤثر على نشاط Parkin E3 ligase ، مما يقلل بشكل كبير من كفاءة مسار الميتوفاجي20. تخضع خلايا هيلا لتركيزات خفيفة (5 ميكرومتر) أو شديدة (20 ميكرومتر) من سيانيد الكربونيل م-كلوروفينيل هيدرازون (CCCP) ، وهو عامل فصل الميتوكوندريا. يستخدم العلاج بتركيزات شديدة من CCCP بشكل روتيني للحث على الميتوفاجي بوساطة باركين في خطوط الخلايا المختلفة ، مثل خلايا HeLa و COS-721،22،23.

بعد العلاج ، يستخدم البروتوكول التصوير الحي لشبكة الميتوكوندريا باستخدام اثنين من الأصباغ الفلورية المستهدفة للميتوكوندريا المتاحة حاليا. رباعي ميثيل رودامين ، إستر الإيثيل ، بيركلورات (TMRE) عبارة عن صبغة كاتيونية تتألق بناء على إمكانات غشاء الميتوكوندريا24 ، في حين أن MitoSOX هو مؤشر فائق أكسيد الميتوكوندريا حيث تكون شدة التألق دالة لتركيز الأكسيد الفائق25. أخيرا ، يستخدم البروتوكول المبين تقديرا كميا قائما على التألق وسير عمل بسيط لتحديد إمكانات غشاء الميتوكوندريا ومستويات الأكسيد الفائق بشكل فعال مع الحد الأدنى من نطاق تحيز المستخدم. على الرغم من أن هذا البروتوكول تم تصميمه لدراسة وظيفة الميتوكوندريا في خلايا هيلا ، إلا أنه يمكن تكييفه مع خطوط الخلايا الإضافية وأنواع الخلايا الأولية لتوصيف صحة شبكة الميتوكوندريا كميا.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. تحضير العينات البيولوجية

ملاحظة: نفذ الخطوات التالية باستخدام تقنية معقمة في خزانة السلامة البيولوجية. رش سطح الخزانة وجميع المواد بنسبة 70 ٪ من الإيثانول.

  1. زراعة خلايا هيلا ونقلها
    1. استزرع 30000 خلية هيلا في وسط النسر المعدل (DMEM) من Dulbecco تحتوي على 4.5 جم / لتر من الجلوكوز المكمل بمصل بقري جنيني بنسبة 10٪ ومحلول L-glutamine بنسبة 1٪ (HeLa media ؛ انظر جدول المواد). ضع الخلايا على أطباق تصوير ذات قاع زجاجي مقاس 35 مم (انظر Table of Materials) تحتوي على 2 مل من وسائط HeLa المسخنة مسبقا. الحفاظ على مزارع هيلا عند 5٪ CO2 و 37 درجة مئوية26,27.
    2. في اليوم التالي للطلاء ، افحص أطباق التصوير مقاس 35 مم باستخدام مجهر ضوئي للتأكد من أن الخلايا ~ 50٪ -60٪ متقاربة. بمجرد أن تتلاقى ، قم بنقل خلايا HeLa بناقل البروتين الفلوري الأصفر الفارغ (YFP) ، أو YFP-ParkinWT ، أو YFP-ParkinT240R (الشكل 1 أ).
    3. تحضير خليطين منفصلين في أنابيب الطرد المركزي الدقيقة المعقمة لكل عملية نقل. امزج عن طريق النقر على الأنبوب أو سحب الإصبع برفق لأعلى ولأسفل.
      1. في الأنبوب 1 ، امزج 200 ميكرولتر من وسائط المصل المختزلة (انظر جدول المواد) مع 2 ميكروغرام من الحمض النووي البلازميدي.
      2. في الأنبوب 2 ، امزج 200 ميكرولتر من وسائط المصل المختزلة مع 6 ميكرولتر من كاشف النقل (انظر جدول المواد)28.
    4. احتضان الأنابيب لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة (RT). أضف الأنبوب 2 إلى الأنبوب 1 ، واخلطه عن طريق السحب لأعلى ولأسفل ، واحتضنه لمدة 20 دقيقة في RT.
    5. أضف مجمعات النقل بالتنقيط إلى أطباق التصوير الموجودة التي تحتوي على مزارع خلايا هيلا ، مما يضمن التوزيع المتساوي عبر الطبق بأكمله. ضع أطباق التصوير في حاضنة CO2 و 37 درجة مئوية بنسبة 5٪ طوال الليل.
      ملاحظة: قم بتسمية كل طبق بالبلازميد المنقول المناسب. لكل تجربة ، قم بتسمية أطباق YFP-ParkinWT الثلاثة (ثنائي ميثيل سلفوكسيد [DMSO ؛ انظر جدول المواد] ، 5 ميكرومتر CCCP ، و 20 ميكرومتر CCCP). كرر وضع العلامات مع أطباق YFP-ParkinT240R الثلاثة وأطباق ناقلات YFP الثلاثة الفارغة.
  2. تحضير CCCP والأصباغ الفلورية
    تنبيه: غالبا ما تكون الأصباغ الفلورية حساسة للضوء. قم بتخزين الأصباغ في الظلام باستخدام رقائق الألومنيوم أو أنابيب الطرد المركزي البنية لتقليل التعرض للضوء.
    1. اصنع مخزونا عاملا قدره 5 مللي متر من CCCP (انظر جدول المواد) عن طريق إذابة 5 مجم من CCCP في 4.89 مل من DMSO. اصنع مخزونا عاملا قدره 20 مللي متر من CCCP عن طريق إذابة 5 مجم من CCCP في 1.22 مل من DMSO.
    2. قم بتخفيف 10 ميكرولتر من محلول مخزون MitoTracker Deep Red (انظر جدول المواد) 1 مللي متر في 390 ميكرولتر من DMSO لعمل مخزون عامل 25 ميكرومتر.
    3. قم بإذابة 50 ميكروغرام من MitoSOX Red25 (انظر جدول المواد) في 13 ميكرولتر من DMSO لإنشاء مخزون عامل 5 مللي متر.
    4. قم بإذابة 10 مجم من TMRE24 (انظر جدول المواد) في 19.4 مل من DMSO لعمل محلول مخزون 1 mM. قم بتخفيف TMRE بإضافة 10 ميكرولتر من 1 mM TMRE إلى 990 μL من DMSO لعمل مخزون عامل 10 ميكرومتر.

2. علاج CCCP ووضع العلامات على الميتوكوندريا مع مجسات الفلورسنت في خلايا هيلا

تنبيه: قم بتنفيذ الخطوات التالية بسرعة للتأكد من عدم خروج خلايا هيلا من الحاضنة لفترة طويلة.

  1. في اليوم التالي للتحويل ، أضف 2 ميكرولتر من 5 أو 20 mM CCCP (التركيز النهائي: 5 ميكرومتر و 20 ميكرومتر ، على التوالي) إلى كل لوحة تجريبية. بالنسبة للوحات التحكم ، أضف 2 ميكرولتر من DMSO. أعد الألواح إلى حاضنة CO2 و 37 درجة مئوية بنسبة 5٪ لمدة 1.5 ساعة (الشكل 1 أ).
    ملاحظة: علاج CCCP هو لمدة 2 ساعة. ومع ذلك ، يتم تمييز الميتوكوندريا بمجسات الفلورسنت خلال آخر 30 دقيقة من علاج CCCP.
  2. بعد 1.5 ساعة ، قم بإزالة الألواح من الحاضنة وإضافة مجسات الفلورسنت إلى أطباق التصوير. أعد الألواح إلى حاضنة CO2 و 37 درجة مئوية بنسبة 5٪ لمدة 30 دقيقة (الشكل 1 أ).
    1. تجربة TMRE: أضف 2 ميكرولتر من 25 ميكرومتر MitoTracker (التركيز النهائي: 25 نانومتر) و 2 ميكرولتر من 10 ميكرومتر TMRE (التركيز النهائي: 10 نانومتر).
    2. تجربة MitoOX: أضف 2 ميكرولتر من 25 ميكرومتر MitoTracker (التركيز النهائي: 25 نانومتر) و 1 ميكرولتر من 5 مللي متر MitoSOX (التركيز النهائي: 2.5 ميكرومتر).
  3. بعد علاج CCCP لمدة ساعتين ، قم بإعداد خلايا HeLa للتصوير (الشكل 1A ، B).
    1. تجربة TMRE: خلايا هيلا جاهزة على الفور للتصوير. ضمان بقاء TMRE في وسط زراعة خلايا هيلا.
    2. تجربة MitoSOX: اغسل الخلايا 3x ب 2 مل من وسائط HeLa المسخنة مسبقا لإزالة صبغة MitoSOX المجانية. أضف 2 مل من الوسائط الدافئة مسبقا. خلايا هيلا جاهزة الآن للتصوير.
      ملاحظة: غسل خلايا هيلا بوسائط هيلا طازجة ومسخنة مسبقا تحتوي على نفس تركيز DMSO أو CCCP مثل الحالة التجريبية ؛ لا تقم بتضمين MitoSOX أو MitoTracker.

3. إعداد الحصول على صورة المجهر البؤري

ملاحظة: قم بتصوير خلايا HeLa باستخدام مجهر متحد البؤر (انظر جدول المواد) مزود بهدف غمر الزيت بفتحة رقمية 63x / 1.40 (NA) وغرفة بيئية (انظر جدول المواد).

  1. في 1 ساعة قبل التصوير ، قم بتشغيل CO2 عن طريق فتح صمام الخزان. اضغط على الزر تشغيل لتشغيل وحدة التحكم البيئية للمجهر. استخدم السهمين لأعلى ولأسفل على لوحة اللمس لضبط درجة الحرارة على 37 درجة مئوية وثاني أكسيد الكربونمن 2 إلى 5٪. اضغط على تعيين عند الانتهاء.
    ملاحظة: تأكد من إغلاق أبواب الغرفة البيئية وانتظر استقرار الظروف.
  2. إعدادات الليزر
    1. قم بتشغيل ليزر الضوء الأبيض (WLL) واضبط طاقة الليزر على 85٪ والتحكم في الإثارة على أقصى طاقة. انقر فوق علامة التبويب اكتساب، وحدد إضافة ليزر، وفي مربع الحوار الذي يظهر، قم بتبديل WLL إلى تشغيل. انقر فوق الزر طاقة الليزر وأدخل 85٪. انقر فوق الزر "التحكم في الإثارة" وحدد الطاقة القصوى من القائمة المنسدلة (الشكل 2 أ).
    2. تجربة TMRE: اضبط أطياف الإثارة والانبعاث ل YFP و MitoTracker و TMRE.
      1. بالنسبة ل YFP ، اضبط ليزر الإثارة على 514 نانومتر ونافذة أطياف الانبعاث على 524-545 نانومتر. في ال اكتساب علامة التبويب، انقر فوق إضافة إعداد جديد زر؛ ثم انقر فوق إضافة ليزر واسحبه إلى الإعداد 1. انقر نقرا مزدوجا فوق خط الإثارة وأدخل 514 كطول موجي في مربع الحوار. انقر نقرا مزدوجا فوق الكاشف المقابل وأدخل 524 للبداية و 545 لطول الموجة النهائية.
      2. بالنسبة إلى MitoTracker Deep Red ، اضبط ليزر الإثارة على 641 ونافذة أطياف الانبعاث على 650-750 نانومتر. في علامة التبويب اكتساب ، انقر فوق الزر "إضافة ليزر" واسحبه إلى الإعداد 1. انقر نقرا مزدوجا فوق خط الإثارة وأدخل 641 كطول موجي في مربع الحوار. انقر نقرا مزدوجا فوق الكاشف المقابل وأدخل 650 للبداية و 750 للطول الموجي النهائي.
      3. بالنسبة ل TMRE ، اضبط ليزر الإثارة على 555 نانومتر ونافذة أطياف الانبعاث على 557-643 نانومتر. في ال اكتساب علامة التبويب، انقر فوق إضافة إعداد جديد زر؛ ثم ، انقر فوق أضف ليزر زر واسحبه إلى الإعداد 2. انقر نقرا مزدوجا فوق خط الإثارة وأدخل 555 كطول موجي في مربع الحوار. انقر نقرا مزدوجا فوق الكاشف المقابل وأدخل 557 للبداية و 643 لطول موجة النهاية.
    3. تجربة ميتو سوكس: اضبط أطياف الإثارة والانبعاث ل YFP و MitoTracker و MitoSOX (الشكل 2 ب).
      1. بالنسبة ل YFP ، اضبط ليزر الإثارة على 507 نانومتر ونافذة أطياف الانبعاث على 517-540 نانومتر. في ال اكتساب علامة التبويب، انقر فوق إضافة إعداد جديد زر؛ ثم ، انقر فوق إضافة ليزر زر واسحبه إلى الإعداد 1. انقر نقرا مزدوجا فوق خط الإثارة وأدخل 507 كطول موجي في مربع الحوار. انقر نقرا مزدوجا فوق الكاشف المقابل وأدخل 517 للبداية و 540 لطول موجة النهاية.
      2. بالنسبة ل MitoSOX ، اضبط ليزر الإثارة على 547 نانومتر ونافذة أطياف الانبعاث على 564-636 نانومتر. في ال اكتساب علامة التبويب، انقر فوق إضافة إعداد جديد زر؛ ثم ، انقر فوق أضف ليزر زر واسحبه إلى الإعداد 2. انقر نقرا مزدوجا فوق خط الإثارة وأدخل 547 كطول موجي في مربع الحوار. انقر نقرا مزدوجا فوق الكاشف المقابل وأدخل 564 للبداية و 636 للطول الموجي النهائي.
      3. بالنسبة إلى MitoTracker Deep Red ، اضبط ليزر الإثارة على 641 نانومتر ونافذة أطياف الانبعاث على 652-742 نانومتر. في ال اكتساب علامة التبويب، انقر فوق إضافة إعداد جديد زر؛ انقر على إضافة ليزر زر واسحبه إلى الإعداد 3. انقر نقرا مزدوجا فوق خط الإثارة وأدخل 641 كطول موجي في مربع الحوار. انقر نقرا مزدوجا فوق الكاشف المقابل وأدخل 652 للبداية و 742 لطول موجة النهاية.
  3. إعدادات الحصول على الصور (الشكل 2C)
    1. اضبط التنسيق على 1024 × 1024 ، وسرعة المسح الضوئي على 600 هرتز ، ومتوسط الخط على 3.
      1. حدد علامة التبويب اكتساب وانقر فوق الزر تنسيق . من القائمة المنسدلة، حدد 1024 × 1024. انقر فوق الزر "سرعة" وحدد 600 من القائمة المنسدلة. ثم ، انقر فوق متوسط الخط زر ، ومن القائمة المنسدلة ، حدد 3.
      2. قم بتشغيل المسح ثنائي الاتجاه واضبط عامل الطور والتكبير / التصغير على 22.61 و 1.50 على التوالي.
        1. في علامة التبويب اكتساب، قم بتبديل الزر ثنائي الاتجاه إلى تشغيل. انقر فوق إعداد Phase X واضبطه على 22.61. انقر فوق إعداد عامل التكبير واضبطه على 1.50.

4. الحصول على الصور

تنبيه: يجب على المجرب إصدار حكم مرئي لتحديد الخلايا بناء على إشارة مضان YFP. تجنب وحدات البكسل المفرطة التشبع ، لأنها يمكن أن تؤثر بشكل كبير على تحديد كثافة التألق. استخدم جدول بحث فوق/أقل يشير إلى تشبع البكسل لتجنب الحصول على صور مشبعة.

  1. انقر فوق إعداد الاهتمام واضغط على Fast Live لتوفير معاينة مباشرة للصورة الفلورية.
  2. اضبط الكسب والشدة بالنقر المزدوج على الكاشف المقابل. في مربع الحوار الذي يظهر، اضبط ملف كسب باستخدام شريط التمرير. لتغيير الشدة ، انقر نقرا مزدوجا فوق خط الإثارة واستخدم السهمين لأعلى ولأسفل في النافذة المنبثقة لتغيير الشدة. انقر فوق إيقاف لإنهاء المعاينة.
    1. تجربة TMRE: صور لوحة التحكم DMSO أولا. اضبط كسب وشدة إشارة TMRE (الإعداد 2) بحيث تكون كثافة شبكة الميتوكوندريا أقل بقليل من التشبع ؛ حافظ على الكسب والشدة ثابتين للتجربة. اضبط كسب وشدة MitoTracker و YFP (الإعداد 1) بحيث تكون شبكة الميتوكوندريا مرئية ولكنها خافتة.
    2. تجربة MitoOX: صور لوحة تحكم DMSO أولا. اضبط كسب وشدة إشارة MitoSOX (الإعداد 2) بحيث يكون التألق مرئيا ولكنه خافت ؛ حافظ على الكسب والشدة ثابتين للتجربة. اضبط كسب وشدة YFP (الإعداد 1) و MitoTracker (الإعداد 3) بحيث تكون شبكة الميتوكوندريا مرئية ولكنها خافتة.
      ملاحظة: سجل كسب وشدة TMRE و MitoSOX ، حيث يجب أن تظل هذه القيم ثابتة طوال التجربة. لا يتم تحديد إشارات مضان YFP و MitoTracker في هذا البروتوكول. لذلك ، يمكن ضبط الكسب والشدة لكل صورة. من الأكثر فعالية أن يكون لديك إعدادات الكسب والشدة حيث يسهل رؤية الخلايا ولكنها لا تزال خافتة ، لضمان عدم تعرض الخلايا لشدة الليزر المفرطة التي تسبب تلف الخلايا أو التبييض الضوئي.
  3. بمجرد اكتمال إعدادات الكسب والشدة ، انقر فوق ابدأ للحصول على صورة. الحصول على صور من 20 خلية لكل حالة تجريبية (على سبيل المثال ، خمس صور مع أربع خلايا لكل صورة ؛ الشكل 2 د).

5. القياس الكمي لشدة التألق باستخدام ImageJ

ملاحظة: يتم حفظ ملفات التصوير ك ".lif" وتكون متوافقة مع ImageJ29. يتم تحديد أنواع الملفات المتوافقة مع ImageJ على موقع الويب الخاص بهم. قد يكون من الضروري تحويل نوع الملف إذا كان غير متوافق.

  1. إنشاء منطقة اهتمام (ROI) وحفظها.
    1. في ImageJ، انقر على ملف | جديد | صورة. في مربع الحوار الذي يظهر، انقر فوق موافق.
    2. انقر زر أداة المستطيل وارسم مربع 6 ميكرون × 6 ميكرون. افتح مدير عائد الاستثمار بالنقر فوق تحليل | أدوات | مدير عائد الاستثمار وانتظر ظهور مربع حوار مع مدير عائد الاستثمار (الشكل 3 أ). أضف عائد الاستثمار المستطيل إلى المدير بالنقر فوق إضافة في مربع الحوار مدير. احفظ عائد الاستثمار عن طريق تحديد المزيد ، ثم انقر فوق الزر حفظ وموافق.
  2. قياس شدة مضان.
    1. في الصورة J، انقر فوق ملف وحدد فتح. في الشاشة، حدد ملفات التصوير للتجربة وانقر فتح.
    2. انتظر حتى تظهر نافذة خيارات استيراد التنسيقات الحيوية (الشكل 3 ب). حدد تقسيم القنوات وانقر فوق فتح.
      ملاحظة: تسمح ميزة تقسيم القنوات بفتح كل قناة في الصورة كنافذة منفصلة. يتوافق أمر القناة مع أمر الاستحواذ.
      1. تجارب TMRE: YFP (الإعداد 1) هو القناة الأولى (c = 0) ؛ MitoTracker (الإعداد 1) هي القناة الثانية (c = 1) ؛ و TMRE (الإعداد 2) هي القناة الثالثة (c = 2).
      2. تجارب MitoSOX: YFP (الإعداد 1) هي القناة الأولى (c = 0) ؛ MitoSOX (الإعداد 2) هي القناة الثانية (c = 1) ؛ و MitoTracker (الإعداد 3) هي القناة الثالثة (c = 2).
    3. اضبط السطوع عن طريق تحديد صورة | ضبط | السطوع (الشكل 3 ج).
      ملاحظة: لا تضغط على Set أو Apply (تطبيق) لضمان عدم تغيير سطوع الصورة بشكل دائم. في بعض الأحيان ، لا تكون شدة التألق مرئية في قنوات TMRE أو MitoSOX. اضبط السطوع للسماح بتصور أسهل. لا يؤثر تغيير السطوع على قيم شدة التألق الخام.
    4. انقر فوق تحليل وحدد تعيين القياسات. حدد مربعات المساحة ومتوسط القيمة الرمادية وانقر فوق "موافق " (الشكل 3 د).
      ملاحظة: متوسط القيمة الرمادية هو شدة التألق.
    5. افتح مدير عائد الاستثمار وقم بتحميل عائد الاستثمار المحفوظ في الخطوة 5.1 بالنقر فوق تحليل | أدوات | مدير عائد الاستثمار. في مدير عائد الاستثمار، انقر على المزيد، ثم فتح من القائمة التي تظهر، وحدد عائد الاستثمار المحفوظ.
    6. قم بقياس شدة التألق لخمس مناطق عشوائية في خلية واحدة عن طريق تحديد عائد الاستثمار المحفوظ من مدير عائد الاستثمار ونقل عائد الاستثمار إلى موقع عشوائي داخل الخلية (الشكل 3E). قم بقياس شدة التألق بالضغط على M. كرر هذه الخطوة مع أربع مناطق إضافية غير متداخلة. عندما يظهر مربع حوار يحتوي على المساحة ومتوسط القيم الرمادية (الشكل 3F) ، انسخ القيم والصقها في جدول بيانات لتحليلها.
      1. تجربة TMRE : حدد الصورة (c = 2).
      2. تجربة MitoOX: حدد الصورة (c = 2).
    7. احصل على متوسط قيم شدة التألق. باستخدام برنامج جداول البيانات (انظر جدول المواد) ، قم بحساب متوسط القيم الرمادية الخمسة. كرر هذه العملية لكل خلية.
    8. تحليل ومقارنة TMRE أو MitoSOX متوسط القيم الرمادية عبر الظروف التجريبية باستخدام برنامج إحصائي (انظر جدول المواد; الشكل 4 والشكل 5). تقديم البيانات كرسوم بيانية شريطية أو مخططات كمان.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

في هذا البروتوكول ، تم استخدام القياس الكمي القائم على التألق لقياس إمكانات الغشاء ومستويات الأكسيد الفائق لشبكة الميتوكوندريا بعد معالجة CCCP (الشكل 1). استخدم سير العمل هذا خلايا هيلا ، وهي خط خلوي خالد مشتق من سرطان عنق الرحم. تستخدم خلايا هيلا بشكل روتيني لدراسة بيولوجيا الميتوكوندريا وهي مسطحة نسبيا ، مما يجعل من السهل تصور شبكة الميتوكوندريا باستخدام الفحص المجهري. للتحقيق في دور Parkin في الحفاظ على صحة شبكة الميتوكوندريا ، تم نقل خلايا HeLa بشكل عابر باستخدام ناقل تحكم فارغ ، ParkinWT ، أو ParkinT240R (متحولة تعطل الميتوفاجي)21. تم طلاء خلايا HeLa في أطباق تصوير ذات قاع زجاجي 35 مم وتم نقلها بمجرد الوصول إلى التقاء ~ 50٪ -60٪ (الشكل 1 أ). نظرا لأن خلايا هيلا تنقسم بسرعة ، فعادة ما يكون هذا هو اليوم التالي لطلاء الخلايا في أطباق التصوير. تم استخدام مجهر ضوئي لمراقبة إشارة مضان YFP في اليوم التالي لتقييم كفاءة النقل. تم إجراء التجارب فقط بعد عملية نقل ناجحة.

بعد الفحص ، تمت معالجة خلايا HeLa بتركيزات خفيفة (5 ميكرومتر) أو شديدة (20 ميكرومتر) من CCCP لإزالة استقطاب شبكة الميتوكوندريا (تظهر الخطوة 1.2 تعليمات مفصلة لإعداد CCCP ومجسات الفلورسنت). تم إجراء علاج CCCP لمدة 2 ساعة. خلال آخر 30 دقيقة من علاج CCCP ، تم تمييز الميتوكوندريا ب MitoTracker و TMRE / MitoSOX (الشكل 1 أ). وتجدر الإشارة إلى أن TMRE و MitoSOX لهما أطياف مضان متداخلة ولا يمكن استخدامهما في وقت واحد. بدلا من ذلك ، استخدمنا أطباق تصوير منفصلة لتجارب TMRE و MitoSOX. بالنسبة لتجارب TMRE ، كانت خلايا HeLa جاهزة على الفور للتصوير في نهاية علاج CCCP لمدة 2 ساعة. ويجب أن يظل تركيز TMRE ثابتا؛ ولذلك، ظلت TMRE في وسائط الإعلام التابعة لهيلا. ومع ذلك ، يجب إزالة MitoSOX المجاني قبل التصوير. بالنسبة لتجارب MitoSOX ، تم غسل الخلايا ثلاث مرات باستخدام وسائط HeLa لإزالة الصبغة الحرة. في هذه الخطوة ، من الضروري استخدام وسائط HeLa التي تحتوي على نفس تركيز DMSO أو CCCP مثل الظروف التجريبية. تم استخدام Hoechst 33342 ، وهي علامة نوى ، في البداية لتقييم خلايا HeLa بعد النقل العابر ومعالجة CCCP (الشكل 1B).

بعد ذلك ، تم إجراء الفحص المجهري متحد البؤر لتصور شدة مضان TMRE و MitoSOX ، لقياس إمكانات غشاء الميتوكوندريا ومستويات الأكسيد الفائق ، على التوالي. تم الحصول على الصور باستخدام هدف غمر الزيت 63x (1.4 NA) مع معلمات المسح ثنائي الاتجاه ، ودقة مكانية تبلغ 1024 × 1024 بكسل ، وسرعة مسح تبلغ 600 هرتز ، ومتوسط خط 3 ، ومرحلة 22.61 ، وعامل تكبير 1.5 (الشكل 2C). تم تصوير لوحة التحكم DMSO أولا لجميع التجارب لتعيين قيم الكسب والشدة ل TMRE و MitoSOX. لإجراء مقارنات كمية عبر الظروف ، يجب تعيين هذه القيم في حالة DMSO وتظل ثابتة طوال التجربة. يحفز CCCP إزالة استقطاب الميتوكوندريا وفقدان إمكانات الغشاء ، مما يؤدي إلى تقليل شدة مضان TMRE. لذلك ، كان للتجارب الضابطة أعلى كثافة TMRE ، وتم تعيين قيم الكسب والشدة بالقرب من التشبع. في المقابل ، تزيد مستويات الأكسيد الفائق الأعلى من كثافة MitoSOX. لذلك ، كان للتحكم أقل كثافة مضان MitoSOX ، وتم تعيين قيم الكسب والشدة منخفضة حيث كانت هناك إشارة خافتة. نظرا لأن MitoTracker و TMRE و MitoSOX هي أصباغ حيوية وتسمية جميع الخلايا ، فلا ينبغي استخدامها عند تحديد الخلايا المراد تصويرها. بدلا من ذلك ، تم اختيار الخلايا بناء على إشارة YFP لضمان نقلها. تم الحصول على صور أحادية المستوى ، مع التركيز على الجزء السفلي من خلية هيلا ، حيث يوجد عدد كبير من الميتوكوندريا.

القياس الكمي لشدة مضان TMRE و MitoSOX
تم تحليل القياس الكمي لشدة مضان TMRE و MitoSOX باستخدام ImageJ (الشكل 3). تم إنشاء عائد استثمار 6 ميكرون × 6 ميكرون وتخزينه في مدير عائد الاستثمار. تم وضع عائد الاستثمار في خمس مناطق عشوائية غير متداخلة من كل خلية لقياس شدة TMRE أو MitoSOX. تتوافق شدة التألق مع متوسط القيمة الرمادية في ImageJ. تم حساب متوسط قيم الشدة الخمس لكل خلية لحساب متوسط شدة التألق لكل خلية. تم رسم هذه القيم وتحليلها للدلالة الإحصائية عبر ظروف العلاج.

تظهر نتائج شدة مضان TMRE و MitoSOX في الشكل 4 والشكل 5 ، على التوالي. كما هو متوقع ، أدى العلاج بعامل الفصل المعروف CCCP إلى تقليل شدة مضان TMRE مقارنة بظروف التحكم (الشكل 4 أ ، ب). بالإضافة إلى ذلك ، أدت المعالجة الشديدة (20 ميكرومتر) CCCP إلى إنتاج الأكسيد الفائق وزيادة شدة مضان MitoSOX (الشكل 5 أ ، ب). في ظروف إجهاد CCCP الخفيفة (5 ميكرومتر) ، أدى التعبير عن ParkinWT و ParkinT240R إلى كثافة TMRE أعلى مقارنة بناقل التحكم YFP الفارغ. وبالمثل ، كانت شدة MitoSOX أقل في الخلايا التي تعبر عن ParkinWT و ParkinT240R مقارنة بالخلايا التي تعبر عن ناقل التحكم YFP (الشكل 5A ، B). تشير هذه النتائج إلى أن تعبير باركين يساعد في الحفاظ على صحة شبكة الميتوكوندريا من خلال الحفاظ على إمكانات غشاء الميتوكوندريا الأعلى ومستويات الأكسيد الفائق المنخفضة. وبالتالي ، يمكن استخدام البروتوكول الموضح هنا لمقارنة شدة التألق بدقة لتحليل دور باركين في التحكم في إمكانات غشاء الميتوكوندريا وتكوين الأكسيد الفائق.

Figure 1
الشكل 1: سير العمل التجريبي . (أ) رسم تخطيطي لسير العمل التجريبي المستخدم لنقل شبكة الميتوكوندريا ومعالجتها باستخدام CCCP وتسميتها ، وصورة شدة مضان TMRE و MitoSOX في خلايا HeLa. (B) صور تمثيلية للخلايا التي تعبر عن متجه YFP فارغ (أعلى) ، YFP-ParkinWT (وسط) ، و YFP-ParkinT240R (أسفل ؛ أرجواني). يستخدم Hoechst 33342 (أبيض) لتسمية الحمض النووي. شريط المقياس = 10 ميكرومتر. الاختصارات: CCCP = سيانيد الكربونيل م-كلوروفينيل هيدرازون. TMRE = رباعي ميثيل رودامين - إيثيل استر - بيركلورات ؛ YFP = بروتين الفلورسنت الأصفر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: واجهة المستخدم لإعداد إعدادات اكتساب متحدة البؤر . ( أ) مربع حوار إعدادات الليزر. يبرز المستطيل الأحمر ليزر الضوء الأبيض وحالة الطاقة وطاقة الليزر والأطوال الموجية. (ب) إعداد قناة تجريبية لتجربة MitoSOX. يتم عرض الإعدادات وخطوط الإثارة ونوافذ أطياف الانبعاث ل YFP و MitoSOX و MitoTracker. (ج) تظهر إعدادات الاكتساب التنسيق والسرعة والاتجاهين والمرحلة X وعامل التكبير ومتوسط الخط. (د) صورة ممثل تم الحصول عليها. تعبر خلايا هيلا عن YFP (أرجواني) ، ويتم تمييز الميتوكوندريا ب MitoSOX (أخضر) و MitoTracker (سماوي). شريط المقياس = 10 ميكرومتر. الاختصارات: WLL = ليزر الضوء الأبيض. YFP = بروتين الفلورسنت الأصفر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: سير عمل ImageJ لتحديد شدة مضان TMRE و MitoSOX . (أ) لوحة مدير عائد الاستثمار مع مثال على عائد الاستثمار في ImageJ. (ب) لوحة خيارات استيراد التنسيقات الحيوية. يبرز المستطيل الأحمر خيار تقسيم القنوات الذي يجب تحديده. (ج) معلمات إعدادات السطوع والتباين. (د) ضبط معلمة القياسات. تبرز المستطيلات الحمراء خيارات المساحة ومتوسط القيمة الرمادية التي يجب تحديدها. (ه) صورة تمثيلية لخلية هيلا موسومة ب MitoSOX. يوضح المربع الأحمر عائد الاستثمار من اللوحة أ. شريط المقياس = 10 ميكرومتر. (F) لوحة النتائج التي تعرض المنطقة التجريبية ومتوسط القيم الرمادية من عائد الاستثمار. يمثل متوسط القيمة الرمادية (البرتقالي) قيم شدة التألق. الاختصارات: TMRE = رباعي ميثيل رودامين - إيثيل استر - بيركلورات ؛ عائد الاستثمار = منطقة الاهتمام. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: شدة مضان TMRE بعد تلف الميتوكوندريا. (أ) صور تمثيلية لخلايا هيلا بعد العلاج لمدة ساعتين باستخدام DMSO أو 5 μM CCCP أو 20 ميكرومتر CCCP للحث على تلف الميتوكوندريا. تعبر الخلايا خارجيا عن ناقل YFP فارغ ، YFP-ParkinWT ، أو YFP-ParkinT240R (أرجواني) ، ويتم تمييزها ب MitoTracker (سماوي) و TMRE (أخضر). شريط المقياس = 30 ميكرومتر. (ب) القياس الكمي لشدة مضان TMRE للخلايا التي تعبر عن ناقل YFP الفارغ (الأزرق) ، YFP-ParkinWT (البرتقالي) ، و YFP-ParkinT240R (الأرجواني) في الظروف المعالجة DMSO و CCCP. p < 0.0001 بواسطة ANOVA ثنائي الاتجاه مع اختبار مقارنة متعددة. (جيم - ه) يتم فصل القياس الكمي لشدة مضان TMRE من اللوحة B لتسليط الضوء على الاختلافات في DMSO (C) و 5 μM CCCP (D) و 20 μM CCCP (E). * ص < 0.05 ؛ ص < 0.001 ؛ p < 0.0001 بواسطة Kruskal-Wallis ANOVA مع اختبار المقارنة المتعددة لدن. Ns = غير مهم. يعني ± SEM ؛ ن = 79-104 من ثلاث نسخ بيولوجية مستقلة. الاختصارات: CCCP = سيانيد الكربونيل م-كلوروفينيل هيدرازون. TMRE = رباعي ميثيل رودامين - إيثيل استر - بيركلورات ؛ YFP = بروتين الفلورسنت الأصفر ؛ DMSO = ثنائي ميثيل سلفوكسيد. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 5
الشكل 5: شدة مضان MitoSOX بعد تلف شبكة الميتوكوندريا. (أ) صور تمثيلية لخلايا هيلا المعالجة لمدة ساعتين باستخدام DMSO أو 5 ميكرومتر CCCP أو 20 ميكرومتر CCCP لفك جهد غشاء الميتوكوندريا. تم نقل الخلايا باستخدام ناقل YFP فارغ أو YFP-ParkinWT أو YFP-ParkinT240R (أرجواني) ، وتم تمييزها ب MitoTracker (سماوي) و MitoSOX (أخضر). شريط المقياس = 30 ميكرومتر. (ب) القياس الكمي لشدة مضان MitoSOX للخلايا التي تعبر عن ناقل YFP الفارغ (الأزرق) ، YFP-ParkinWT (البرتقالي) ، و YFP-ParkinT240R (الأرجواني) للتحكم والظروف المعالجة. p < 0.0001 بواسطة ANOVA ثنائي الاتجاه مع اختبار المقارنة المتعددة ل Dunn. (جيم - ه) يتم فصل القياس الكمي لشدة مضان MitoSOX من اللوحة B لتسليط الضوء على الاختلافات في DMSO (C) و 5 μM CCCP (D) و 20 μM CCCP (E). * ص < 0.05 ؛ p < 0.0001 بواسطة Kruskal-Wallis ANOVA مع اختبار المقارنة المتعددة لدن. Ns = غير مهم. يعني ± SEM ؛ ن = 87-107 من ثلاث نسخ بيولوجية مستقلة. الاختصارات: CCCP = سيانيد الكربونيل م-كلوروفينيل هيدرازون. TMRE = رباعي ميثيل رودامين - إيثيل استر - بيركلورات ؛ YFP = بروتين الفلورسنت الأصفر ؛ DMSO = ثنائي ميثيل سلفوكسيد. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

يمكن استخدام سير العمل الموضح هنا لتحديد إمكانات غشاء الميتوكوندريا ومستويات الأكسيد الفائق بقوة وقابلية التكرار باستخدام التصوير القائم على التألق30. هناك قيود فنية مهمة يجب مراعاتها عند تصميم هذه التجارب. تم نقل خلايا هيلا باستخدام ناقل YFP فارغ ، YFP-ParkinWT ، أو YFP-ParkinT240R. تم استخدام ناقل YFP الفارغ كعنصر تحكم لتأكيد أن النتائج التجريبية كانت خاصة بباركين. بالنسبة للنقل العابر ، تم تحديد نسبة كتلة 1: 3 للحمض النووي إلى كاشف النقل تجريبيا لتحقيق أعلى معدل نقل ، حيث تم استخدام 2 ميكروغرام من الحمض النووي البلازميد لكل بناء28. كان الحفاظ على اتساق علامة YFP لجميع التركيبات أمرا مهما ، حيث تختلف البروتينات الفلورية في السطوع الفطري31,32. إذا كان يجب استخدام علامات بروتين فلورية متعددة ، فيجب اختيار البروتينات الفلورية ذات السطوع والثبات الضوئيالمماثل 33.

لقياس إمكانات غشاء الميتوكوندريا ومستويات الأكسيد الفائق ، تم اختيار صبغتين موثقتين جيدا. تعتمد إشارة مضان TMRE على إمكانات غشاء الميتوكوندريا ، في حين أن شدة مضان MitoSOX هي دالة لمستويات الأكسيد الفائق. بالنسبة للتصوير القائم على التألق ، يجب ألا يكون هناك تداخل طيفي بين مجسات الفلورسنت. ومع ذلك ، تم تنفيذ البروتوكول الأولي باستخدام mCherry-ParkinWT و mCherry-ParkinT240R ، والتي تداخلت مع أطياف الانزياح الأحمر ل TMRE و MitoSOX. لتجنب التداخل الطيفي وتقليل الحديث المتبادل المحتمل ، تم اختيار تركيبات Parkin الموسومة ب YFP. استلزم هذا التعديل تغيير صبغة MitoTracker من الأخضر إلى الأحمر البعيد. بالإضافة إلى ذلك ، تم تحسين كثافة طلاء خلايا HeLa. في البداية ، تم طلاء خلايا هيلا ب 45000 خلية لكل طبق تصوير ، ولكن هذا أدى إلى الإفراط في تناول الأطباق. يمكن أن يقلل التقاء الخلايا العالي من كفاءة النقل ، ويعزز موت الخلايا ، ويغير التمثيل الغذائي الخلوي34،35،36. لتجنب هذه التأثيرات المحتملة ، تم طلاء الخلايا بكثافة 30000 خلية لكل طبق تصوير.

يتمثل القيد الرئيسي لهذا البروتوكول في احتمال تحيز المستخدم ، وتحديدا عند تحديد الخلايا ومواقع عائد الاستثمار. يستخدم البروتوكول التغييرات في شدة مضان TMRE و MitoSOX كقراءة وظيفية لإمكانات الغشاء ومستويات الأكسيد الفائق. لذلك ، يمكن أن يؤدي اختيار الخلية باستخدام هذه المجسات إلى تحيز النتائج التجريبية. لمكافحة هذا التحيز ، اخترنا الخلايا التي تعتمد فقط على تعبير YFP. تم اختيار عائد الاستثمار غير المتداخل بشكل عشوائي عبر شبكة الميتوكوندريا داخل الخلية. على الرغم من أن هذه الطريقة كانت تستخدم سابقا لقياس شدة التألق27 ، إلا أنه يمكن اتخاذ تدابير إضافية للحد من التحيز. أولا ، يمكن تعمية الدراسة باستخدام أدوات التحليل الأعمى في ImageJ لمنع اختيار عائد الاستثمار الذي يدعم النتائج المتوقعة. ثانيا ، يمكن قياس شدة التألق باستخدام برنامج تحليل الصور المتقدم الذي يلغي الحاجة إلى عائد الاستثمار.

بينما يستخدم هذا البروتوكول الفحص المجهري متحد البؤر للقياس الكمي القائم على التألق ، يمكن استخدام طرق إضافية ، مثل قياس التدفق الخلوي ، لتحديد التغيرات الفلورية في TMRE و MitoSOX37. هنا ، استخدمنا الفحص المجهري متحد البؤر بدلا من قياس التدفق الخلوي لتصور مورفولوجيا شبكة الميتوكوندريا. يمكن بسهولة تكييف البروتوكول المحدد لقياس مضان TMRE و MitoSOX مع قياس التدفق الخلوي الذي ينتج عنه نتائج تجريبية مماثلة. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن استخدام مقايسات معدل استهلاك الأكسجين (OCR) للكشف عن التغيرات في وظيفة سلسلة نقل إلكترون الميتوكوندريا بدون أصباغ كاتيونية. بينما يوفر OCR مقياسا حساسا لخلل الميتوكوندريا ، فإنه ليس خاصا بجهد الغشاء أو تركيز الأكسيد الفائق ، ولكنه يوفر بدلا من ذلك مقياسا عالميا لوظيفة الميتوكوندريا38. يمكن إجراء هذه المقايسات بالتزامن مع تجارب TMRE و MitoSOX لتقييم صحة الميتوكوندريا39.

على الرغم من أن هذا البروتوكول يركز بشكل خاص على تأثير جهاز فك اقتران الميتوكوندريا CCCP40 ، إلا أنه يمكن استخدام الكواشف الضارة بآليات بديلة. على سبيل المثال ، يعتبر antimycin A و oligomycin A مثبطات سلسلة نقل الإلكترون التي تستخدم عادة للحث على تلف الميتوكوندريا عن طريق إنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS)38. بينما قمنا بقياس مستويات أكسيد الميتوكوندريا الفائق على وجه التحديد باستخدام MitoSOX ، يمكن قياس أنواع الأكسجين التفاعلية داخل الخلايا باستخدام CellROX. في خلايا هيلا ، كان من الضروري الإفراط في التعبير عن باركين بسبب التعبير الداخلي المنخفض. يمكن للدراسات المستقبلية ملاحظة آثار تعبير باركين على صحة شبكة الميتوكوندريا باستخدام أنظمة زراعة الخلايا التي تعبر عن باركين41 الداخلي. نظرا لأن الميتوكوندريا هي منظمات مهمة لاستقلاب الطاقة والتوازن الخلوي ، فإن خلل الميتوكوندريا يرتبط بالعديد من الأمراض ، بما في ذلك مرض السكري42 ، ومرض الزهايمر 43،44،45 ، والسرطان 46 ، وأمراض الكبد 47. لذلك ، يمكن تكييف سير العمل هذا لدراسة صحة الميتوكوندريا وعدم التنظيم في خطوط الخلايا والثقافات الأولية ذات الصلة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ليس لدى المؤلفين مصالح متنافسة يعلنونها.

Acknowledgments

نشكر أعضاء مختبر إيفانز على ملاحظاتهم المدروسة حول هذه المخطوطة. يتم دعم هذا العمل من قبل علماء ديوك وايتهيد ، وعلماء ديوك للعلوم والتكنولوجيا ، وزمالة هانا جراي في معهد هوارد هيوز الطبي (HHMI). تم عمل الشكل 1 أ باستخدام BioRender.com.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Chemicals, Peptides, and Recombinant Proteins
CCCP (carbonyl cyanide m-chlorophenyl hydrazone)  Sigma-Aldrich C2759
DMEM (1x) with 4.5 g/L glucose Gibco 11-965-084
DMSO, Anhydrous ThermoFisher Scientific D12345
Fetal Bovine Serum Hyclone SH3007103
FuGENE 6 (Tranfection Reagent) Promega E2691
GlutaMAX 100x (L-Glutamine Solution)  Gibco  35-050-061
Hoescht 33342 ThermoFisher Scientific 62249
MitoSOX  Red  ThermoFisher Scientific M36008
MitoTracker Deep Red ThermoFisher Scientific M7514
Opti-MEM (Redued Serum media) ThermoFisher scientific 31985070
Tetramethylrhodamine, Ethyl Ester, Perchlorate (TMRE)  ThermoFisher Scientific T669
Experimental models: Organisms/Strains
HeLa-M (Homo sapiens) A. Peden (Cambridge Institute for Medical Research) N/A
Recombinant DNA
EYFP Empty Vector N/A N/A
YFP-Parkin T240R This Paper Generated by site-directed mutagenesis from YFP-Parkin
YFP-Parkin WT Addgene; PMID:19029340 RRID:Addgene_23955
Software and Algorithms
Adobe Illustrator Adobe Inc. https://www.adobe.com/products/illustrator (Schindelin, 2012)
Excel (Spreadsheet Software) Microsoft Office  https://www.microsoft.com/en-us/microsoft-365/excel
ImageJ https://imagej.net/software/fiji/
Leica Application Suite (LAS X) Leica https://www.leica-microsystems.com/products/microscope-software/p/leica-las-x-ls/
Microsoft Excel Microsoft Office https://www.microsoft.com/excel
Prism9 (Statistical Analysis Software) GraphPad Software https://www.graphpad.com
Other
35 mm Dish, No. 1.5 Coverslip, 20 mm Glass Diameter, Uncoated MatTek P35G-1.5-20-C
Cage Incubator (Environmental Chamber) Okolab https://www.oko-lab.com/cage-incubator
DMiL Inverted Microscope Leica N/A
LIGHTNING Deconvolution Software Leica N/A
STELLARIS 8 confocal microscope Leica N/A

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Spinelli, J. B., Haigis, M. C. The multifaceted contributions of mitochondria to cellular metabolism. Nature Cell Biology. 20 (7), 745-754 (2018).
  2. West, A. P., Shadel, G. S., Ghosh, S. Mitochondria in innate immune responses. Nature Reviews. Immunology. 11 (6), 389-402 (2011).
  3. Seth, R. B., Sun, L., Ea, C. K., Chen, Z. J. Identification and characterization of MAVS, a mitochondrial antiviral signaling protein that activates NF-kappaB and IRF 3. Cell. 122 (5), 669-682 (2005).
  4. Tait, S. W. G., Green, D. R. Mitochondria and cell signalling. Journal of Cell Science. 125, 807-815 (2012).
  5. Antico Arciuch, V. G., Elguero, M. E., Poderoso, J. J., Carreras, M. C. Mitochondrial regulation of cell cycle and proliferation. Antioxidants and Redox Signaling. 16 (10), 1150-1180 (2012).
  6. Grunewald, A., Kumar, K. R., Sue, C. M. New insights into the complex role of mitochondria in Parkinson's disease. Progress in Neurobiology. 177, 73-93 (2019).
  7. Borsche, M., Pereira, S. L., Klein, C., Grunewald, A. Mitochondria and Parkinson's disease: clinical, molecular, and translational aspects. Journal of Parkinson's Disease. 11 (1), 45-60 (2021).
  8. Ou, Z., et al. Global trends in the incidence, prevalence, and years lived with disability of Parkinson's disease in 204 countries/territories from 1990 to 2019. Frontiers in Public Health. 9, 776847 (2021).
  9. Martinez-Vicente, M. Neuronal mitophagy in neurodegenerative diseases. Frontiers in Molecular Neuroscience. 10, 64 (2017).
  10. Youle, R. J., Narendra, D. P. Mechanisms of mitophagy. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 12 (1), 9-14 (2011).
  11. Villa, E., Marchetti, S., Ricci, J. E. No Parkin zone: mitophagy without Parkin. Trends in Cell Biology. 28 (11), 882-895 (2018).
  12. Geisler, S., et al. The PINK1/Parkin-mediated mitophagy is compromised by PD-associated mutations. Autophagy. 6 (7), 871-878 (2010).
  13. Kane, L. A., et al. PINK1 phosphorylates ubiquitin to activate Parkin E3 ubiquitin ligase activity. The Journal of Cell Biology. 205 (2), 143-153 (2014).
  14. Koyano, F., et al. Ubiquitin is phosphorylated by PINK1 to activate parkin. Nature. 510 (7503), 162-166 (2014).
  15. Ordureau, A., et al. Defining roles of PARKIN and ubiquitin phosphorylation by PINK1 in mitochondrial quality control using a ubiquitin replacement strategy. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (21), 6637-6642 (2015).
  16. Ordureau, A., et al. Quantitative proteomics reveal a feedforward mechanism for mitochondrial PARKIN translocation and ubiquitin chain synthesis. Molecular Cell. 56 (3), 360-375 (2014).
  17. Kitada, T., et al. Mutations in the parkin gene cause autosomal recessive juvenile parkinsonism. Nature. 392 (6676), 605-608 (1998).
  18. Valente, E. M., et al. PARK6 is a common cause of familial parkinsonism. Neurological Sciences. 23, S117-S118 (2002).
  19. Matsuda, N., et al. PINK1 stabilized by mitochondrial depolarization recruits Parkin to damaged mitochondria and activates latent Parkin for mitophagy. The Journal of Cell Biology. 189 (2), 211-221 (2010).
  20. Sriram, S. R., et al. Familial-associated mutations differentially disrupt the solubility, localization, binding and ubiquitination properties of parkin. Human Molecular Genetics. 14 (17), 2571-2586 (2005).
  21. Vives-Bauza, C., et al. PINK1-dependent recruitment of Parkin to mitochondria in mitophagy. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (1), 378-383 (2010).
  22. Wong, Y. C., Holzbaur, E. L. F. Optineurin is an autophagy receptor for damaged mitochondria in parkin-mediated mitophagy that is disrupted by an ALS-linked mutation. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (42), E4439-E4448 (2014).
  23. Bertolin, G., et al. Parkin maintains mitochondrial levels of the protective Parkinson's disease-related enzyme 17-beta hydroxysteroid dehydrogenase type 10. Cell Death and Differentiation. 22 (10), 1563-1576 (2015).
  24. Crowley, L. C., Christensen, M. E., Waterhouse, N. J. Measuring mitochondrial transmembrane potential by TMRE staining. Cold Spring Harbor Protocols. 2016 (12), (2016).
  25. Kuznetsov, A. V., et al. Mitochondrial ROS production under cellular stress: comparison of different detection methods. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 400 (8), 2383-2390 (2011).
  26. Moore, A. S., Holzbaur, E. L. F. Dynamic recruitment and activation of ALS-associated TBK1 with its target optineurin are required for efficient mitophagy. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (24), E3349-E3358 (2016).
  27. Evans, C. S., Holzbaur, E. L. F. Degradation of engulfed mitochondria is rate-limiting in Optineurin-mediated mitophagy in neurons. eLife. 9, e50260 (2020).
  28. Jacobsen, L. B., Calvin, S. A., Colvin, K. E., Wright, M. FuGENE 6 Transfection Reagent: the gentle power. Methods. 33 (2), 104-112 (2004).
  29. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  30. Mitra, K., Lippincott-Schwartz, J. Analysis of mitochondrial dynamics and functions using imaging approaches. Current Protocols in Cell Biology. , Chapter 4, Unit 4.25 1-21 (2010).
  31. Lin, H. C., Liu, S. Y., Lai, H. S., Lai, I. R. Isolated mitochondria infusion mitigates ischemia-reperfusion injury of the liver in rats. Shock. 39 (3), 304-310 (2013).
  32. Kholmukhamedov, A., Schwartz, J. M., Lemasters, J. J. Isolated mitochondria infusion mitigates ischemia-reperfusion injury of the liver in rats: mitotracker probes and mitochondrial membrane potential. Shock. 39 (6), 543 (2013).
  33. Thorn, K. Genetically encoded fluorescent tags. Molecular Biology of the Cell. 28 (7), 848-857 (2017).
  34. Pavel, M., et al. Contact inhibition controls cell survival and proliferation via YAP/TAZ-autophagy axis. Nature Communications. 9 (1), 2961 (2018).
  35. Rossignol, R., et al. Energy substrate modulates mitochondrial structure and oxidative capacity in cancer cells. Cancer Research. 64 (3), 985-993 (2004).
  36. Schornack, P. A., Gillies, R. J. Contributions of cell metabolism and H+ diffusion to the acidic pH of tumors. Neoplasia. 5 (2), 135-145 (2003).
  37. Christensen, M. E., Jansen, E. S., Sanchez, W., Waterhouse, N. J. Flow cytometry based assays for the measurement of apoptosis-associated mitochondrial membrane depolarisation and cytochrome c release. Methods. 61 (2), 138-145 (2013).
  38. Muller, B., et al. Application of extracellular flux analysis for determining mitochondrial function in mammalian oocytes and early embryos. Scientific Reports. 9 (1), 16778 (2019).
  39. Connolly, N. M. C., et al. Guidelines on experimental methods to assess mitochondrial dysfunction in cellular models of neurodegenerative diseases. Cell Death and Differentiation. 25 (3), 542-572 (2018).
  40. Demine, S., Renard, P., Arnould, T. Mitochondrial uncoupling: a key controller of biological processes in physiology and diseases. Cells. 8 (8), 795 (2019).
  41. Narendra, D., Tanaka, A., Suen, D. F., Youle, R. J. Parkin is recruited selectively to impaired mitochondria and promotes their autophagy. The Journal of Cell Biology. 183 (5), 795-803 (2008).
  42. Kwak, S. H., Park, K. S., Lee, K. U., Lee, H. K. Mitochondrial metabolism and diabetes. Journal of Diabetes Investigation. 1 (5), 161-169 (2010).
  43. Reddy, P. H. Role of mitochondria in neurodegenerative diseases: mitochondria as a therapeutic target in Alzheimer's disease. CNS Spectrums. 14 (8), 8-13 (2009).
  44. Wang, W., Zhao, F., Ma, X., Perry, G., Zhu, X. Mitochondria dysfunction in the pathogenesis of Alzheimer's disease: recent advances. Molecular Neurodegeneration. 15 (1), 30 (2020).
  45. Baloyannis, S. J. Mitochondrial alterations in Alzheimer's disease. Journal of Alzheimer's Disease. 9 (2), 119-126 (2006).
  46. Wallace, D. C. Mitochondria and cancer. Nature Reviews. Cancer. 12 (10), 685-698 (2012).
  47. Middleton, P., Vergis, N. Mitochondrial dysfunction and liver disease: role, relevance, and potential for therapeutic modulation. Therapeutic Advances in Gastroenterology. 14, 17562848211031394 (2021).

Tags

علم الأحياء ، العدد 195 ، الميتوكوندريا ، الميتوفاجي ، التنكس العصبي ، باركين ، إمكانات غشاء الميتوكوندريا ، أنواع الأكسجين التفاعلية ، الأكسيد الفائق ، خلايا هيلا ، الفحص المجهري متحد البؤر
القياس الكمي القائم على التألق لإمكانات غشاء الميتوكوندريا ومستويات الأكسيد الفائق باستخدام التصوير المباشر في خلايا هيلا
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Fazli, M., Evans, C. S.… More

Fazli, M., Evans, C. S. Fluorescence-Based Quantification of Mitochondrial Membrane Potential and Superoxide Levels Using Live Imaging in HeLa Cells. J. Vis. Exp. (195), e65304, doi:10.3791/65304 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter