Fluoreszenzbasierte Quantifizierung des mitochondrialen Membranpotentials und des Superoxidspiegels mittels Live-Bildgebung in HeLa-Zellen
Summary
Diese Technik beschreibt einen effektiven Arbeitsablauf zur Visualisierung und quantitativen Messung des mitochondrialen Membranpotentials und des Superoxidspiegels in HeLa-Zellen mittels fluoreszenzbasierter Live-Bildgebung.
Abstract
Mitochondrien sind dynamische Organellen, die für die metabolische Homöostase entscheidend sind, indem sie die Energieproduktion durch ATP-Synthese steuern. Um den Zellstoffwechsel zu unterstützen, arbeiten verschiedene mitochondriale Qualitätskontrollmechanismen zusammen, um ein gesundes mitochondriales Netzwerk aufrechtzuerhalten. Ein solcher Weg ist die Mitophagie, bei der die PTEN-induzierte Kinase 1 (PINK1) und die Parkin-Phospho-Ubiquitinierung geschädigter Mitochondrien die Sequestrierung von Autophagosomen und die anschließende Entfernung aus der Zelle durch Lysosomenfusion erleichtern. Mitophagie ist wichtig für die zelluläre Homöostase, und Mutationen in Parkin werden mit der Parkinson-Krankheit (PD) in Verbindung gebracht. Aufgrund dieser Ergebnisse wurde ein erheblicher Schwerpunkt auf die Untersuchung der mitochondrialen Schädigung und des Umsatzes gelegt, um die molekularen Mechanismen und die Dynamik der mitochondrialen Qualitätskontrolle zu verstehen. In dieser Arbeit wurde die Bildgebung lebender Zellen verwendet, um das mitochondriale Netzwerk von HeLa-Zellen sichtbar zu machen, um das mitochondriale Membranpotenzial und die Superoxidspiegel nach der Behandlung mit Carbonylcyanid m-chlorphenylhydrazon (CCCP), einem mitochondrialen Entkopplungsmittel, zu quantifizieren. Darüber hinaus wurde eine PD-chromosomale Mutation von Parkin (ParkinT240R) exprimiert, die die Parkin-abhängige Mitophagie hemmt, um zu bestimmen, wie sich die mutierte Expression auf das mitochondriale Netzwerk im Vergleich zu Zellen auswirkt, die Wildtyp-Parkin exprimieren. Das hier beschriebene Protokoll beschreibt einen einfachen Arbeitsablauf mit fluoreszenzbasierten Ansätzen zur effektiven Quantifizierung des mitochondrialen Membranpotentials und des Superoxidspiegels.
Introduction
Das mitochondriale Netzwerk besteht aus einer Reihe miteinander verbundener Organellen, die eine entscheidende Rolle bei der Energieproduktion1, der angeborenen Immunität 2,3 und der zellulären Signalübertragung 4,5 spielen. Mitochondriale Dysregulation wurde mit neurodegenerativen Erkrankungen wie der Parkinson-Krankheit (PD) in Verbindung gebracht6,7. Parkinson ist eine fortschreitende neurodegenerative Erkrankung, die dopaminerge Neuronen der Substantia nigra betrifft und von der weltweit fast 10 Millionen Menschen betroffen sind8. Parkinson wurde genetisch mit der Mitophagie in Verbindung gebracht, einem mitochondrialen Qualitätskontrollweg, der für die Aufrechterhaltung der zellulären Homöostase notwendig ist und beschädigte Mitochondrien selektiv entfernt 9,10. Studien haben mehrere unabhängige Mitophagie-Signalwege identifiziert, darunter die FUN14-Domäne mit 1 (FUNDC1)-vermittelter Mitophagie, die Bcl-2-interagierende Protein 3 (BNIP3)-geförderte Mitophagie, die NIX-abhängige Mitophagie und die gut charakterisierte PTEN-induzierte Kinase 1 (PINK1)/Parkin-regulierte Mitophagie10,11. PINK1 (eine mutmaßliche Kinase) und Parkin (eine E3-Ubiquitin-Ligase) arbeiten zusammen, um geschädigte Mitochondrien mit Phospho-Ubiquitinat zu versorgen, was die Bildung von Autophagosomen antreibt, die die beschädigte Organelle umhüllen und mit Lysosomen verschmelzen, um den Abbau einzuleiten 12,13,14,15,16. Mutationen bei Parkin wurden mit Parkinson-assoziierten Phänotypen wie Neurodegeneration über den Verlust dopaminerger Neuronen in Verbindung gebracht17,18.
Hier wird ein Protokoll beschrieben, in dem HeLa-Zellen, routinemäßig verwendete immortalisierte Zellen aus Gebärmutterhalskrebs, verwendet werden, um die Rolle von Parkin bei der Aufrechterhaltung der Gesundheit des mitochondrialen Netzwerks zu untersuchen. HeLa-Zellen exprimieren vernachlässigbare Mengen an endogenem Parkin und benötigen daher eine exogene Parkin-Expression19. Um die Rolle von Parkin für die Gesundheit des mitochondrialen Netzwerks zu untersuchen, werden HeLa-Zellen entweder mit Wildtyp-Parkin (ParkinWT), einer Parkin-Mutante (ParkinT240R) oder einem leeren Kontrollvektor transfiziert. ParkinT240R ist eine autosomal-rezessiv vererbte juvenile Parkinsonismus-Mutation, die die Aktivität der Parkin-E3-Ligase beeinträchtigt und die Effizienz des Mitophagie-Signalwegssignifikant verringert 20. HeLa-Zellen unterliegen milden (5 μM) oder schweren (20 μM) Konzentrationen von Carbonylcyanid m-Chlorphenylhydrazon (CCCP), einem mitochondrialen Entkopplungsmittel. Die Behandlung mit schweren Konzentrationen von CCCP wird routinemäßig eingesetzt, um Parkin-vermittelte Mitophagie in verschiedenen Zelllinien, wie z. B. HeLa- und COS-7-Zellen, zu induzieren21,22,23.
Nach der Behandlung verwendet das Protokoll eine Live-Bildgebung des mitochondrialen Netzwerks unter Verwendung von zwei derzeit verfügbaren mitochondrialen Fluoreszenzfarbstoffen. Tetramethylrhodamin, Ethylester, Perchlorat (TMRE) ist ein kationischer Farbstoff, der auf der Grundlage des mitochondrialen Membranpotentials24 fluoresziert, während MitoSOX ein mitochondrialer Superoxidindikator ist, bei dem die Fluoreszenzintensität eine Funktion der Superoxidkonzentrationist 25. Schließlich verwendet das skizzierte Protokoll eine fluoreszenzbasierte Quantifizierung und einen einfachen Arbeitsablauf, um das mitochondriale Membranpotenzial und den Superoxidgehalt mit minimalem Spielraum für Benutzerverzerrungen effektiv zu quantifizieren. Obwohl dieses Protokoll entwickelt wurde, um die mitochondriale Funktion in HeLa-Zellen zu untersuchen, kann es für weitere Zelllinien und primäre Zelltypen angepasst werden, um die Gesundheit des mitochondrialen Netzwerks quantitativ zu charakterisieren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Der hier skizzierte Workflow kann verwendet werden, um das mitochondriale Membranpotenzial und die Superoxidkonzentrationen mit Hilfe der fluoreszenzbasierten Bildgebung robust und reproduzierbar zu quantifizieren30. Es gibt wichtige technische Einschränkungen, die bei der Planung dieser Experimente zu berücksichtigen sind. HeLa-Zellen wurden mit einem leeren YFP-Vektor, YFP-ParkinWT oder YFP-ParkinT240R, transfiziert. Der leere YFP-Vektor wurde als Kontrolle verwendet, um …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken den Mitgliedern des Evans-Labors für ihr aufmerksames Feedback zu diesem Manuskript. Diese Arbeit wird von Duke Whitehead Scholars, Duke Science and Technology Scholars und dem Hanna Gray Fellowship des Howard Hughes Medical Institute (HHMI) unterstützt. Abbildung 1A wurde mit BioRender.com erstellt.
Materials
| Chemicals, Peptides, and Recombinant Proteins | |||
| CCCP (carbonyl cyanide m-chlorophenyl hydrazone) | Sigma-Aldrich | C2759 | |
| DMEM (1x) with 4.5 g/L glucose | Gibco | 11-965-084 | |
| DMSO, Anhydrous | ThermoFisher Scientific | D12345 | |
| Fetal Bovine Serum | Hyclone | SH3007103 | |
| FuGENE 6 (Tranfection Reagent) | Promega | E2691 | |
| GlutaMAX 100x (L-Glutamine Solution) | Gibco | 35-050-061 | |
| Hoescht 33342 | ThermoFisher Scientific | 62249 | |
| MitoSOX Red | ThermoFisher Scientific | M36008 | |
| MitoTracker Deep Red | ThermoFisher Scientific | M7514 | |
| Opti-MEM (Redued Serum media) | ThermoFisher scientific | 31985070 | |
| Tetramethylrhodamine, Ethyl Ester, Perchlorate (TMRE) | ThermoFisher Scientific | T669 | |
| Experimental models: Organisms/Strains | |||
| HeLa-M (Homo sapiens) | A. Peden (Cambridge Institute for Medical Research) | N/A | |
| Recombinant DNA | |||
| EYFP Empty Vector | N/A | N/A | |
| YFP-Parkin T240R | This Paper | Generated by site-directed mutagenesis from YFP-Parkin | |
| YFP-Parkin WT | Addgene; PMID:19029340 | RRID:Addgene_23955 | |
| Software and Algorithms | |||
| Adobe Illustrator | Adobe Inc. | https://www.adobe.com/products/illustrator | (Schindelin, 2012) |
| Excel (Spreadsheet Software) | Microsoft Office | https://www.microsoft.com/en-us/microsoft-365/excel | |
| ImageJ | https://imagej.net/software/fiji/ | ||
| Leica Application Suite (LAS X) | Leica | https://www.leica-microsystems.com/products/microscope-software/p/leica-las-x-ls/ | |
| Microsoft Excel | Microsoft Office | https://www.microsoft.com/excel | |
| Prism9 (Statistical Analysis Software) | GraphPad Software | https://www.graphpad.com | |
| Other | |||
| 35 mm Dish, No. 1.5 Coverslip, 20 mm Glass Diameter, Uncoated | MatTek | P35G-1.5-20-C | |
| Cage Incubator (Environmental Chamber) | Okolab | https://www.oko-lab.com/cage-incubator | |
| DMiL Inverted Microscope | Leica | N/A | |
| LIGHTNING Deconvolution Software | Leica | N/A | |
| STELLARIS 8 confocal microscope | Leica | N/A |
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