Summary
この手法では、蛍光ベースのライブイメージングを使用して、HeLa細胞内のミトコンドリア膜電位とスーパーオキシドレベルを視覚化し、定量的に測定するための効果的なワークフローについて説明します。
Abstract
ミトコンドリアは、ATP合成 を介して エネルギー産生を制御することにより、代謝恒常性に不可欠な動的オルガネラです。細胞の代謝をサポートするために、さまざまなミトコンドリアの品質管理メカニズムが連携して、健康なミトコンドリアネットワークを維持します。そのような経路の1つはマイトファジーであり、PTEN誘導キナーゼ1(PINK1)と損傷したミトコンドリアのパーキンホスホユビキチン化は、オートファゴソームの隔離とその後のリソソーム融合 による 細胞からの除去を促進します。マイトファジーは細胞の恒常性にとって重要であり、パーキンの変異はパーキンソン病(PD)に関連しています。これらの発見により、ミトコンドリアの品質管理の分子メカニズムとダイナミクスを理解するために、ミトコンドリアの損傷と代謝回転の研究に大きな重点が置かれてきました。ここでは、生細胞イメージングを使用してHeLa細胞のミトコンドリアネットワークを視覚化し、ミトコンドリア脱共役剤であるカルボニルシアン化m-クロロフェニルヒドラゾン(CCCP)で処理した後のミトコンドリア膜電位とスーパーオキシドレベルを定量化しました。さらに、パーキン依存性マイトファジーを阻害するパーキンのPD結合変異(パーキンT240R)を発現させ、変異発現が野生型パーキンを発現する細胞と比較してミトコンドリアネットワークにどのように影響するかを決定しました。ここで概説するプロトコルは、ミトコンドリア膜電位とスーパーオキシドレベルを効果的に定量するための蛍光ベースのアプローチを使用した簡単なワークフローを説明しています。
Introduction
ミトコンドリアネットワークは、エネルギー生産1、自然免疫2,3、および細胞シグナル伝達4,5において重要な役割を果たす一連の相互接続された細胞小器官です。ミトコンドリアの調節不全は、パーキンソン病(PD)などの神経変性疾患と関連しています6,7。PDは、黒質のドーパミン作動性ニューロンに影響を与える進行性の神経変性疾患であり、世界中で約1,000万人が罹患しています8。PDは、損傷したミトコンドリアを選択的に除去する細胞の恒常性を維持するために必要なミトコンドリアの品質管理経路であるマイトファジーと遺伝的に関連しています9,10。研究により、1(FUNDC1)を介したマイトファジーを含むFUN14ドメイン、Bcl-2相互作用タンパク質3(BNIP3)促進マイトファジー、NIX依存性マイトファジー、および十分に特徴付けられたPTEN誘導キナーゼ1(PINK1)/パーキン調節マイトファジー10,11を含む複数の独立したマイトファジー経路が特定されています。PINK1(推定されるキナーゼ)とパーキン(E3ユビキチンリガーゼ)は連携して働き、損傷したミトコンドリアをリン酸ユビキチン化し、損傷した細胞小器官を飲み込み、リソソームと融合して分解を開始するオートファゴソームの形成を促進します12,13,14,15,16。パーキンの変異は、ドーパミン作動性ニューロンの喪失を介した神経変性などのPD結合表現型と関連しています17,18。
ここでは、子宮頸がん由来の不死化細胞であるHeLa細胞を使用して、ミトコンドリアネットワークの健康を維持する上でのパーキンの役割を調査するプロトコルについて説明します。HeLa細胞はごくわずかなレベルの内因性パーキンを発現するため、外因性パーキン発現が必要です19。ミトコンドリアネットワークの健康におけるパーキンの役割を研究するために、HeLa細胞を野生型パーキン(パーキンWT)、パーキン変異体(パーキンT240R)、または空のコントロールベクターのいずれかでトランスフェクトします。パーキンT240Rは、パーキンE3リガーゼ活性に影響を及ぼす常染色体劣性若年性パーキンソニズム変異であり、マイトファジー経路20の効率を著しく低下させる。HeLa細胞は、ミトコンドリア脱共役剤であるカルボニルシアン化物m-クロロフェニルヒドラゾン(CCCP)の軽度(5 μM)または重度(20 μM)濃度にさらされます。高濃度のCCCPによる処理は、HeLaおよびCOS-7細胞などの様々な細胞株においてパーキン媒介マイトファジーを誘導するために日常的に使用されている21、22、23。
治療後、プロトコルは、現在利用可能な2つのミトコンドリア標的蛍光色素を使用したミトコンドリアネットワークのライブイメージングを使用します。テトラメチルローダミン、エチルエステル、過塩素酸塩(TMRE)は、ミトコンドリア膜電位24に基づいて蛍光を発するカチオン色素であり、MitoSOXは、蛍光強度がスーパーオキシド濃度25の関数であるミトコンドリアスーパーオキシドインジケーターです。最後に、概説したプロトコルは、蛍光ベースの定量とシンプルなワークフローを使用して、ユーザーのバイアスの範囲を最小限に抑えながら、ミトコンドリア膜電位とスーパーオキシドレベルを効果的に定量します。このプロトコルは、HeLa細胞のミトコンドリア機能を研究するために設計されましたが、ミトコンドリアネットワークの健全性を定量的に特徴付けるために、追加の細胞株および初代細胞タイプに適合させることができます。
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Protocol
1. 生体試料の調製
注意: バイオセーフティキャビネットで滅菌技術を使用して、次の手順を実行します。キャビネットの表面とすべての材料に70%エタノールをスプレーします。
- HeLa細胞の培養とトランスフェクション
- 10%ウシ胎児血清および1%L-グルタミン溶液を添加した4.5 g/Lグルコースを含むダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)で30,000個のHeLa細胞を培養します(HeLa培地;材料表を参照)。2 mLの予熱したHeLa培地を含む35 mmガラス底イメージングディッシュ(材料のT缶を参照)に細胞をプレートします。HeLa培養物を5%CO2および37°C26,27に維持する。
- プレーティングの翌日、光学顕微鏡を使用して35 mmイメージングディッシュを検査し、細胞が~50%-60%コンフルエントであることを確認します。コンフルエントになったら、HeLa細胞を空の黄色蛍光タンパク質(YFP)ベクター、YFP-パーキンWT、またはYFP-パーキンT240R でトランスフェクトします(図1A)。
- トランスフェクションごとに、滅菌マイクロ遠心チューブで2つの別々の混合物を調製します。チューブを軽くたたくか、上下に軽くピペッティングして混合します。
- チューブ1で、200 μLの還元血清培地( 材料の表を参照)を2 μgのプラスミドDNAと混合します。
- チューブ2で、200 μLの還元血清培地を6 μLのトランスフェクション試薬と混合します( 材料表を参照)28。
- チューブを室温(RT)で5分間インキュベートします。チューブ2をチューブ1に加え、上下にピペッティングして混合し、RTで20分間インキュベートします。
- トランスフェクション複合体をHeLa細胞培養物を含む既存のイメージングディッシュに滴下し、ディッシュ全体に均等に分布するようにします。イメージングディッシュを5%CO2 および37°Cのインキュベーターに一晩置きます。
注:各ディッシュに適切なトランスフェクトプラスミドを標識します。各実験について、3つのYFP-パーキンWT ディッシュ(ジメチルスルホキシド[DMSO; 材料表を参照]、5 μM CCCP、および20 μM CCCP)に標識します。3つのYFP-パーキンT240R ディッシュと3つの空のYFPベクターディッシュでラベリングを繰り返します。
- CCCPおよび蛍光色素の調製
注意: 蛍光染料は、多くの場合、感光性です。光への露出を減らすために、アルミホイルまたは茶色の遠沈管を使用して染料を暗所に保管してください。- 5 mgのCCCPを4.89 mLのDMSOに溶解することにより、CCCPの5 mMのワーキングストックを作成します( 材料の表を参照)。5 mgのCCCPを1.22 mLのDMSOに溶解することにより、20 mMのCCCPのワーキングストックを作成します。
- 1 mM MitoTracker ディープレッド( 材料表参照)ストック溶液 10 μL を 390 μL の DMSO で希釈して、25 μM のワーキングストックを作成します。
- 50 μg の MitoSOX Red25 ( 材料表を参照) を 13 μL の DMSO に溶解して、5 mM のワーキングストックを作成します。
- 10 mgのTMRE24 ( 材料表を参照)を19.4 mLのDMSOに溶解して、1 mMのストック溶液を作ります。10 μLの1 mM TMREを990 μLのDMSOに加えてTMREを希釈し、10 μMのワーキングストックを作成します。
2. HeLa細胞におけるCCCP処理と蛍光プローブによるミトコンドリア標識
注意: 次の手順をすばやく実行して、HeLa細胞が長期間インキュベーターから出ていないことを確認してください。
- トランスフェクションの翌日に、各実験プレートに5 μLまたは20 mM CCCP(最終濃度:それぞれ5 μMおよび20 μM)を2 μL加えます。コントロールプレートの場合は、2 μLのDMSOを追加します。プレートを5%CO2 および37°Cのインキュベーターに1.5時間戻します(図1A)。
注:CCCP治療は合計2時間です。ただし、ミトコンドリアは、CCCP処理の最後の30分間に蛍光プローブで標識されます。 - 1.5時間後、インキュベーターからプレートを取り出し、イメージングディッシュに蛍光プローブを追加します。プレートを5%CO2 および37°Cのインキュベーターに30分間戻します(図1A)。
- TMRE実験:25 μLの25 μM MitoTracker(最終濃度:25 nM)と2 μLの10 μM TMRE(最終濃度:10 nM)を追加します。
- MitoSOX 実験: 25 μM マイトトラッカー (最終濃度: 25 nM) を 2 μL 加え、5 mM MitoSOX (最終濃度: 2.5 μM) を 1 μL 加えます。
- 2時間のCCCP処理の後、イメージング用のHeLa細胞を調製します(図1A、B)。
- TMRE実験:HeLa細胞はすぐにイメージングの準備ができています。TMREがHeLa細胞培養培地に残っていることを確認します。
- MitoSOX実験:遊離のMitoSOX色素を除去するために、2 mLの予熱したHeLa培地で細胞を3倍洗浄します。予熱した培地2 mLを加えます。これで、HeLa細胞をイメージングする準備が整いました。
注:実験条件と同じDMSOまたはCCCP濃度を含む新鮮な予熱したHeLa培地でHeLa細胞を洗浄します。MitoSOX または MitoTracker は含めないでください。
3. 共焦点顕微鏡画像取得のセットアップ
注:63x / 1.40開口数(NA)油浸対物レンズと環境チャンバー(材料表を参照)を備えた共焦点顕微鏡(材料表を参照)を使用してHeLa細胞を画像化します。
- イメージングの1時間前に、タンクバルブを開いてCO2をオンにします。Onボタンを押して、顕微鏡の環境コントローラーをオンにします。タッチパッドの上矢印と下矢印を使用して、温度を37°Cに、CO2を5%に調整します。完了したら、[設定]を押します。
注意: 環境チャンバーへのドアが閉じていることを確認し、状態が安定するのを待ちます。 - レーザー設定
- 白色光レーザー(WLL)をオンにし、レーザー出力を85%に設定し、励起制御を最大出力に設定します。[取得]タブをクリックし、[レーザーの追加]を選択して、表示されるダイアログ ボックスで WLL を [オン] に切り替えます。[レーザー出力] ボタンをクリックし、「85%」と入力します。励起制御ボタンをクリックし、ドロップダウンメニューから[最大電力]を選択します(図2A)。
- TMRE実験: YFP、マイトトラッカー、TMREの励起スペクトルと発光スペクトルを設定します。
- YFPの場合、励起レーザーを514 nmに設定し、発光スペクトルウィンドウを524-545 nmに設定します。 [取得]タブで、[新しい設定の追加]ボタンをクリックします。次に、[レーザーの追加]をクリックして、設定1にドラッグします。励起ラインをダブルクリックし、ダイアログボックスに波長として514と入力します。対応する検出器をダブルクリックして、開始波長に524、終了波長に545を入力します。
- MitoTracker ディープレッドの場合は、励起レーザーを641に設定し、発光スペクトルウィンドウを650-750 nmに設定します。[取得]タブで、[レーザーの追加]ボタンをクリックし、[設定1]にドラッグします。励起ラインをダブルクリックし、ダイアログボックスの波長として641と入力します。対応する検出器をダブルクリックして、開始波長に650、終了波長に750を入力します。
- TMREの場合、励起レーザーを555 nmに、発光スペクトルウィンドウを557-643 nmに設定します。[取得]タブで、[新しい設定の追加]ボタンをクリックします。次に、[レーザーの追加]ボタンをクリックして、設定2にドラッグします。励起ラインをダブルクリックし、ダイアログボックスの波長として555と入力します。対応する検出器をダブルクリックして、開始波長に557、終了波長に643を入力します。
- マイトSOX実験: YFP、マイトトラッカー、およびMitoSOXの励起スペクトルと発光スペクトルを設定します(図2B)。
- YFPの場合、励起レーザーを507 nmに設定し、発光スペクトルウィンドウを517-540 nmに設定します。[取得]タブで、[新しい設定の追加]ボタンをクリックします。次に、[レーザーの追加]ボタンをクリックして、設定1にドラッグします。励起ラインをダブルクリックし、ダイアログボックスの波長として507と入力します。対応する検出器をダブルクリックして、開始波長に517、終了波長に540を入力します。
- MitoSOXの場合、励起レーザーを547 nmに設定し、発光スペクトルウィンドウを564-636 nmに設定します。[取得]タブで、[新しい設定の追加]ボタンをクリックします。次に、[レーザーの追加]ボタンをクリックして、設定2にドラッグします。励起ラインをダブルクリックし、ダイアログボックスの波長として547と入力します。対応する検出器をダブルクリックして、開始波長に564、終了波長に636を入力します。
- MitoTracker ディープレッドの場合は、励起レーザーを 641 nm に設定し、発光スペクトルウィンドウを 652-742 nm に設定します。 [取得]タブで、[新しい設定の追加]ボタンをクリックします。[レーザーの追加]ボタンをクリックして、設定3にドラッグします。励起ラインをダブルクリックし、ダイアログボックスの波長として641と入力します。対応する検出器をダブルクリックして、開始波長に652、終了波長に742を入力します。
- 画像取得設定(図2C)
- フォーマットを1,024 x 1,024、スキャン速度を600 Hz、ライン平均を3に設定します。
- [取得]タブを選択し、[フォーマット]ボタンをクリックします。ドロップダウンメニューから[1,024 x 1,024]を選択します。[速度]ボタンをクリックし、ドロップダウンメニューから[600]を選択します。次に、[ライン平均]ボタンをクリックし、ドロップダウンメニューから[3]を選択します。
- 双方向スキャンをオンにして、位相とズーム係数をそれぞれ22.61と1.50に設定します。
- [ 取得] タブで、[ 双方向 ] ボタンを [オン] に切り替えます。 フェーズX 設定をクリックし、 22.61に設定します。 ズーム係数 設定をクリックし、 1.50に設定します。
- フォーマットを1,024 x 1,024、スキャン速度を600 Hz、ライン平均を3に設定します。
4. 画像取得
注意:実験者は、YFP蛍光シグナルに基づいて細胞を選択するために視覚的な判断を下す必要があります。過飽和ピクセルは蛍光強度の定量化に大きな影響を与える可能性があるため、避けてください。ピクセルの彩度を示すオーバー/アンダールックアップテーブルを使用して、飽和画像の取得を回避します。
- 目的の 設定 をクリックし、 Fast Liveを押して、蛍光画像のライブプレビューを提供します。
- 対応する検出器をダブルクリックして、ゲインと強度を調整します。表示されるダイアログボックスで、スライダーを使用してゲインを調整します。強度を変更するには、励起ラインをダブルクリックし、ポップアップウィンドウの上矢印と下矢印を使用して強度を変更します。[停止] をクリックしてプレビューを終了します。
- TMRE実験:最初にDMSOコントロールプレートを画像化します。TMRE信号のゲインと強度を調整し(設定2)、ミトコンドリアネットワークの強度が飽和のすぐ下になるようにします。 実験のゲインと強度を一定に保ちます。MitoTrackerとYFP(設定1)のゲインと強度を調整して、ミトコンドリアネットワークが見えるが暗くなるようにします。
- MitoSOX実験:最初にDMSOコントロールプレートを画像化します。MitoSOX(設定2)信号のゲインと強度を調整して、蛍光が見えるが暗くなるようにします。実験のゲインと強度を一定に保ちます。YFP(設定1)とMitoTracker(設定3)のゲインと強度を調整して、ミトコンドリアネットワークが見えるが暗くなるようにします。
注:TMREとMitoSOXのゲインと強度は、実験全体を通して一定に保つ必要があるため、記録してください。YFPおよびMitoTrackerの蛍光シグナルは、このプロトコルでは定量化されません。したがって、ゲインと強度は画像ごとに調整できます。細胞が細胞の損傷や光退色を引き起こす過度のレーザー強度にさらされないようにするために、 細胞が見やすく、それでも暗いゲインと強度の設定が最も効果的です。
- ゲインと強度の設定が完了したら、[ 開始 ]をクリックして画像を取り込みます。実験条件ごとに 20個の細胞の 画像を取得する(例えば、画像ごとに4個の細胞を有する5枚の画像; 図 2D)。
5. ImageJを用いた蛍光強度の定量化
注意: イメージングファイルは「.lif」として保存され、ImageJ29と互換性があります。ImageJと互換性のあるファイルタイプは、そのWebサイトで指定されています。互換性がない場合は、ファイルタイプを変換する必要がある場合があります。
- 関心領域 (ROI) を作成して保存します。
- ImageJ で、[ ファイル |新規 |画像。 表示されるダイアログ ボックスで、[ OK] をクリックします。
- [長方形ツール] ボタンをクリックして、6 ミクロン x 6 ミクロンのボックスを描画します。ROI マネージャーを開くには、[分析] |ツール |ROIマネージャ]をクリックし、ROIマネージャのダイアログボックスが表示されるのを待ちます(図3A)。長方形の ROI をマネージャに追加するには、マネージャ ダイアログ ボックスで [追加] をクリックします。[その他] を選択して ROI を保存し、[保存] ボタンをクリックして [OK] をクリックします。
- 蛍光強度を測定します。
- イメージ J で、[ ファイル ] をクリックし、[ 開く] を選択します。ダイアログ ボックスで、実験用のイメージング ファイルを選択し、[ 開く] をクリックします。
- [Bio-formatsインポートオプション]ウィンドウが表示されるのを待ちます(図3B)。「チャンネルを分割」を選択し、「開く」をクリックします。
注意: 分割チャンネル機能を使用すると、画像内の各チャンネルを個別のウィンドウとして開くことができます。チャネル順序は取得順序に対応します。- TMRE 実験: YFP (設定1)は最初のチャネル(c = 0)です。 MitoTracker (設定1)は2番目のチャネル(c = 1)です。TMRE(設定2)は3番目のチャネル(c = 2)です。
- MitoSOX 実験: YFP (設定1)が最初のチャネル(c = 0)です。 MitoSOX (設定2)は2番目のチャネル(c = 1)です。 MitoTracker (設定 3) は 3 番目のチャネル (c = 2) です。
- 画像を選択して明るさを調整します |調整 |明るさ (図3C)。
注意: 画像の明るさが永続的に変更されないように、[ 設定]または [適用]を押さないでください。時折、蛍光強度がTMREまたはMitoSOXチャネルで表示されないことがあります。明るさを調整して、視覚化しやすくします。明るさを変更しても、生の蛍光強度の値には影響しません。 - [ 分析 ]をクリックし、[ 測定値の設定]を選択します。 [面積 ] ボックスと [平均] グレー値 チェックボックスをオンにして、[ OK ] をクリックします (図 3D)。
注:平均グレー値は蛍光強度です。 - ROIマネージャを開き、分析をクリックしてステップ5.1で保存したROIをロードします。ツール |ROIマネージャー。ROI マネージャーで、[その他] をクリックし、表示されるリストから [開く] をクリックして、保存した ROI を選択します。
- ROIマネージャーから保存されたROIを選択して、単一セル内の5つのランダム領域の蛍光強度を測定し、ROIをセル内のランダムな位置に移動します(図3E)。 Mを押して蛍光強度を測定します。オーバーラップしない 4 つの領域を追加して、この手順を繰り返します。面積と平均グレー値を含むダイアログボックスが表示されたら(図3F)、値をコピーしてスプレッドシートに貼り付けて分析します。
- TMRE 実験:画像を選択します(c = 2)。
- MitoSOX 実験: 画像を選択します (c = 2)。
- 平均蛍光強度値を求めます。表計算ソフトウェア( 材料表を参照)を使用して、5つの平均グレー値を平均します。セルごとにこのプロセスを繰り返します。
- 統計ソフトウェアプログラムを使用して、実験条件全体のTMREまたはMitoSOX平均グレー値を分析および比較します( 材料表を参照。図 4 および 図5)。データを棒グラフまたはバイオリンプロットとして表示します。
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Representative Results
このプロトコルでは、蛍光ベースの定量を使用して、CCCP処理後のミトコンドリアネットワークの膜電位とスーパーオキシドレベルを測定しました(図1)。このワークフローでは、子宮頸がん由来の不死化細胞株であるHeLa細胞を使用しました。HeLa細胞は、ミトコンドリア生物学の研究に日常的に使用されており、比較的平坦であるため、顕微鏡を使用してミトコンドリアネットワークを簡単に視覚化できます。ミトコンドリアネットワークの健康維持におけるパーキンの役割を調べるために、HeLa細胞に空のコントロールベクターであるパーキンWTまたはパーキンT240R (マイトファジーを破壊する変異体)を一時的にトランスフェクトしました21。HeLa細胞を35mmのガラス底イメージングディッシュに播種し、コンフルエントが~50%-60%に達したらトランスフェクトしました(図1A)。HeLa細胞は急速に分裂するため、これは通常、細胞をイメージングディッシュにプレーティングした翌日です。翌日、光学顕微鏡を使用してYFP蛍光シグナルを観察し、トランスフェクション効率を評価しました。実験は、トランスフェクションが成功した後にのみ実施されました。
検査後、HeLa細胞を軽度(5 μM)または重度(20 μM)の濃度のCCCPで処理して、ミトコンドリアネットワークを脱分極させました(ステップ1.2は、CCCPおよび蛍光プローブを調製するための詳細な手順を示しています)。CCCP処理を合計2時間行った。CCCP処理の最後の30分間、ミトコンドリアをMitoTrackerおよびTMRE/MitoSOXで標識しました(図1A)。なお、TMREとMitoSOXは蛍光スペクトルが重複しており、同時に使用することはできません。代わりに、TMREとMitoSOXの実験に別々のイメージングディッシュを使用しました。TMRE実験では、HeLa細胞は2時間のCCCP処理の終了時にすぐにイメージングの準備ができていました。TMRE濃度は一定でなければなりません。したがって、TMREはHeLaメディアに残りました。ただし、フリーのMitoSOXはイメージング前に削除する必要があります。MitoSOX実験では、細胞をHeLa培地で3回洗浄し、遊離色素を除去した。このステップでは、実験条件と同じDMSOまたはCCCP濃度を含むHeLa培地を使用することが必須です。核マーカーであるHoechst 33342は、一過性トランスフェクションおよびCCCP処理後のHeLa細胞を評価するために最初に使用されました(図1B)。
続いて、共焦点顕微鏡観察を行い、TMREおよびMitoSOX蛍光強度を可視化し、それぞれミトコンドリア膜電位およびスーパーオキシドレベルを測定した。画像は、双方向スキャンのパラメータ、1,024 x 1,024ピクセルの空間分解能、600 Hzのスキャン速度、3のライン平均化、22.61の位相、および1.5のズーム係数を備えた63倍(1.4 NA)の油浸対物レンズを使用して取得されました(図2C)。DMSOコントロールプレートを最初に画像化し、TMREおよびMitoSOXのゲイン値と強度値を設定しました。条件間で定量的に比較するには、これらの値をDMSO条件で設定し、実験全体を通して一定に保つ必要があります。CCCPは、ミトコンドリアの脱分極と膜電位の損失を誘発し、TMRE蛍光強度を低下させます。したがって、対照実験はTMRE強度が最も高く、ゲインと強度の値は飽和近くに設定されました。対照的に、スーパーオキシドレベルが高いほど、MitoSOX強度が増加します。したがって、コントロールはMitoSOX蛍光強度が最も低く、薄暗い信号が存在する場合はゲインと強度の値を低く設定しました。MitoTracker、TMRE、およびMitoSOXは重要な色素であり、すべての細胞を標識するため、イメージングする細胞を選択する際には使用しないでください。代わりに、細胞がトランスフェクトされていることを確認するために、YFPシグナルに基づいて細胞が選択されました。ミトコンドリアの大規模な集団が位置するHeLa細胞の底部に焦点を当てた単一平面画像が取得されました。
TMREおよびマイトSOX蛍光強度の定量化
TMREおよびMitoSOX蛍光強度の定量は、ImageJを用いて分析した(図3)。6ミクロンx6ミクロンのROIが作成され、ROIマネージャーに保存されました。ROIを各細胞の5つのランダムな非重複領域に配置し、TMREまたはMitoSOX強度を測定しました。蛍光強度は、ImageJの平均グレー値に対応する。5つの強度値を各細胞について平均し、細胞当たりの平均蛍光強度を算出した。これらの値をプロットし、治療条件全体の統計的有意性について分析した。
TMREおよびMitoSOX蛍光強度の結果をそれぞれ図 4 および 図5に示す。予想されたように、既知の脱共役剤CCCPによる処理は、対照条件と比較してTMRE蛍光強度を減少させた(図4A、B)。さらに、重度の(20 μM)CCCP処理はスーパーオキシド産生を誘導し、MitoSOX蛍光強度を増加させました(図5A、B)。軽度(5μM)CCCPストレス条件では、パーキンWT およびパーキンT240R の発現は、空のYFPコントロールベクターと比較してより高いTMRE強度をもたらした。同様に、パーキンWT およびパーキンT240R を発現する細胞では、YFPコントロールベクターを発現する細胞と比較してMitoSOX強度が低かった(図5A、B)。これらの結果は、パーキン発現が、より高いミトコンドリア膜電位と低いスーパーオキシドレベルを維持することによって、ミトコンドリアネットワークの健全性を維持するのに役立つことを示唆しています。したがって、ここで概説するプロトコルを使用して、蛍光強度を正確に比較し、ミトコンドリア膜電位とスーパーオキシド形成の制御におけるパーキンの役割を分析することができます。
図1:実験ワークフロー 。 (A)ミトコンドリアネットワークのトランスフェクション、CCCPによる処理、標識、およびHeLa細胞のTMREおよびMitoSOX蛍光強度の画像化に使用される実験ワークフローの概略図。(B)空のYFPベクターを発現する細胞の代表的な画像(上)、YFP-パーキンWT (中央)、およびYFP-パーキンT240R (下;マゼンタ)。ヘキスト33342(白)は、DNAを標識するために使用されます。スケールバー = 10 μm。略語:CCCP =カルボニルシアン化物m-クロロフェニルヒドラゾン;TMRE = テトラメチルローダミン - エチルエステル - 過塩素酸塩;YFP = 黄色蛍光タンパク質。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:共焦点撮影設定を設定するためのユーザーインターフェイス 。 (A)レーザー設定ダイアログボックス。赤い四角形は、白色光レーザー、出力状態、レーザー出力、および波長を強調表示します。(B)MitoSOX実験用に設定された実験チャネル。YFP、MitoSOX、およびMitoTrackerの設定、励起線、および発光スペクトルウィンドウが表示されます。(C)取得設定には、フォーマット、速度、双方向性、フェーズX、ズーム倍率、およびライン平均が表示されます。(D)代表的な取得画像。HeLa細胞はYFP(マゼンタ)を発現しており、ミトコンドリアはMitoSOX(緑)とMitoTracker(シアン)で標識されています。スケールバー = 10 μm。略語:WLL=白色光レーザー;YFP = 黄色蛍光タンパク質。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:TMREおよびMitoSOX蛍光強度を定量化するためのImageJワークフロー 。 (A) ImageJのROIの例を含むROIマネージャーパネル。(B)バイオフォーマットインポートオプションパネル。赤い四角形は、選択する必要がある [チャネルの分割 ]オプションを強調表示します。(C)明るさとコントラストの設定パラメータ。(D)測定パラメータを設定します。赤い四角形は、選択する必要がある [面積 ] と [平均] グレー値 オプションを強調表示します。(E)MitoSOXで標識したHeLa細胞の代表的な画像。赤い四角形は、パネル A からの ROI を示しています。スケールバー = 10 μm。 (F)実験領域とROIからの平均グレー値を示す結果パネル。平均グレー値(オレンジ色)は蛍光強度値を表す。略語:TMRE =テトラメチルローダミン - エチルエステル - 過塩素酸塩;ROI = 関心領域。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4:ミトコンドリア損傷後のTMRE蛍光強度。 (A)ミトコンドリア損傷を誘導するためにDMSO、5 μM CCCP、または20 μM CCCPで2時間処理した後のHeLa細胞の代表的な画像。細胞は、空のYFPベクター、YFP-パーキンWT、またはYFP-パーキンT240R(マゼンタ)を外来的に発現し、MitoTracker(シアン)およびTMRE(緑色)で標識しています。スケールバー = 30 μm。 (B)DMSOおよびCCCP処理条件における空のYFPベクター(青色)、YFP-パーキンWT(オレンジ色)、およびYFP-パーキンT240R(紫色)を発現する細胞のTMRE蛍光強度の定量化。p<多重比較検定による二元配置分散分析による0.0001。(C-E)パネルBからのTMRE蛍光強度の定量は、DMSO(C)、5 μM CCCP(D)、および20 μM CCCP(E)の違いを強調するために分離されています。* p < 0.05;p < 0.001;p < 0.0001 クラスカル・ウォリスANOVAとダンの多重比較検定による。Ns = 有意ではありません。SEM±平均;3つの独立した生物学的複製からのn = 79-104。略語:CCCP =カルボニルシアン化物m-クロロフェニルヒドラゾン;TMRE = テトラメチルローダミン - エチルエステル - 過塩素酸塩;YFP = 黄色蛍光タンパク質;DMSO = ジメチルスルホキシド。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図5:ミトコンドリアネットワークの損傷後のMitoSOX蛍光強度。 (A)ミトコンドリア膜電位を切り離すためにDMSO、5 μM CCCP、または20 μM CCCPで2時間処理したHeLa細胞の代表的な画像。細胞を空のYFPベクター、YFP-パーキンWTまたはYFP-パーキンT240R(マゼンタ)でトランスフェクトし、MitoTracker(シアン)およびMitoSOX(緑色)で標識した。スケールバー = 30 μm。 (B)対照および処理条件における空のYFPベクター(青色)、YFP-パーキンWT(オレンジ色)、およびYFP-パーキンT240R(紫色)を発現する細胞のMitoSOX蛍光強度の定量化。p < 0.0001 ダンの多重比較検定による二元配置分散分析による。(C-E)パネルBからのMitoSOX蛍光強度の定量化は、DMSO(C)、5 μM CCCP(D)、および20 μM CCCP(E)の違いを強調するために分離されています。*p < 0.05;p < 0.0001 クラスカル・ウォリスANOVAとダンの多重比較検定による。Ns = 有意ではありません。SEM±平均;n = 87-107 3つの独立した生物学的複製から。略語:CCCP =カルボニルシアン化物m-クロロフェニルヒドラゾン;TMRE = テトラメチルローダミン - エチルエステル - 過塩素酸塩;YFP = 黄色蛍光タンパク質;DMSO = ジメチルスルホキシド。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
ここで概説するワークフローは、蛍光ベースのイメージングを用いて、ミトコンドリア膜電位およびスーパーオキシドレベルを堅牢かつ再現性よく定量するために使用することができる30。これらの実験を設計する際に考慮すべき重要な技術的制限があります。HeLa細胞を、空のYFPベクター、YFP-パーキンWT、またはYFP-パーキンT240Rでトランスフェクトした。空のYFPベクターを対照として使用し、実験所見がパーキンに特異的であることを確認した。一過性トランスフェクションでは、DNAとトランスフェクション試薬の質量比を1:3と実験的に決定し、トランスフェクション率が最も高いようにし、各コンストラクトに2 μgのプラスミドDNAを使用しました28。蛍光タンパク質は生来の輝度が異なるため、すべてのコンストラクトでYFPタグを一定に保つことが重要でした31,32。複数の蛍光タンパク質タグを使用する必要がある場合は、同様の輝度と光安定性を持つ蛍光タンパク質を選択する必要があります33。
ミトコンドリア膜電位とスーパーオキシドレベルを測定するために、十分に文書化された2つの色素を選択しました。TMREの蛍光シグナルはミトコンドリア膜電位に基づいていますが、MitoSOX蛍光強度はスーパーオキシドレベルの関数です。蛍光ベースのイメージングでは、蛍光プローブ間にスペクトルの重複があってはなりません。ただし、最初のプロトコルは、TMREおよびMitoSOXの赤方偏移スペクトルと重複するmCherry-ParkinWTおよびmCherry-ParkinT240Rを使用して実行されました。スペクトルの重複を回避し、潜在的なクロストークを最小限に抑えるために、YFPタグ付きパーキンコンストラクトを選択しました。この調整により、MitoTracker色素を緑から遠赤に変更する必要が生じました。さらに、HeLa細胞のプレーティング密度が最適化されました。当初、HeLa細胞はイメージングディッシュあたり45,000細胞で播種されていましたが、その結果、ディッシュが過剰にコンフルエントになりました。高い細胞コンフルエンシーは、トランスフェクション効率を低下させ、細胞死を促進し、細胞代謝を変化させる可能性がある34,35,36。これらの潜在的な影響を回避するために、細胞をイメージングディッシュあたり30,000個の細胞の密度で播種した。
このプロトコルの主な制限は、特にセルとROIの場所を選択するときに、ユーザーバイアスが発生する可能性があることです。このプロトコルでは、TMREおよびMitoSOX蛍光強度の変化を、膜電位およびスーパーオキシドレベルの機能的読み出しとして使用します。したがって、これらのプローブを使用した細胞選択は、実験結果にバイアスをかける可能性があります。このバイアスに対抗するために、YFP発現のみに基づいて細胞を選択しました。重複しないROIは、細胞内のミトコンドリアネットワーク全体でランダムに選択されました。この方法は以前は蛍光強度の測定に使用されていましたが27、追加のバイアス低減対策を講じることができます。まず、ImageJの ブラインド分析ツールを使用して 研究を盲検化し、期待される結果をサポートするROIの選択を防ぐことができます。第二に、ROIの必要性を排除する高度な画像解析ソフトウェアを使用して蛍光強度を測定できます。
このプロトコルでは、蛍光ベースの定量に共焦点顕微鏡を使用しますが、フローサイトメトリーなどの追加の方法を使用して、TMREおよびMitoSOX37の蛍光変化を定量することができます。ここでは、フローサイトメトリーではなく共焦点顕微鏡を使用して、ミトコンドリアネットワークの形態を視覚化しました。概説されたプロトコルは、フローサイトメトリーでTMREおよびMitoSOX蛍光を測定するために簡単に適合させることができ、同様の実験結果が得られました。さらに、酸素消費速度(OCR)アッセイを使用して、カチオン色素なしでミトコンドリア電子伝達鎖の機能の変化を検出することができます。OCRはミトコンドリア機能障害の高感度な尺度を提供しますが、膜電位やスーパーオキシド濃度に特異的ではなく、ミトコンドリア機能のグローバルな尺度を提供します38。これらのアッセイは、TMREおよびMitoSOX実験と組み合わせて実行して、ミトコンドリアの健康状態を評価することができます39。
このプロトコルは、特にミトコンドリアアンカプラーCCCP40の効果に焦点を当てていますが、代替メカニズムを備えた損傷試薬を利用することができます。例えば、抗マイシンAおよびオリゴマイシンAは、活性酸素種(ROS)産生を介してミトコンドリア損傷を誘導するために一般的に使用される電子伝達系阻害剤である38。具体的にはMitoSOXを用いてミトコンドリアのスーパーオキシド濃度を測定しましたが、細胞内ROSはCellROXを用いて測定することができました。HeLa細胞では、内因性発現が低いためパーキンを過剰発現させる必要があった。今後の研究では、内因性パーキン41を発現する細胞培養系を用いて、ミトコンドリアネットワークの健康に対するパーキン発現の影響を観察することができる。ミトコンドリアはエネルギー代謝と細胞の恒常性の重要な調節因子であるため、ミトコンドリアの機能不全は、糖尿病42、アルツハイマー病43、44、45、癌46、肝疾患47などの多くの疾患に関連しています。したがって、このワークフローは、関連する細胞株および初代培養におけるミトコンドリアの健康および調節不全の研究に適合させることができる。
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Disclosures
著者には、宣言する競合する利益はありません。
Acknowledgments
この原稿に対する思慮深いフィードバックを提供してくれたEvansラボのメンバーに感謝します。この研究は、デュークホワイトヘッド奨学生、デューク科学技術奨学生、およびハワードヒューズ医学研究所(HHMI)ハンナグレイフェローシップによってサポートされています。 図1A は BioRender.com を用いて作製した。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals, Peptides, and Recombinant Proteins | |||
| CCCP (carbonyl cyanide m-chlorophenyl hydrazone) | Sigma-Aldrich | C2759 | |
| DMEM (1x) with 4.5 g/L glucose | Gibco | 11-965-084 | |
| DMSO, Anhydrous | ThermoFisher Scientific | D12345 | |
| Fetal Bovine Serum | Hyclone | SH3007103 | |
| FuGENE 6 (Tranfection Reagent) | Promega | E2691 | |
| GlutaMAX 100x (L-Glutamine Solution) | Gibco | 35-050-061 | |
| Hoescht 33342 | ThermoFisher Scientific | 62249 | |
| MitoSOX Red | ThermoFisher Scientific | M36008 | |
| MitoTracker Deep Red | ThermoFisher Scientific | M7514 | |
| Opti-MEM (Redued Serum media) | ThermoFisher scientific | 31985070 | |
| Tetramethylrhodamine, Ethyl Ester, Perchlorate (TMRE) | ThermoFisher Scientific | T669 | |
| Experimental models: Organisms/Strains | |||
| HeLa-M (Homo sapiens) | A. Peden (Cambridge Institute for Medical Research) | N/A | |
| Recombinant DNA | |||
| EYFP Empty Vector | N/A | N/A | |
| YFP-Parkin T240R | This Paper | Generated by site-directed mutagenesis from YFP-Parkin | |
| YFP-Parkin WT | Addgene; PMID:19029340 | RRID:Addgene_23955 | |
| Software and Algorithms | |||
| Adobe Illustrator | Adobe Inc. | https://www.adobe.com/products/illustrator | (Schindelin, 2012) |
| Excel (Spreadsheet Software) | Microsoft Office | https://www.microsoft.com/en-us/microsoft-365/excel | |
| ImageJ | https://imagej.net/software/fiji/ | ||
| Leica Application Suite (LAS X) | Leica | https://www.leica-microsystems.com/products/microscope-software/p/leica-las-x-ls/ | |
| Microsoft Excel | Microsoft Office | https://www.microsoft.com/excel | |
| Prism9 (Statistical Analysis Software) | GraphPad Software | https://www.graphpad.com | |
| Other | |||
| 35 mm Dish, No. 1.5 Coverslip, 20 mm Glass Diameter, Uncoated | MatTek | P35G-1.5-20-C | |
| Cage Incubator (Environmental Chamber) | Okolab | https://www.oko-lab.com/cage-incubator | |
| DMiL Inverted Microscope | Leica | N/A | |
| LIGHTNING Deconvolution Software | Leica | N/A | |
| STELLARIS 8 confocal microscope | Leica | N/A |
References
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