HeLa細胞におけるライブイメージングを用いたミトコンドリア膜電位およびスーパーオキシドレベルの蛍光ベースの定量
Summary
この手法では、蛍光ベースのライブイメージングを使用して、HeLa細胞内のミトコンドリア膜電位とスーパーオキシドレベルを視覚化し、定量的に測定するための効果的なワークフローについて説明します。
Abstract
ミトコンドリアは、ATP合成 を介して エネルギー産生を制御することにより、代謝恒常性に不可欠な動的オルガネラです。細胞の代謝をサポートするために、さまざまなミトコンドリアの品質管理メカニズムが連携して、健康なミトコンドリアネットワークを維持します。そのような経路の1つはマイトファジーであり、PTEN誘導キナーゼ1(PINK1)と損傷したミトコンドリアのパーキンホスホユビキチン化は、オートファゴソームの隔離とその後のリソソーム融合 による 細胞からの除去を促進します。マイトファジーは細胞の恒常性にとって重要であり、パーキンの変異はパーキンソン病(PD)に関連しています。これらの発見により、ミトコンドリアの品質管理の分子メカニズムとダイナミクスを理解するために、ミトコンドリアの損傷と代謝回転の研究に大きな重点が置かれてきました。ここでは、生細胞イメージングを使用してHeLa細胞のミトコンドリアネットワークを視覚化し、ミトコンドリア脱共役剤であるカルボニルシアン化m-クロロフェニルヒドラゾン(CCCP)で処理した後のミトコンドリア膜電位とスーパーオキシドレベルを定量化しました。さらに、パーキン依存性マイトファジーを阻害するパーキンのPD結合変異(パーキンT240R)を発現させ、変異発現が野生型パーキンを発現する細胞と比較してミトコンドリアネットワークにどのように影響するかを決定しました。ここで概説するプロトコルは、ミトコンドリア膜電位とスーパーオキシドレベルを効果的に定量するための蛍光ベースのアプローチを使用した簡単なワークフローを説明しています。
Introduction
ミトコンドリアネットワークは、エネルギー生産1、自然免疫2,3、および細胞シグナル伝達4,5において重要な役割を果たす一連の相互接続された細胞小器官です。ミトコンドリアの調節不全は、パーキンソン病(PD)などの神経変性疾患と関連しています6,7。PDは、黒質のドーパミン作動性ニューロンに影響を与える進行性の神経変性疾患であり、世界中で約1,000万人が罹患しています8。PDは、損傷したミトコンドリアを選択的に除去する細胞の恒常性を維持するために必要なミトコンドリアの品質管理経路であるマイトファジーと遺伝的に関連しています9,10。研究により、1(FUNDC1)を介したマイトファジーを含むFUN14ドメイン、Bcl-2相互作用タンパク質3(BNIP3)促進マイトファジー、NIX依存性マイトファジー、および十分に特徴付けられたPTEN誘導キナーゼ1(PINK1)/パーキン調節マイトファジー10,11を含む複数の独立したマイトファジー経路が特定されています。PINK1(推定されるキナーゼ)とパーキン(E3ユビキチンリガーゼ)は連携して働き、損傷したミトコンドリアをリン酸ユビキチン化し、損傷した細胞小器官を飲み込み、リソソームと融合して分解を開始するオートファゴソームの形成を促進します12,13,14,15,16。パーキンの変異は、ドーパミン作動性ニューロンの喪失を介した神経変性などのPD結合表現型と関連しています17,18。
ここでは、子宮頸がん由来の不死化細胞であるHeLa細胞を使用して、ミトコンドリアネットワークの健康を維持する上でのパーキンの役割を調査するプロトコルについて説明します。HeLa細胞はごくわずかなレベルの内因性パーキンを発現するため、外因性パーキン発現が必要です19。ミトコンドリアネットワークの健康におけるパーキンの役割を研究するために、HeLa細胞を野生型パーキン(パーキンWT)、パーキン変異体(パーキンT240R)、または空のコントロールベクターのいずれかでトランスフェクトします。パーキンT240Rは、パーキンE3リガーゼ活性に影響を及ぼす常染色体劣性若年性パーキンソニズム変異であり、マイトファジー経路20の効率を著しく低下させる。HeLa細胞は、ミトコンドリア脱共役剤であるカルボニルシアン化物m-クロロフェニルヒドラゾン(CCCP)の軽度(5 μM)または重度(20 μM)濃度にさらされます。高濃度のCCCPによる処理は、HeLaおよびCOS-7細胞などの様々な細胞株においてパーキン媒介マイトファジーを誘導するために日常的に使用されている21、22、23。
治療後、プロトコルは、現在利用可能な2つのミトコンドリア標的蛍光色素を使用したミトコンドリアネットワークのライブイメージングを使用します。テトラメチルローダミン、エチルエステル、過塩素酸塩(TMRE)は、ミトコンドリア膜電位24に基づいて蛍光を発するカチオン色素であり、MitoSOXは、蛍光強度がスーパーオキシド濃度25の関数であるミトコンドリアスーパーオキシドインジケーターです。最後に、概説したプロトコルは、蛍光ベースの定量とシンプルなワークフローを使用して、ユーザーのバイアスの範囲を最小限に抑えながら、ミトコンドリア膜電位とスーパーオキシドレベルを効果的に定量します。このプロトコルは、HeLa細胞のミトコンドリア機能を研究するために設計されましたが、ミトコンドリアネットワークの健全性を定量的に特徴付けるために、追加の細胞株および初代細胞タイプに適合させることができます。
Protocol
Representative Results
Discussion
ここで概説するワークフローは、蛍光ベースのイメージングを用いて、ミトコンドリア膜電位およびスーパーオキシドレベルを堅牢かつ再現性よく定量するために使用することができる30。これらの実験を設計する際に考慮すべき重要な技術的制限があります。HeLa細胞を、空のYFPベクター、YFP-パーキンWT、またはYFP-パーキンT240Rでトランスフェクトした。空…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この原稿に対する思慮深いフィードバックを提供してくれたEvansラボのメンバーに感謝します。この研究は、デュークホワイトヘッド奨学生、デューク科学技術奨学生、およびハワードヒューズ医学研究所(HHMI)ハンナグレイフェローシップによってサポートされています。 図1A は BioRender.com を用いて作製した。
Materials
| Chemicals, Peptides, and Recombinant Proteins | |||
| CCCP (carbonyl cyanide m-chlorophenyl hydrazone) | Sigma-Aldrich | C2759 | |
| DMEM (1x) with 4.5 g/L glucose | Gibco | 11-965-084 | |
| DMSO, Anhydrous | ThermoFisher Scientific | D12345 | |
| Fetal Bovine Serum | Hyclone | SH3007103 | |
| FuGENE 6 (Tranfection Reagent) | Promega | E2691 | |
| GlutaMAX 100x (L-Glutamine Solution) | Gibco | 35-050-061 | |
| Hoescht 33342 | ThermoFisher Scientific | 62249 | |
| MitoSOX Red | ThermoFisher Scientific | M36008 | |
| MitoTracker Deep Red | ThermoFisher Scientific | M7514 | |
| Opti-MEM (Redued Serum media) | ThermoFisher scientific | 31985070 | |
| Tetramethylrhodamine, Ethyl Ester, Perchlorate (TMRE) | ThermoFisher Scientific | T669 | |
| Experimental models: Organisms/Strains | |||
| HeLa-M (Homo sapiens) | A. Peden (Cambridge Institute for Medical Research) | N/A | |
| Recombinant DNA | |||
| EYFP Empty Vector | N/A | N/A | |
| YFP-Parkin T240R | This Paper | Generated by site-directed mutagenesis from YFP-Parkin | |
| YFP-Parkin WT | Addgene; PMID:19029340 | RRID:Addgene_23955 | |
| Software and Algorithms | |||
| Adobe Illustrator | Adobe Inc. | https://www.adobe.com/products/illustrator | (Schindelin, 2012) |
| Excel (Spreadsheet Software) | Microsoft Office | https://www.microsoft.com/en-us/microsoft-365/excel | |
| ImageJ | https://imagej.net/software/fiji/ | ||
| Leica Application Suite (LAS X) | Leica | https://www.leica-microsystems.com/products/microscope-software/p/leica-las-x-ls/ | |
| Microsoft Excel | Microsoft Office | https://www.microsoft.com/excel | |
| Prism9 (Statistical Analysis Software) | GraphPad Software | https://www.graphpad.com | |
| Other | |||
| 35 mm Dish, No. 1.5 Coverslip, 20 mm Glass Diameter, Uncoated | MatTek | P35G-1.5-20-C | |
| Cage Incubator (Environmental Chamber) | Okolab | https://www.oko-lab.com/cage-incubator | |
| DMiL Inverted Microscope | Leica | N/A | |
| LIGHTNING Deconvolution Software | Leica | N/A | |
| STELLARIS 8 confocal microscope | Leica | N/A |
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