Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Fluorescensbaseret kvantificering af mitokondriemembranpotentiale og superoxidniveauer ved hjælp af levende billeddannelse i HeLa-celler

Published: May 12, 2023 doi: 10.3791/65304
Automatic Translation
1, 1
1Department of Cell Biology, Duke University Medical Center

Summary

Denne teknik beskriver en effektiv arbejdsgang til at visualisere og kvantitativt måle mitokondriemembranpotentiale og superoxidniveauer i HeLa-celler ved hjælp af fluorescensbaseret levende billeddannelse.

Abstract

Mitokondrier er dynamiske organeller, der er kritiske for metabolisk homeostase ved at kontrollere energiproduktionen via ATP-syntese. For at understøtte cellulær metabolisme samarbejder forskellige mitokondrie kvalitetskontrolmekanismer for at opretholde et sundt mitokondrienetværk. En sådan vej er mitofagi, hvor PTEN-induceret kinase 1 (PINK1) og Parkin phospho-ubiquitination af beskadigede mitokondrier letter autofagosomsekvestrering og efterfølgende fjernelse fra cellen via lysosomfusion. Mitofagi er vigtig for cellulær homeostase, og mutationer i Parkin er forbundet med Parkinsons sygdom (PD). På grund af disse resultater har der været en betydelig vægt på at undersøge mitokondrieskader og omsætning for at forstå de molekylære mekanismer og dynamikker i mitokondriel kvalitetskontrol. Her blev levende cellebilleddannelse brugt til at visualisere mitokondrienetværket af HeLa-celler til at kvantificere mitokondriemembranpotentialet og superoxidniveauerne efter behandling med carbonylcyanid m-chlorphenylhydrazon (CCCP), et mitokondrielt afkoblingsmiddel. Derudover blev en PD-bundet mutation af Parkin (ParkinT240R), der hæmmer Parkin-afhængig mitofagi, udtrykt for at bestemme, hvordan mutant ekspression påvirker mitokondrienetværket sammenlignet med celler, der udtrykker vildtype Parkin. Protokollen skitseret her beskriver en simpel arbejdsgang ved hjælp af fluorescensbaserede tilgange til effektivt at kvantificere mitokondriemembranpotentiale og superoxidniveauer.

Introduction

Mitokondrienetværket er en række indbyrdes forbundne organeller, der spiller en afgørende rolle i energiproduktion1, medfødt immunitet2,3 og cellesignalering 4,5. Mitokondriel dysregulering har været forbundet med neurodegenerative sygdomme såsom Parkinsons sygdom (PD)6,7. PD er en progressiv neurodegenerativ lidelse, der påvirker dopaminerge neuroner i substantia nigra, der påvirker næsten 10 millioner mennesker verden over8. PD har været genetisk forbundet med mitofagi, en mitokondriel kvalitetskontrolvej, der er nødvendig for at opretholde cellulær homeostase, der selektivt fjerner beskadigede mitokondrier 9,10. Undersøgelser har identificeret flere uafhængige mitofagiveje, herunder FUN14-domæne indeholdende 1 (FUNDC1)-medieret mitofagi, Bcl-2-interagerende protein 3 (BNIP3)-faciliteret mitofagi, NIX-afhængig mitofagi, og den velkarakteriserede PTEN-inducerede kinase 1 (PINK1)/Parkin-regulerede mitofagi:10,11. PINK1 (en formodet kinase) og Parkin (en E3 ubiquitin ligase) arbejder sammen for at phospho-ubiquitinere beskadigede mitokondrier, som driver dannelsen af autofagosomer, der opsluger den beskadigede organel og smelter sammen med lysosomer for at indlede nedbrydning 12,13,14,15,16. Mutationer i Parkin har været forbundet med PD-bundne fænotyper såsom neurodegeneration via tab af dopaminerge neuroner17,18.

Her beskrives en protokol, hvor HeLa-celler, rutinemæssigt anvendte udødeliggjorte celler afledt af livmoderhalskræft, bruges til at undersøge Parkins rolle i at opretholde mitokondrienetværkets sundhed. HeLa-celler udtrykker ubetydelige niveauer af endogen Parkin og kræver derfor eksogen Parkin-ekspression19. For at studere Parkins rolle i mitokondrienetværkets sundhed transfekteres HeLa-celler med enten vildtype Parkin (ParkinWT), en Parkin-mutant (ParkinT240R) eller en tom kontrolvektor. ParkinT240R er en autosomal recessiv juvenil parkinsonismemutation, der påvirker Parkin E3-ligaseaktivitet, hvilket signifikant reducerer effektiviteten af mitofagivejen20. HeLa-celler udsættes for milde (5 μM) eller svære (20 μM) koncentrationer af carbonylcyanid m-chlorphenylhydrazon (CCCP), et mitokondrielt afkoblingsmiddel. Behandling med alvorlige koncentrationer af CCCP anvendes rutinemæssigt til at inducere Parkin-medieret mitofagi, i forskellige cellelinjer, såsom HeLa- og COS-7-celler21,22,23.

Efter behandling anvender protokollen levende billeddannelse af mitokondrienetværket ved hjælp af to aktuelt tilgængelige mitokondriemålrettede fluorescerende farvestoffer. Tetramethylrhodamin, ethylester, perchlorat (TMRE) er et kationisk farvestof, der fluorescerer baseret på mitokondriemembranpotentiale24, mens MitoSOX er en mitokondriel superoxidindikator, hvor fluorescensintensiteten er en funktion af superoxidkoncentrationen25. Endelig bruger den skitserede protokol en fluorescensbaseret kvantificering og enkel arbejdsgang til effektivt at kvantificere mitokondriemembranpotentialet og superoxidniveauerne med minimal plads til brugerbias. Selvom denne protokol blev designet til at studere mitokondriefunktion i HeLa-celler, kan den tilpasses til yderligere cellelinjer og primære celletyper for kvantitativt at karakterisere mitokondrienetværkets sundhed.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Forberedelse af biologiske prøver

BEMÆRK: Udfør følgende trin ved hjælp af steril teknik i et biosikkerhedsskab. Sprøjt kabinets overflade og alle materialer med 70% ethanol.

  1. HeLa-celledyrkning og transfektion
    1. Dyrkning af 30.000 HeLa-celler i Dulbeccos modificerede ørnemedium (DMEM) indeholdende 4,5 g / L glucose suppleret med 10% føtalt bovint serum og 1% L-glutaminopløsning (HeLa media; se materialetabel). Pladen cellerne på 35 mm glasbundede billedbehandlingsskåle (seMaterialer), der indeholder 2 ml forvarmede HeLa-medier. HeLa-kulturerne opretholdes ved 5% CO2 og 37 ° C26,27.
    2. Dagen efter plettering skal du inspicere 35 mm billeddannelsesskålene ved hjælp af et lysmikroskop for at sikre, at cellerne er ~ 50% -60% sammenflydende. Når de er sammenflydende, transfekteres HeLa-cellerne med tom gul fluorescerende protein (YFP) vektor, YFP-ParkinWT eller YFP-ParkinT240R (figur 1A).
    3. Forbered to separate blandinger i sterile mikrocentrifugerør til hver transfektion. Bland ved at banke røret eller forsigtigt pipettere op og ned.
      1. I reagensglas 1 blandes 200 μL reducerede serummedier (se materialetabel) med 2 μg plasmid-DNA.
      2. I tube 2 blandes 200 μL reduceret serummedie med 6 μL transfektionsreagens (se materialetabel)28.
    4. Inkuber glassene i 5 minutter ved stuetemperatur (RT). Tilsæt tube 2 til tube 1, bland ved pipettering op og ned, og inkuber i 20 min ved RT.
    5. Tilføj transfektionskomplekserne dråbevis til de eksisterende billeddannende skåle, der indeholder HeLa-cellekulturerne, hvilket sikrer en ligelig fordeling over hele skålen. Placer billeddannelsesskålene i 5% CO2 og 37 °C inkubatoren natten over.
      BEMÆRK: Mærk hver skål med det passende transfekterede plasmid. For hvert eksperiment mærkes de tre YFP-Parkin WT-skåle (dimethylsulfoxid [DMSO; se materialetabel], 5 μM CCCP og 20 μM CCCP). Gentag mærkningen med de tre YFP-ParkinT240R-skåle og de tre tomme YFP-vektorskåle.
  2. Fremstilling af CCCP og fluorescerende farvestoffer
    FORSIGTIG: Fluorescerende farvestoffer er ofte lysfølsomme. Opbevar farvestofferne i mørke ved hjælp af aluminiumsfolie eller brune centrifugerør for at reducere eksponeringen for lys.
    1. Lav et 5 mM arbejdsmateriale af CCCP (se tabel over materialer) ved at opløse 5 mg CCCP i 4,89 ml DMSO. Lav en 20 mM arbejdsbestand af CCCP ved at opløse 5 mg CCCP i 1,22 ml DMSO.
    2. Fortynd 10 μL af en 1 mM MitoTracker Deep Red (se materialetabel) stamopløsning i 390 μL DMSO for at lave en 25 μM arbejdsstamme.
    3. 50 μg MitoSOX Red25 (se materialetabellen) opløses i 13 μL DMSO for at skabe et 5 mM arbejdsmateriale.
    4. 10 mg TMRE24 (se materialetabel) opløses i 19,4 ml DMSO til en 1 mM stamopløsning. TMRE fortyndes ved at tilsætte 10 μL 1 mM TMRE i 990 μL DMSO for at lave et 10 μM arbejdsmateriale.

2. CCCP-behandling og mitokondriemærkning med fluorescerende sonder i HeLa-celler

FORSIGTIG: Udfør følgende trin hurtigt for at sikre, at HeLa-cellerne ikke er ude af inkubatoren i længere tid.

  1. Dagen efter transfektionen tilsættes 2 μL af enten 5 eller 20 mM CCCP (slutkoncentration: henholdsvis 5 μM og 20 μM) til hver forsøgsplade. Til kontrolplader tilsættes 2 μL DMSO. Pladerne sættes tilbage i 5 % CO2 og 37 °C inkubatoren i 1,5 timer (figur 1A).
    BEMÆRK: CCCP-behandlingen varer i alt 2 timer. Mitokondrierne er dog mærket med fluorescerende sonder i løbet af de sidste 30 minutter af CCCP-behandlingen.
  2. Efter 1,5 timer fjernes pladerne fra inkubatoren og tilsættes fluorescerende sonder til billeddannelsesskålene. Pladerne sættes tilbage i 5 % CO2 og 37 °C inkubatoren i 30 minutter (figur 1A).
    1. TMRE-eksperiment: Der tilsættes 2 μL 25 μM MitoTracker (slutkoncentration: 25 nM) og 2 μL 10 μM TMRE (slutkoncentration: 10 nM).
    2. MitoSOX eksperiment: Tilføj 2 μL 25 μM MitoTracker (endelig koncentration: 25 nM) og 1 μL 5 mM MitoSOX (endelig koncentration: 2,5 μM).
  3. Efter 2 timers CCCP-behandling skal HeLa-cellerne klargøres til billeddannelse (figur 1A, B).
    1. TMRE-eksperiment: HeLa-celler er straks klar til afbildning; sikre, at TMRE forbliver i HeLa-cellekulturmediet.
    2. MitoSOX-eksperiment: Vask cellerne 3x med 2 ml forvarmede HeLa-medier for at fjerne gratis MitoSOX-farvestof. Tilsæt 2 ml forvarmede medier. HeLa-cellerne er nu klar til afbildning.
      BEMÆRK: Vask HeLa-cellerne med friske, forvarmede HeLa-medier, der indeholder den samme DMSO- eller CCCP-koncentration som den eksperimentelle tilstand; medtag ikke MitoSOX eller MitoTracker.

3. Opsætning af konfokal mikroskopbilledoptagelse

BEMÆRK: Tag billeder af HeLa-cellerne ved hjælp af et konfokalmikroskop (se materialetabel) udstyret med et 63x/1,40 numerisk blænde (NA) olienedsænkningsmål og et miljøkammer (se materialetabel).

  1. Efter 1 time før billeddannelse tændes CO2 ved at åbne tankventilen. Tryk på tænd-knappen for at tænde mikroskopets miljøregulator. Brug pil op og pil ned på touchpad'en til at justere temperaturen til 37 °C og CO2 til 5 %. Tryk på Indstil , når du er færdig.
    BEMÆRK: Sørg for, at dørene til miljøkammeret er lukkede, og vent på, at forholdene stabiliseres.
  2. Laserindstillinger
    1. Tænd for White Light Laser (WLL), og indstil lasereffekten til 85% og excitationskontrollen til maksimal effekt. Klik på fanen Anskkaffe, vælg Tilføj laser, og skift WLL til Til i dialogboksen, der vises. Klik på knappen Lasertænd/sluk, og indtast 85 %. Klik på knappen Excitationskontrol, og vælg Maksimal effekt i rullemenuen (figur 2A).
    2. TMRE-eksperiment: Indstil excitations- og emissionsspektrene for YFP, MitoTracker og TMRE.
      1. For YFP skal du indstille excitationslaseren til 514 nm og emissionsspektrevinduet til 524-545 nm. På fanen Hent skal du klikke på knappen Tilføj ny indstilling; klik derefter på Tilføj laser, og træk den til indstilling 1. Dobbeltklik på excitationslinjen og indtast 514 som bølgelængde i dialogboksen. Dobbeltklik på den tilsvarende detektor og indtast 524 for begyndelsen og 545 for slutbølgelængden.
      2. For MitoTracker Deep Red skal du indstille excitationslaseren til 641 og emissionsspektrevinduet til 650-750 nm. På fanen Erhverv skal du klikke på knappen Tilføj laser og trække den til indstilling 1. Dobbeltklik på excitationslinjen og indtast 641 som bølgelængde i dialogboksen. Dobbeltklik på den tilsvarende detektor og indtast 650 for begyndelsen og 750 for slutbølgelængden.
      3. For TMRE skal du indstille excitationslaseren til 555 nm og emissionsspektrevinduet til 557-643 nm. På fanen Hent skal du klikke på knappen Tilføj ny indstilling; klik derefter på knappen Tilføj laser, og træk den til indstilling 2. Dobbeltklik på excitationslinjen og indtast 555 som bølgelængde i dialogboksen. Dobbeltklik på den tilsvarende detektor og indtast 557 for begyndelsen og 643 for slutbølgelængden.
    3. MitoSOX eksperiment: Indstil excitations- og emissionsspektrene for YFP, MitoTracker og MitoSOX (figur 2B).
      1. For YFP skal du indstille excitationslaseren til 507 nm og emissionsspektrevinduet til 517-540 nm. På fanen Hent skal du klikke på knappen Tilføj ny indstilling; klik derefter på Tilføj laser knappen og træk den til indstilling 1. Dobbeltklik på excitationslinjen og indtast 507 som bølgelængde i dialogboksen. Dobbeltklik på den tilsvarende detektor og indtast 517 for begyndelsen og 540 for slutbølgelængden.
      2. For MitoSOX skal du indstille excitationslaseren til 547 nm og emissionsspektrevinduet til 564-636 nm. På fanen Hent skal du klikke på knappen Tilføj ny indstilling ; klik derefter på knappen Tilføj laser , og træk den til indstilling 2. Dobbeltklik på excitationslinjen og indtast 547 som bølgelængde i dialogboksen. Dobbeltklik på den tilsvarende detektor og indtast 564 for begyndelsen og 636 for slutbølgelængden.
      3. For MitoTracker Deep Red skal du indstille excitationslaseren til 641 nm og emissionsspektrevinduet til 652-742 nm. På fanen Hent skal du klikke på knappen Tilføj ny indstilling; klik på knappen Tilføj laser, og træk den til indstilling 3. Dobbeltklik på excitationslinjen og indtast 641 som bølgelængde i dialogboksen. Dobbeltklik på den tilsvarende detektor og indtast 652 for begyndelsen og 742 for slutbølgelængden.
  3. Indstillinger for billedoptagelse (figur 2C)
    1. Indstil formatet til 1.024 x 1.024, scanningshastigheden til 600 Hz og linjegennemsnittet til 3.
      1. Vælg fanen Anskaffelse, og klik på knappen Format . Fra rullemenuen skal du vælge 1,024 x 1,024. Klik på knappen Hastighed , og vælg 600 i rullemenuen. Klik derefter på knappen Linjegennemsnit , og vælg 3 i rullemenuen.
      2. Slå Tovejsscanning til, og indstil fase- og zoomfaktoren til henholdsvis 22,61 og 1,50.
        1. På fanen Anskaffelse skal du skifte tovejsknappen til Til. Klik på indstillingen Fase X , og indstil den til 22.61. Klik på indstillingen Zoomfaktor , og indstil den til 1,50.

4. Optagelse af billeder

FORSIGTIG: Eksperimentatoren skal foretage en visuel vurdering for at vælge cellerne baseret på YFP-fluorescenssignalet. Undgå overmættede pixels, da de kan påvirke kvantificeringen af fluorescensintensiteten betydeligt. Brug en over/under-opslagstabel, der angiver pixelmætning for at undgå at hente mættede billeder.

  1. Klik på indstillingen af interesse, og tryk på Fast Live for at give en live forhåndsvisning af fluorescensbilledet.
  2. Juster forstærkningen og intensiteten ved at dobbeltklikke på den tilsvarende detektor. I dialogboksen, der vises, skal du justere forstærkningen ved hjælp af skyderen. For at ændre intensiteten skal du dobbeltklikke på excitationslinjen og bruge pil op og pil ned i popup-vinduet for at ændre intensiteten. Klik på Stop for at afslutte eksemplet.
    1. TMRE-eksperiment : Tag først et billede af DMSO-kontrolpladen . Juster forstærkningen og intensiteten af TMRE-signalet (indstilling 2), så mitokondrienetværksintensiteten er lige under mætning; Hold forstærkningen og intensiteten konstant for eksperimentet. Juster forstærkningen og intensiteten af MitoTracker og YFP (indstilling 1), så mitokondrienetværket er synligt, men svagt.
    2. MitoSOX-eksperiment: Tag først et billede af DMSO-kontrolpladen. Juster forstærkningen og intensiteten af MitoSOX-signalet (indstilling 2), så fluorescensen er synlig, men svag; Hold forstærkningen og intensiteten konstant for eksperimentet. Juster forstærkningen og intensiteten af YFP (indstilling 1) og MitoTracker (indstilling 3), så mitokondrienetværket er synligt, men svagt.
      BEMÆRK: Registrer forstærkningen og intensiteten af TMRE og MitoSOX, da disse værdier skal forblive konstante under hele eksperimentet. Fluorescenssignalerne fra YFP og MitoTracker er ikke kvantificeret i denne protokol. Derfor kan forstærkningen og intensiteten justeres for hvert billede. Det er mest effektivt at have forstærknings- og intensitetsindstillingerne, hvor cellerne er lette at se, men stadig svage, for at sikre, at cellerne ikke udsættes for overdreven laserintensitet, der forårsager celleskader eller fotoblegning.
  3. Når forstærknings- og intensitetsindstillingerne er fuldført, skal du klikke på Start for at hente et billede. Hent billeder af 20 celler pr. eksperimentel tilstand (f.eks. fem billeder med fire celler pr. billede; Figur 2D).

5. Kvantificering af fluorescensintensitet ved hjælp af ImageJ

BEMÆRK: Billedfiler gemmes som ".lif" og er kompatible med ImageJ29. Kompatible filtyper med ImageJ er angivet på deres hjemmeside. Det kan være nødvendigt at konvertere filtypen, hvis den er inkompatibel.

  1. Opret og gem et interesseområde (ROI).
    1. I ImageJ skal du klikke på Filer | Ny | Billede. Klik på OK i den dialogboks, der vises.
    2. Klik på knappen Rektangelværktøj, og tegn en boks på 6 mikron x 6 mikron. Åbn ROI-manageren ved at klikke på Analysér | Værktøjer | ROI Manager og vent på, at en dialogboks med ROI-manageren vises (figur 3A). Føj det rektangulære investeringsafkast til lederen ved at klikke på Tilføj i managerdialogboksen. Gem investeringsafkastet ved at vælge Mere og derefter klikke på knappen Gem og OK.
  2. Mål fluorescensintensiteten.
    1. I billede J skal du klikke på Filer og vælge Åbn. Vælg billedfilerne til eksperimentet i dialogboksen, og klik på Åbn.
    2. Vent på, at vinduet Bioformater Import Options vises (figur 3B). Vælg Opdel kanaler, og klik på Åbn.
      BEMÆRK: Funktionen opdelte kanaler gør det muligt at åbne hver kanal i billedet som et separat vindue. Kanalordren svarer til anskaffelsesordren.
      1. TMRE-eksperimenter : YFP (indstilling 1) er den første kanal (c = 0); MitoTracker (indstilling 1) er den anden kanal (c = 1); og TMRE (indstilling 2) er den tredje kanal (c = 2).
      2. MitoSOX-eksperimenter : YFP (indstilling 1) er den første kanal (c = 0); MitoSOX (indstilling 2) er den anden kanal (c = 1); og MitoTracker (indstilling 3) er den tredje kanal (c = 2).
    3. Juster lysstyrken ved at vælge Billede | Juster | Lysstyrke (figur 3C).
      BEMÆRK: Tryk ikke på Set eller Apply for at sikre, at billedets lysstyrke ikke ændres permanent. Nogle gange er fluorescensintensiteten ikke synlig i TMRE- eller MitoSOX-kanalerne. Juster lysstyrken for at muliggøre lettere visualisering. Ændring af lysstyrken påvirker ikke værdierne for rå fluorescensintensitet.
    4. Klik på Analysér , og vælg Indstil mål. Markér felterne Område og Gennemsnitlig grå værdi , og klik på OK (figur 3D).
      BEMÆRK: Den gennemsnitlige grå værdi er fluorescensintensiteten.
    5. Åbn ROI Manager, og indlæs det investeringsafkast, der blev gemt i trin 5.1, ved at klikke på Analysér | Værktøjer | ROI Manager. I ROI Manager skal du klikke på Mere og derefter Åbn på den liste, der vises, og vælge det gemte ROI.
    6. Mål fluorescensintensiteten af fem tilfældige områder i en enkelt celle ved at vælge det gemte investeringsafkast fra ROI-manageren, og flyt ROI til en tilfældig placering i en celle (figur 3E). Mål fluorescensintensiteten ved at trykke på M. Gentag dette trin med yderligere fire ikke-overlappende områder. Når der vises en dialogboks med areal- og middelgrå værdier (figur 3F), skal du kopiere og indsætte værdierne i et regneark til analyse.
      1. TMRE-eksperiment : Vælg billede (c = 2).
      2. MitoSOX-eksperiment : Vælg billede (c = 2).
    7. Der opnås gennemsnitlige værdier for fluorescensintensitet. Brug regnearkssoftware (se materialetabel) til at beregne gennemsnittet af de fem gennemsnitlige grå værdier. Gentag denne proces for hver celle.
    8. Analysere og sammenligne TMRE- eller MitoSOX-middelværdierne på tværs af eksperimentelle forhold ved hjælp af et statistisk softwareprogram (se materialetabel; Figur 4 og figur 5). Præsenter data som søjlediagrammer eller violinplot.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

I denne protokol blev fluorescensbaseret kvantificering anvendt til at måle membranpotentialet og superoxidniveauerne i mitokondrienetværket efter CCCP-behandling (figur 1). Denne arbejdsgang brugte HeLa-celler, en udødeliggjort cellelinje afledt af livmoderhalskræft. HeLa-celler bruges rutinemæssigt til at studere mitokondriebiologi og er relativt flade, hvilket gør det nemt at visualisere mitokondrienetværket ved hjælp af mikroskopi. For at undersøge Parkins rolle i opretholdelsen af mitokondrienetværkets sundhed blev HeLa-celler forbigående transfekteret med en tom kontrolvektor, ParkinWT eller ParkinT240R (en mutant, der forstyrrer mitofagi)21. HeLa-celler blev belagt i 35 mm glasbundede billeddannelsesskåle og blev transfekteret, når ~ 50% -60% sammenløb blev nået (figur 1A). Da HeLa-celler hurtigt deler sig, er dette typisk dagen efter, at cellerne er blevet belagt i billedbehandlingsskålene. Et lysmikroskop blev brugt til at observere YFP-fluorescenssignalet den følgende dag for at vurdere transfektionseffektiviteten. Eksperimenter blev kun udført efter en vellykket transfektion.

Efter inspektion blev HeLa-cellerne behandlet med milde (5 μM) eller svære (20 μM) koncentrationer af CCCP for at depolarisere mitokondrienetværket (trin 1.2 viser detaljerede instruktioner til fremstilling af CCCP og fluorescerende sonder). CCCP-behandlingen blev udført i alt 2 timer. I løbet af de sidste 30 minutter af CCCP-behandlingen blev mitokondrierne mærket med MitoTracker og TMRE/MitoSOX (figur 1A). Det skal bemærkes, at TMRE og MitoSOX har overlappende fluorescensspektre og ikke kan anvendes samtidigt. I stedet brugte vi separate billedbehandlingsretter til TMRE- og MitoSOX-eksperimenterne. Til TMRE-eksperimenter var HeLa-cellerne straks klar til afbildning ved afslutningen af 2 timers CCCP-behandling. TMRE-koncentrationen skal forblive konstant; derfor forblev TMRE i HeLa-medierne. Gratis MitoSOX skal dog fjernes inden billeddannelse. Til MitoSOX-eksperimenterne blev cellerne vasket tre gange med HeLa-medier for at fjerne det frie farvestof. Til dette trin er det vigtigt at bruge HeLa-medier, der indeholder den samme DMSO- eller CCCP-koncentration som de eksperimentelle betingelser. Hoechst 33342, en kernemarkør, blev oprindeligt anvendt til at vurdere HeLa-cellerne efter den forbigående transfektions- og CCCP-behandling (figur 1B).

Derefter blev konfokalmikroskopi udført for at visualisere TMRE og MitoSOX fluorescensintensiteter for at måle henholdsvis mitokondriemembranpotentialet og superoxidniveauerne. Billederne blev taget ved hjælp af et 63x (1,4 NA) olienedsænkningsmål med parametre for tovejsscanning, en rumlig opløsning på 1.024 x 1.024 pixels, en scanningshastighed på 600 Hz, linjegennemsnit på 3, en fase på 22,61 og en zoomfaktor på 1,5 (figur 2C). DMSO-kontrolpladen blev afbildet først for alle eksperimenter for at indstille forstærknings- og intensitetsværdierne for TMRE og MitoSOX. For at foretage kvantitative sammenligninger på tværs af betingelser skal disse værdier indstilles i DMSO-betingelsen og forblive konstante under hele eksperimentet. CCCP inducerer mitokondriel depolarisering og et tab af membranpotentiale, hvilket resulterer i en reduceret TMRE-fluorescensintensitet. Derfor havde kontroleksperimenterne den højeste TMRE-intensitet, og forstærknings- og intensitetsværdierne blev sat tæt på mætning. I modsætning hertil øger højere superoxidniveauer MitoSOX-intensiteten. Derfor havde kontrollen den laveste MitoSOX-fluorescensintensitet, og forstærknings- og intensitetsværdierne blev sat lavt, hvor et svagt signal var til stede. Da MitoTracker, TMRE og MitoSOX er vitale farvestoffer og mærker alle celler, bør de ikke bruges, når du vælger celler, der skal afbildes. I stedet blev cellerne valgt ud fra YFP-signalet for at sikre, at de blev transfekteret. Enkeltplanbilleder blev erhvervet med fokus på bunden af HeLa-cellen, hvor en stor population af mitokondrier var placeret.

Kvantificering af TMRE- og MitoSOX-fluorescensintensitet
Kvantificering af TMRE- og MitoSOX-fluorescensintensiteterne blev analyseret ved hjælp af ImageJ (figur 3). En 6 mikron x 6 mikron ROI blev oprettet og gemt i ROI manager. ROI blev placeret i fem tilfældige ikke-overlappende regioner i hver celle for at måle TMRE- eller MitoSOX-intensiteten. Fluorescensintensiteten svarer til den gennemsnitlige grå værdi i ImageJ. De fem intensitetsværdier blev beregnet som gennemsnit for hver celle for at beregne den gennemsnitlige fluorescensintensitet pr. celle. Disse værdier blev plottet og analyseret for statistisk signifikans på tværs af behandlingsbetingelser.

Resultaterne for TMRE- og MitoSOX-fluorescensintensiteterne er vist i henholdsvis figur 4 og figur 5. Som forventet reducerede behandling med det kendte afkoblingsmiddel CCCP TMRE-fluorescensintensiteten sammenlignet med kontrolbetingelserne (figur 4A,B). Derudover inducerede alvorlig (20 μM) CCCP-behandling superoxidproduktion og øgede MitoSOX-fluorescensintensiteten (figur 5A, B). Under milde (5 μM) CCCP-stressforhold resulterede ekspressionen af ParkinWT og ParkinT240R i højere TMRE-intensitet sammenlignet med den tomme YFP-kontrolvektor. Tilsvarende var MitoSOX-intensiteten lavere i celler, der udtrykte ParkinWT og ParkinT240R sammenlignet med celler, der udtrykte YFP-kontrolvektoren (figur 5A, B). Disse resultater tyder på, at Parkin-ekspression hjælper med at opretholde mitokondrienetværkets sundhed ved at bevare højere mitokondriemembranpotentialer og lave superoxidniveauer. Således kan protokollen skitseret her bruges til nøjagtigt at sammenligne fluorescensintensitet for at analysere Parkins rolle i styringen af mitokondriemembranpotentiale og superoxiddannelse.

Figure 1
Figur 1: Eksperimentel arbejdsgang. (A) Skematisk over den eksperimentelle arbejdsgang, der bruges til at transfektere, behandle med CCCP og mærke mitokondrienetværket og billed TMRE og MitoSOX fluorescensintensitet i HeLa-celler. (B) Repræsentative billeder af celler, der udtrykker en tom YFP-vektor (øverst), YFP-ParkinWT (i midten) og YFP-ParkinT240R (nederst; magenta). Hoechst 33342 (hvid) anvendes til mærkning af DNA'et. Skalabjælke = 10 μm. Forkortelser: CCCP = carbonylcyanid m-chlorphenylhydrazon TMRE = tetramethylrhodamin-ethylester-perchlorat; YFP = gult fluorescerende protein. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: Brugergrænsefladen til opsætning af indstillinger for konfokal anskaffelse . (A) Dialogboksen Laserindstillinger. Det røde rektangel fremhæver laseren med hvidt lys, strømtilstand, lasereffekt og bølgelængder. (B) Eksperimentel kanal oprettet til et MitoSOX-eksperiment. Indstillingerne, excitationslinjerne og emissionsspektrevinduerne vises for YFP, MitoSOX og MitoTracker. (C) Anskaffelsesindstillinger viser format, hastighed, tovejsvirkning, fase X, zoomfaktor og linjegennemsnit. (D) Et repræsentativt erhvervet billede. HeLa-celler udtrykker YFP (magenta), og mitokondrierne er mærket med MitoSOX (grøn) og MitoTracker (cyan). Skalabjælke = 10 μm. Forkortelser: WLL = hvid lys laser; YFP = gult fluorescerende protein. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: ImageJ-arbejdsgang til kvantificering af TMRE- og MitoSOX-fluorescensintensiteter . (A) ROI-managerpanelet med et eksempel på ROI i ImageJ. (B) Panelet med importindstillinger for bioformater. Det røde rektangel fremhæver indstillingen Opdel kanaler , der skal vælges. (C) Parametre for lysstyrke og kontrastindstillinger. (D) Indstil måleparameter. De røde rektangler fremhæver indstillingerne Område og Gennemsnitlig grå værdi , der skal vælges. (E) Repræsentativt billede af en HeLa-celle mærket med MitoSOX. Den røde firkant illustrerer ROI fra panel A. Skalabjælke = 10 μm. (F) Panelet Resultater, der viser forsøgsområdet og de gennemsnitlige grå værdier fra ROI'erne. Den gennemsnitlige grå værdi (orange) repræsenterer fluorescensintensitetsværdierne. Forkortelser: TMRE = tetramethylrhodamin-ethylester-perchlorat; ROI = region af interesse. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 4
Figur 4: TMRE-fluorescensintensitet efter mitokondrieskade. (A) Repræsentative billeder af HeLa-celler efter en 2 timers behandling med DMSO, 5 μM CCCP eller 20 μM CCCP for at fremkalde mitokondrieskade. Celler udtrykker eksogent en tom YFP-vektor, YFP-ParkinWT eller YFP-ParkinT240R (magenta) og mærket med MitoTracker (cyan) og TMRE (grøn). Skalabjælke = 30 μm. (B) Kvantificering af TMRE-fluorescensintensitet for celler, der udtrykker tom YFP-vektor (blå), YFP-ParkinWT (orange) og YFP-ParkinT240R (lilla) under DMSO- og CCCP-behandlede tilstande. p < 0,0001 ved tovejs ANOVA med en multipel sammenligningstest. (C-E) Kvantificeringen af TMRE-fluorescensintensiteterne fra panel B adskilles for at fremhæve forskelle i DMSO (C), 5 μM CCCP (D) og 20 μM CCCP (E). * p < 0,05; p < 0,001; p < 0,0001 af Kruskal-Wallis ANOVA med Dunns multiple sammenligningstest. Ns = ikke signifikant. Gennemsnitlig ± SEM; n= 79-104 fra tre uafhængige biologiske replikater. Forkortelser: CCCP = carbonylcyanid m-chlorphenylhydrazon TMRE = tetramethylrhodamin-ethylester-perchlorat; YFP = gult fluorescerende protein; DMSO = dimethylsulfoxid. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 5
Figur 5: MitoSOX fluorescensintensitet efter beskadigelse af mitokondrienetværket. (A) Repræsentative billeder af HeLa-celler behandlet i 2 timer med DMSO, 5 μM CCCP eller 20 μM CCCP for at afkoble mitokondriemembranpotentialet. Celler blev transfekteret med tom YFP-vektor, YFP-ParkinWT eller YFP-ParkinT240R (magenta) og mærket med MitoTracker (cyan) og MitoSOX (grøn). Skalabjælke = 30 μm. (B) Kvantificering af MitoSOX-fluorescensintensitet for celler, der udtrykker tom YFP-vektor (blå), YFP-ParkinWT (orange) og YFP-ParkinT240R (lilla) til kontrol og behandlede tilstande. p < 0,0001 ved tovejs ANOVA med Dunns multiple sammenligningstest. (C-E) Kvantificeringen af MitoSOX-fluorescensintensiteterne fra panel B adskilles for at fremhæve forskelle i DMSO (C), 5 μM CCCP (D) og 20 μM CCCP (E). *p < 0,05; p < 0,0001 af Kruskal-Wallis ANOVA med Dunns multiple sammenligningstest. Ns = ikke signifikant. Gennemsnitlig ± SEM; n = 87-107 fra tre uafhængige biologiske replikater. Forkortelser: CCCP = carbonylcyanid m-chlorphenylhydrazon TMRE = tetramethylrhodamin-ethylester-perchlorat; YFP = gult fluorescerende protein; DMSO = dimethylsulfoxid. Klik her for at se en større version af denne figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Den arbejdsgang, der er skitseret her, kan bruges til at kvantificere mitokondriemembranpotentiale og superoxidniveauer robust og reproducerbart ved hjælp af fluorescensbaseret billeddannelse30. Der er vigtige tekniske begrænsninger at overveje, når man designer disse eksperimenter. HeLa-celler blev transfekteret med en tom YFP-vektor, YFP-ParkinWT eller YFP-ParkinT240R. Den tomme YFP-vektor blev brugt som kontrol for at bekræfte, at de eksperimentelle fund var specifikke for Parkin. For den forbigående transfektion blev et masseforhold på 1:3 for DNA til transfektionsreagens eksperimentelt bestemt til at give den højeste transfektionshastighed, hvor 2 μg plasmid-DNA blev anvendt til hver konstruktion28. Det var vigtigt at holde YFP-mærket konsistent for alle konstruktioner, da fluorescerende proteiner adskiller sig i medfødt lysstyrke31,32. Hvis der skal anvendes flere fluorescerende proteinmærker, skal fluorescerende proteiner med lignende lysstyrke og fotostabilitet vælges33.

For at måle mitokondriemembranpotentiale og superoxidniveauer blev to veldokumenterede farvestoffer valgt. TMRE's fluorescenssignal er baseret på mitokondriemembranpotentialet, mens MitoSOX-fluorescensintensiteten er en funktion af superoxidniveauer. For fluorescensbaseret billeddannelse bør der ikke være spektral overlapning mellem fluorescerende sonder. Den oprindelige protokol blev imidlertid udført ved hjælp af mCherry-ParkinWT og mCherry-ParkinT240R, som overlappede med de rødforskudte spektre af TMRE og MitoSOX. For at undgå spektral overlapning og minimere potentiel krydstale blev YFP-mærkede Parkin-konstruktioner valgt. Denne justering nødvendiggjorde ændring af MitoTracker-farvestoffet fra grøn til langt rød. Derudover blev HeLa-cellebelægningstætheden optimeret; oprindeligt blev HeLa-celler belagt med 45.000 celler pr. billedbehandlingsskål, men dette resulterede i overflydende retter. Høj cellesammenløb kan reducere transfektionseffektivitet, fremme celledød og ændre cellulær metabolisme34,35,36. For at undgå disse potentielle påvirkninger blev cellerne belagt med en tæthed på 30.000 celler pr. billedbehandlingsskål.

Hovedbegrænsningen i denne protokol er potentialet for brugerbias, specifikt når du vælger celler og ROI-placeringer. Protokollen bruger ændringer i TMRE- og MitoSOX-fluorescensintensiteterne som en funktionel aflæsning for membranpotentiale og superoxidniveauer. Derfor kan celleudvælgelse ved hjælp af disse sonder potentielt skævvride de eksperimentelle resultater. For at bekæmpe denne bias valgte vi celler udelukkende baseret på YFP-ekspression. Ikke-overlappende ROI'er blev tilfældigt udvalgt på tværs af mitokondrienetværket i cellen. Selvom denne metode tidligere blev brugt til at måle fluorescensintensitet27, kunne der træffes yderligere biasreducerende foranstaltninger. For det første kunne undersøgelsen blindes ved hjælp af Blind Analysis Tools i ImageJ for at forhindre ROI-selektion, der understøtter forventede resultater. For det andet kan fluorescensintensiteter måles ved hjælp af avanceret billedanalysesoftware, der eliminerer behovet for ROI'er.

Mens denne protokol bruger konfokal mikroskopi til fluorescensbaseret kvantificering, kan yderligere metoder, såsom flowcytometri, anvendes til at kvantificere fluorescensændringer i TMRE og MitoSOX37. Her brugte vi konfokal mikroskopi snarere end flowcytometri til at visualisere mitokondrienetværkets morfologi. Den skitserede protokol kunne let tilpasses til måling af TMRE og MitoSOX fluorescens med flowcytometri, der giver lignende eksperimentelle resultater. Derudover kan iltforbrugshastighed (OCR) assays anvendes til at detektere ændringer i funktionen af mitokondrieelektrontransportkæden uden kationiske farvestoffer. Mens OCR giver et følsomt mål for mitokondriel dysfunktion, er det ikke specifikt for membranpotentiale eller superoxidkoncentration, men giver i stedet et globalt mål for mitokondriefunktion38. Disse analyser kunne udføres i forbindelse med TMRE- og MitoSOX-eksperimenter for at vurdere mitokondriesundhed39.

Selvom denne protokol specifikt fokuserer på effekten af mitokondrie-afkobleren CCCP40, kan skadelige reagenser med alternative mekanismer anvendes. For eksempel er antimycin A og oligomycin A elektrontransportkædehæmmere, der almindeligvis anvendes til at fremkalde mitokondrieskader via produktion af reaktive iltarter (ROS)38. Mens vi specifikt målte mitokondrie superoxidniveauer ved hjælp af MitoSOX, kunne intracellulær ROS måles ved hjælp af CellROX. I HeLa-celler var det nødvendigt at overudtrykke Parkin på grund af det lave endogene udtryk. Fremtidige undersøgelser kunne observere virkningerne af Parkin-ekspression på mitokondrienetværkets sundhed ved hjælp af cellekultursystemer, der udtrykker endogen Parkin41. Da mitokondrier er kritiske regulatorer af energimetabolisme og cellulær homeostase, er mitokondriel dysfunktion forbundet med adskillige sygdomme, herunder diabetes42, Alzheimers sygdom 43,44,45, kræft 46 og leversygdom 47. Derfor kan denne arbejdsgang tilpasses til at studere mitokondriel sundhed og dysregulering i relevante cellelinjer og primære kulturer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen konkurrerende interesser at erklære.

Acknowledgments

Vi takker medlemmerne af Evans-laboratoriet for deres tankevækkende feedback på dette manuskript. Dette arbejde støttes af Duke Whitehead Scholars, Duke Science and Technology Scholars og Howard Hughes Medical Institute (HHMI) Hanna Gray Fellowship. Figur 1A blev lavet ved hjælp af BioRender.com.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Chemicals, Peptides, and Recombinant Proteins
CCCP (carbonyl cyanide m-chlorophenyl hydrazone)  Sigma-Aldrich C2759
DMEM (1x) with 4.5 g/L glucose Gibco 11-965-084
DMSO, Anhydrous ThermoFisher Scientific D12345
Fetal Bovine Serum Hyclone SH3007103
FuGENE 6 (Tranfection Reagent) Promega E2691
GlutaMAX 100x (L-Glutamine Solution)  Gibco  35-050-061
Hoescht 33342 ThermoFisher Scientific 62249
MitoSOX  Red  ThermoFisher Scientific M36008
MitoTracker Deep Red ThermoFisher Scientific M7514
Opti-MEM (Redued Serum media) ThermoFisher scientific 31985070
Tetramethylrhodamine, Ethyl Ester, Perchlorate (TMRE)  ThermoFisher Scientific T669
Experimental models: Organisms/Strains
HeLa-M (Homo sapiens) A. Peden (Cambridge Institute for Medical Research) N/A
Recombinant DNA
EYFP Empty Vector N/A N/A
YFP-Parkin T240R This Paper Generated by site-directed mutagenesis from YFP-Parkin
YFP-Parkin WT Addgene; PMID:19029340 RRID:Addgene_23955
Software and Algorithms
Adobe Illustrator Adobe Inc. https://www.adobe.com/products/illustrator (Schindelin, 2012)
Excel (Spreadsheet Software) Microsoft Office  https://www.microsoft.com/en-us/microsoft-365/excel
ImageJ https://imagej.net/software/fiji/
Leica Application Suite (LAS X) Leica https://www.leica-microsystems.com/products/microscope-software/p/leica-las-x-ls/
Microsoft Excel Microsoft Office https://www.microsoft.com/excel
Prism9 (Statistical Analysis Software) GraphPad Software https://www.graphpad.com
Other
35 mm Dish, No. 1.5 Coverslip, 20 mm Glass Diameter, Uncoated MatTek P35G-1.5-20-C
Cage Incubator (Environmental Chamber) Okolab https://www.oko-lab.com/cage-incubator
DMiL Inverted Microscope Leica N/A
LIGHTNING Deconvolution Software Leica N/A
STELLARIS 8 confocal microscope Leica N/A

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Spinelli, J. B., Haigis, M. C. The multifaceted contributions of mitochondria to cellular metabolism. Nature Cell Biology. 20 (7), 745-754 (2018).
  2. West, A. P., Shadel, G. S., Ghosh, S. Mitochondria in innate immune responses. Nature Reviews. Immunology. 11 (6), 389-402 (2011).
  3. Seth, R. B., Sun, L., Ea, C. K., Chen, Z. J. Identification and characterization of MAVS, a mitochondrial antiviral signaling protein that activates NF-kappaB and IRF 3. Cell. 122 (5), 669-682 (2005).
  4. Tait, S. W. G., Green, D. R. Mitochondria and cell signalling. Journal of Cell Science. 125, 807-815 (2012).
  5. Antico Arciuch, V. G., Elguero, M. E., Poderoso, J. J., Carreras, M. C. Mitochondrial regulation of cell cycle and proliferation. Antioxidants and Redox Signaling. 16 (10), 1150-1180 (2012).
  6. Grunewald, A., Kumar, K. R., Sue, C. M. New insights into the complex role of mitochondria in Parkinson's disease. Progress in Neurobiology. 177, 73-93 (2019).
  7. Borsche, M., Pereira, S. L., Klein, C., Grunewald, A. Mitochondria and Parkinson's disease: clinical, molecular, and translational aspects. Journal of Parkinson's Disease. 11 (1), 45-60 (2021).
  8. Ou, Z., et al. Global trends in the incidence, prevalence, and years lived with disability of Parkinson's disease in 204 countries/territories from 1990 to 2019. Frontiers in Public Health. 9, 776847 (2021).
  9. Martinez-Vicente, M. Neuronal mitophagy in neurodegenerative diseases. Frontiers in Molecular Neuroscience. 10, 64 (2017).
  10. Youle, R. J., Narendra, D. P. Mechanisms of mitophagy. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 12 (1), 9-14 (2011).
  11. Villa, E., Marchetti, S., Ricci, J. E. No Parkin zone: mitophagy without Parkin. Trends in Cell Biology. 28 (11), 882-895 (2018).
  12. Geisler, S., et al. The PINK1/Parkin-mediated mitophagy is compromised by PD-associated mutations. Autophagy. 6 (7), 871-878 (2010).
  13. Kane, L. A., et al. PINK1 phosphorylates ubiquitin to activate Parkin E3 ubiquitin ligase activity. The Journal of Cell Biology. 205 (2), 143-153 (2014).
  14. Koyano, F., et al. Ubiquitin is phosphorylated by PINK1 to activate parkin. Nature. 510 (7503), 162-166 (2014).
  15. Ordureau, A., et al. Defining roles of PARKIN and ubiquitin phosphorylation by PINK1 in mitochondrial quality control using a ubiquitin replacement strategy. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (21), 6637-6642 (2015).
  16. Ordureau, A., et al. Quantitative proteomics reveal a feedforward mechanism for mitochondrial PARKIN translocation and ubiquitin chain synthesis. Molecular Cell. 56 (3), 360-375 (2014).
  17. Kitada, T., et al. Mutations in the parkin gene cause autosomal recessive juvenile parkinsonism. Nature. 392 (6676), 605-608 (1998).
  18. Valente, E. M., et al. PARK6 is a common cause of familial parkinsonism. Neurological Sciences. 23, S117-S118 (2002).
  19. Matsuda, N., et al. PINK1 stabilized by mitochondrial depolarization recruits Parkin to damaged mitochondria and activates latent Parkin for mitophagy. The Journal of Cell Biology. 189 (2), 211-221 (2010).
  20. Sriram, S. R., et al. Familial-associated mutations differentially disrupt the solubility, localization, binding and ubiquitination properties of parkin. Human Molecular Genetics. 14 (17), 2571-2586 (2005).
  21. Vives-Bauza, C., et al. PINK1-dependent recruitment of Parkin to mitochondria in mitophagy. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (1), 378-383 (2010).
  22. Wong, Y. C., Holzbaur, E. L. F. Optineurin is an autophagy receptor for damaged mitochondria in parkin-mediated mitophagy that is disrupted by an ALS-linked mutation. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (42), E4439-E4448 (2014).
  23. Bertolin, G., et al. Parkin maintains mitochondrial levels of the protective Parkinson's disease-related enzyme 17-beta hydroxysteroid dehydrogenase type 10. Cell Death and Differentiation. 22 (10), 1563-1576 (2015).
  24. Crowley, L. C., Christensen, M. E., Waterhouse, N. J. Measuring mitochondrial transmembrane potential by TMRE staining. Cold Spring Harbor Protocols. 2016 (12), (2016).
  25. Kuznetsov, A. V., et al. Mitochondrial ROS production under cellular stress: comparison of different detection methods. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 400 (8), 2383-2390 (2011).
  26. Moore, A. S., Holzbaur, E. L. F. Dynamic recruitment and activation of ALS-associated TBK1 with its target optineurin are required for efficient mitophagy. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (24), E3349-E3358 (2016).
  27. Evans, C. S., Holzbaur, E. L. F. Degradation of engulfed mitochondria is rate-limiting in Optineurin-mediated mitophagy in neurons. eLife. 9, e50260 (2020).
  28. Jacobsen, L. B., Calvin, S. A., Colvin, K. E., Wright, M. FuGENE 6 Transfection Reagent: the gentle power. Methods. 33 (2), 104-112 (2004).
  29. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  30. Mitra, K., Lippincott-Schwartz, J. Analysis of mitochondrial dynamics and functions using imaging approaches. Current Protocols in Cell Biology. , Chapter 4, Unit 4.25 1-21 (2010).
  31. Lin, H. C., Liu, S. Y., Lai, H. S., Lai, I. R. Isolated mitochondria infusion mitigates ischemia-reperfusion injury of the liver in rats. Shock. 39 (3), 304-310 (2013).
  32. Kholmukhamedov, A., Schwartz, J. M., Lemasters, J. J. Isolated mitochondria infusion mitigates ischemia-reperfusion injury of the liver in rats: mitotracker probes and mitochondrial membrane potential. Shock. 39 (6), 543 (2013).
  33. Thorn, K. Genetically encoded fluorescent tags. Molecular Biology of the Cell. 28 (7), 848-857 (2017).
  34. Pavel, M., et al. Contact inhibition controls cell survival and proliferation via YAP/TAZ-autophagy axis. Nature Communications. 9 (1), 2961 (2018).
  35. Rossignol, R., et al. Energy substrate modulates mitochondrial structure and oxidative capacity in cancer cells. Cancer Research. 64 (3), 985-993 (2004).
  36. Schornack, P. A., Gillies, R. J. Contributions of cell metabolism and H+ diffusion to the acidic pH of tumors. Neoplasia. 5 (2), 135-145 (2003).
  37. Christensen, M. E., Jansen, E. S., Sanchez, W., Waterhouse, N. J. Flow cytometry based assays for the measurement of apoptosis-associated mitochondrial membrane depolarisation and cytochrome c release. Methods. 61 (2), 138-145 (2013).
  38. Muller, B., et al. Application of extracellular flux analysis for determining mitochondrial function in mammalian oocytes and early embryos. Scientific Reports. 9 (1), 16778 (2019).
  39. Connolly, N. M. C., et al. Guidelines on experimental methods to assess mitochondrial dysfunction in cellular models of neurodegenerative diseases. Cell Death and Differentiation. 25 (3), 542-572 (2018).
  40. Demine, S., Renard, P., Arnould, T. Mitochondrial uncoupling: a key controller of biological processes in physiology and diseases. Cells. 8 (8), 795 (2019).
  41. Narendra, D., Tanaka, A., Suen, D. F., Youle, R. J. Parkin is recruited selectively to impaired mitochondria and promotes their autophagy. The Journal of Cell Biology. 183 (5), 795-803 (2008).
  42. Kwak, S. H., Park, K. S., Lee, K. U., Lee, H. K. Mitochondrial metabolism and diabetes. Journal of Diabetes Investigation. 1 (5), 161-169 (2010).
  43. Reddy, P. H. Role of mitochondria in neurodegenerative diseases: mitochondria as a therapeutic target in Alzheimer's disease. CNS Spectrums. 14 (8), 8-13 (2009).
  44. Wang, W., Zhao, F., Ma, X., Perry, G., Zhu, X. Mitochondria dysfunction in the pathogenesis of Alzheimer's disease: recent advances. Molecular Neurodegeneration. 15 (1), 30 (2020).
  45. Baloyannis, S. J. Mitochondrial alterations in Alzheimer's disease. Journal of Alzheimer's Disease. 9 (2), 119-126 (2006).
  46. Wallace, D. C. Mitochondria and cancer. Nature Reviews. Cancer. 12 (10), 685-698 (2012).
  47. Middleton, P., Vergis, N. Mitochondrial dysfunction and liver disease: role, relevance, and potential for therapeutic modulation. Therapeutic Advances in Gastroenterology. 14, 17562848211031394 (2021).

Tags

Biologi udgave 195 mitokondrier mitofagi neurodegeneration Parkin mitokondriemembranpotentiale reaktive iltarter superoxid HeLa-celler konfokalmikroskopi
Fluorescensbaseret kvantificering af mitokondriemembranpotentiale og superoxidniveauer ved hjælp af levende billeddannelse i HeLa-celler
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Fazli, M., Evans, C. S.… More

Fazli, M., Evans, C. S. Fluorescence-Based Quantification of Mitochondrial Membrane Potential and Superoxide Levels Using Live Imaging in HeLa Cells. J. Vis. Exp. (195), e65304, doi:10.3791/65304 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter