Denne teknik beskriver en effektiv arbejdsgang til at visualisere og kvantitativt måle mitokondriemembranpotentiale og superoxidniveauer i HeLa-celler ved hjælp af fluorescensbaseret levende billeddannelse.
Mitokondrier er dynamiske organeller, der er kritiske for metabolisk homeostase ved at kontrollere energiproduktionen via ATP-syntese. For at understøtte cellulær metabolisme samarbejder forskellige mitokondrie kvalitetskontrolmekanismer for at opretholde et sundt mitokondrienetværk. En sådan vej er mitofagi, hvor PTEN-induceret kinase 1 (PINK1) og Parkin phospho-ubiquitination af beskadigede mitokondrier letter autofagosomsekvestrering og efterfølgende fjernelse fra cellen via lysosomfusion. Mitofagi er vigtig for cellulær homeostase, og mutationer i Parkin er forbundet med Parkinsons sygdom (PD). På grund af disse resultater har der været en betydelig vægt på at undersøge mitokondrieskader og omsætning for at forstå de molekylære mekanismer og dynamikker i mitokondriel kvalitetskontrol. Her blev levende cellebilleddannelse brugt til at visualisere mitokondrienetværket af HeLa-celler til at kvantificere mitokondriemembranpotentialet og superoxidniveauerne efter behandling med carbonylcyanid m-chlorphenylhydrazon (CCCP), et mitokondrielt afkoblingsmiddel. Derudover blev en PD-bundet mutation af Parkin (ParkinT240R), der hæmmer Parkin-afhængig mitofagi, udtrykt for at bestemme, hvordan mutant ekspression påvirker mitokondrienetværket sammenlignet med celler, der udtrykker vildtype Parkin. Protokollen skitseret her beskriver en simpel arbejdsgang ved hjælp af fluorescensbaserede tilgange til effektivt at kvantificere mitokondriemembranpotentiale og superoxidniveauer.
Mitokondrienetværket er en række indbyrdes forbundne organeller, der spiller en afgørende rolle i energiproduktion1, medfødt immunitet2,3 og cellesignalering 4,5. Mitokondriel dysregulering har været forbundet med neurodegenerative sygdomme såsom Parkinsons sygdom (PD)6,7. PD er en progressiv neurodegenerativ lidelse, der påvirker dopaminerge neuroner i substantia nigra, der påvirker næsten 10 millioner mennesker verden over8. PD har været genetisk forbundet med mitofagi, en mitokondriel kvalitetskontrolvej, der er nødvendig for at opretholde cellulær homeostase, der selektivt fjerner beskadigede mitokondrier 9,10. Undersøgelser har identificeret flere uafhængige mitofagiveje, herunder FUN14-domæne indeholdende 1 (FUNDC1)-medieret mitofagi, Bcl-2-interagerende protein 3 (BNIP3)-faciliteret mitofagi, NIX-afhængig mitofagi, og den velkarakteriserede PTEN-inducerede kinase 1 (PINK1)/Parkin-regulerede mitofagi:10,11. PINK1 (en formodet kinase) og Parkin (en E3 ubiquitin ligase) arbejder sammen for at phospho-ubiquitinere beskadigede mitokondrier, som driver dannelsen af autofagosomer, der opsluger den beskadigede organel og smelter sammen med lysosomer for at indlede nedbrydning 12,13,14,15,16. Mutationer i Parkin har været forbundet med PD-bundne fænotyper såsom neurodegeneration via tab af dopaminerge neuroner17,18.
Her beskrives en protokol, hvor HeLa-celler, rutinemæssigt anvendte udødeliggjorte celler afledt af livmoderhalskræft, bruges til at undersøge Parkins rolle i at opretholde mitokondrienetværkets sundhed. HeLa-celler udtrykker ubetydelige niveauer af endogen Parkin og kræver derfor eksogen Parkin-ekspression19. For at studere Parkins rolle i mitokondrienetværkets sundhed transfekteres HeLa-celler med enten vildtype Parkin (ParkinWT), en Parkin-mutant (ParkinT240R) eller en tom kontrolvektor. ParkinT240R er en autosomal recessiv juvenil parkinsonismemutation, der påvirker Parkin E3-ligaseaktivitet, hvilket signifikant reducerer effektiviteten af mitofagivejen20. HeLa-celler udsættes for milde (5 μM) eller svære (20 μM) koncentrationer af carbonylcyanid m-chlorphenylhydrazon (CCCP), et mitokondrielt afkoblingsmiddel. Behandling med alvorlige koncentrationer af CCCP anvendes rutinemæssigt til at inducere Parkin-medieret mitofagi, i forskellige cellelinjer, såsom HeLa- og COS-7-celler21,22,23.
Efter behandling anvender protokollen levende billeddannelse af mitokondrienetværket ved hjælp af to aktuelt tilgængelige mitokondriemålrettede fluorescerende farvestoffer. Tetramethylrhodamin, ethylester, perchlorat (TMRE) er et kationisk farvestof, der fluorescerer baseret på mitokondriemembranpotentiale24, mens MitoSOX er en mitokondriel superoxidindikator, hvor fluorescensintensiteten er en funktion af superoxidkoncentrationen25. Endelig bruger den skitserede protokol en fluorescensbaseret kvantificering og enkel arbejdsgang til effektivt at kvantificere mitokondriemembranpotentialet og superoxidniveauerne med minimal plads til brugerbias. Selvom denne protokol blev designet til at studere mitokondriefunktion i HeLa-celler, kan den tilpasses til yderligere cellelinjer og primære celletyper for kvantitativt at karakterisere mitokondrienetværkets sundhed.
Den arbejdsgang, der er skitseret her, kan bruges til at kvantificere mitokondriemembranpotentiale og superoxidniveauer robust og reproducerbart ved hjælp af fluorescensbaseret billeddannelse30. Der er vigtige tekniske begrænsninger at overveje, når man designer disse eksperimenter. HeLa-celler blev transfekteret med en tom YFP-vektor, YFP-ParkinWT eller YFP-ParkinT240R. Den tomme YFP-vektor blev brugt som kontrol for at bekræfte, at de eksperimentelle fund var specifikke…
The authors have nothing to disclose.
Vi takker medlemmerne af Evans-laboratoriet for deres tankevækkende feedback på dette manuskript. Dette arbejde støttes af Duke Whitehead Scholars, Duke Science and Technology Scholars og Howard Hughes Medical Institute (HHMI) Hanna Gray Fellowship. Figur 1A blev lavet ved hjælp af BioRender.com.
Chemicals, Peptides, and Recombinant Proteins | |||
CCCP (carbonyl cyanide m-chlorophenyl hydrazone) | Sigma-Aldrich | C2759 | |
DMEM (1x) with 4.5 g/L glucose | Gibco | 11-965-084 | |
DMSO, Anhydrous | ThermoFisher Scientific | D12345 | |
Fetal Bovine Serum | Hyclone | SH3007103 | |
FuGENE 6 (Tranfection Reagent) | Promega | E2691 | |
GlutaMAX 100x (L-Glutamine Solution) | Gibco | 35-050-061 | |
Hoescht 33342 | ThermoFisher Scientific | 62249 | |
MitoSOX Red | ThermoFisher Scientific | M36008 | |
MitoTracker Deep Red | ThermoFisher Scientific | M7514 | |
Opti-MEM (Redued Serum media) | ThermoFisher scientific | 31985070 | |
Tetramethylrhodamine, Ethyl Ester, Perchlorate (TMRE) | ThermoFisher Scientific | T669 | |
Experimental models: Organisms/Strains | |||
HeLa-M (Homo sapiens) | A. Peden (Cambridge Institute for Medical Research) | N/A | |
Recombinant DNA | |||
EYFP Empty Vector | N/A | N/A | |
YFP-Parkin T240R | This Paper | Generated by site-directed mutagenesis from YFP-Parkin | |
YFP-Parkin WT | Addgene; PMID:19029340 | RRID:Addgene_23955 | |
Software and Algorithms | |||
Adobe Illustrator | Adobe Inc. | https://www.adobe.com/products/illustrator | (Schindelin, 2012) |
Excel (Spreadsheet Software) | Microsoft Office | https://www.microsoft.com/en-us/microsoft-365/excel | |
ImageJ | https://imagej.net/software/fiji/ | ||
Leica Application Suite (LAS X) | Leica | https://www.leica-microsystems.com/products/microscope-software/p/leica-las-x-ls/ | |
Microsoft Excel | Microsoft Office | https://www.microsoft.com/excel | |
Prism9 (Statistical Analysis Software) | GraphPad Software | https://www.graphpad.com | |
Other | |||
35 mm Dish, No. 1.5 Coverslip, 20 mm Glass Diameter, Uncoated | MatTek | P35G-1.5-20-C | |
Cage Incubator (Environmental Chamber) | Okolab | https://www.oko-lab.com/cage-incubator | |
DMiL Inverted Microscope | Leica | N/A | |
LIGHTNING Deconvolution Software | Leica | N/A | |
STELLARIS 8 confocal microscope | Leica | N/A |