JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biology

Fluorescensbaserad kvantifiering av mitokondriell membranpotential och superoxidnivåer med hjälp av levande avbildning i HeLa-celler

Published: May 12, 2023
doi:
10.3791/65304
,
1Department of Cell Biology,Duke University Medical Center

Summary

Denna teknik beskriver ett effektivt arbetsflöde för att visualisera och kvantitativt mäta mitokondriell membranpotential och superoxidnivåer i HeLa-celler med hjälp av fluorescensbaserad levande avbildning.

Abstract

Mitokondrier är dynamiska organeller som är kritiska för metabolisk homeostas genom att kontrollera energiproduktionen via ATP-syntes. För att stödja cellulär metabolism samarbetar olika mitokondriella kvalitetskontrollmekanismer för att upprätthålla ett hälsosamt mitokondriellt nätverk. En sådan väg är mitofagi, där PTEN-inducerat kinas 1 (PINK1) och Parkin-fosfo-ubiquitinering av skadade mitokondrier underlättar autofagosombindning och efterföljande avlägsnande från cellen via lysosomfusion. Mitophagy är viktigt för cellulär homeostas, och mutationer i Parkin är kopplade till Parkinsons sjukdom (PD). På grund av dessa fynd har det lagts stor vikt vid att undersöka mitokondriella skador och omsättning för att förstå de molekylära mekanismerna och dynamiken i mitokondriell kvalitetskontroll. Här användes levande cellavbildning för att visualisera det mitokondriella nätverket av HeLa-celler, för att kvantifiera mitokondriell membranpotential och superoxidnivåer efter behandling med karbonylcyanid m-klorfenylhydrazon (CCCP), ett mitokondriellt frikopplingsmedel. Dessutom uttrycktes en PD-länkad mutation av Parkin (ParkinT240R) som hämmar Parkin-beroende mitofagi för att bestämma hur mutantuttryck påverkar mitokondriellt nätverk jämfört med celler som uttrycker Parkin av vildtyp. Protokollet som beskrivs här beskriver ett enkelt arbetsflöde med fluorescensbaserade metoder för att kvantifiera mitokondriell membranpotential och superoxidnivåer effektivt.

Introduction

Mitokondriellt nätverk är en serie sammankopplade organeller som spelar en avgörande roll i energiproduktion1, medfödd immunitet2,3 och cellsignalering 4,5. Mitokondriell dysreglering har associerats med neurodegenerativa sjukdomar som Parkinsons sjukdom (PD)6,7. PD är en progressiv neurodegenerativ sjukdom som påverkar dopaminerga neuroner i substantia nigra som påverkar nästan 10 miljoner människor världen över8. PD har varit genetiskt kopplad till mitofagi, en mitokondriell kvalitetskontrollväg som är nödvändig för att upprätthålla cellulär homeostas som selektivt tar bort skadade mitokondrier 9,10. Studier har identifierat flera oberoende mitofagivägar, inklusive FUN14-domän innehållande 1 (FUNDC1)-medierad mitofagi, Bcl-2-interagerande protein 3 (BNIP3)-underlättad mitofagi, NIX-beroende mitofagi och det välkarakteriserade PTEN-inducerade kinas 1 (PINK1)/Parkin-reglerade mitofagi10,11. PINK1 (ett förmodat kinas) och Parkin (ett E3 ubiquitinligas) arbetar tillsammans för att fosfo-ubiquitinatskadade mitokondrier, vilket driver bildandet av autofagosomer som uppslukar den skadade organellen och smälter samman med lysosomer för att initiera nedbrytning 12,13,14,15,16. Mutationer i Parkin har associerats med PD-länkade fenotyper såsom neurodegeneration via förlust av dopaminerga neuroner17,18.

Här beskrivs ett protokoll där HeLa-celler, rutinmässigt använda odödliga celler härrörande från livmoderhalscancer, används för att undersöka Parkins roll för att upprätthålla mitokondriell nätverkshälsa. HeLa-celler uttrycker försumbara nivåer av endogent Parkin och kräver därför exogent Parkin-uttryck19. För att studera Parkins roll i mitokondriell nätverkshälsa transfekteras HeLa-celler med antingen vildtyp Parkin (ParkinWT), en Parkin-mutant (ParkinT240R) eller en tom kontrollvektor. ParkinT240R är en autosomalt recessiv juvenil parkinsonismmutation som påverkar Parkin E3-ligasaktiviteten, vilket avsevärt minskar effektiviteten hos mitofagivägen20. HeLa-celler utsätts för milda (5 μM) eller svåra (20 μM) koncentrationer av karbonylcyanid m-klorfenylhydrazon (CCCP), ett mitokondriellt frikopplingsmedel. Behandling med svåra koncentrationer av CCCP används rutinmässigt för att inducera parkinmedierad mitofagi i olika cellinjer, såsom HeLa- och COS-7-celler21,22,23.

Efter behandling använder protokollet levande avbildning av mitokondriellt nätverk med hjälp av två för närvarande tillgängliga mitokondriella riktade fluorescerande färgämnen. Tetrametylrodamin, etylester, perklorat (TMRE) är ett katjoniskt färgämne som fluorescerar baserat på mitokondriell membranpotential24, medan MitoSOX är en mitokondriell superoxidindikator där fluorescensintensiteten är en funktion av superoxidkoncentrationen25. Slutligen använder det skisserade protokollet en fluorescensbaserad kvantifiering och ett enkelt arbetsflöde för att effektivt kvantifiera mitokondriell membranpotential och superoxidnivåer med minimalt utrymme för användarbias. Även om detta protokoll utformades för att studera mitokondriell funktion i HeLa-celler, kan det anpassas för ytterligare cellinjer och primära celltyper för att kvantitativt karakterisera mitokondriell nätverkshälsa.

Protocol

1. Beredning av biologiska prover OBS: Utför följande steg med steril teknik i ett biosäkerhetsskåp. Spraya ytan på skåpet och allt material med 70% etanol. HeLa-cellodling och transfektionOdla 30 000 HeLa-celler i Dulbeccos modifierade örnmedium (DMEM) innehållande 4,5 g/L glukos kompletterat med 10 % fetalt bovint serum och 1 % L-glutaminlösning (HeLa-media; se materialförteckning). Platta cellerna på 35 mm bildplattor med glasbo…

Representative Results

I detta protokoll användes fluorescensbaserad kvantifiering för att mäta membranpotentialen och superoxidnivåerna i mitokondriella nätverket efter CCCP-behandling (figur 1). Detta arbetsflöde använde HeLa-celler, en odödliggjord cellinje härledd från livmoderhalscancer. HeLa-celler används rutinmässigt för att studera mitokondriell biologi och är relativt platta, vilket gör det enkelt att visualisera mitokondriella nätverket med hjälp av mikroskopi. För att undersöka Parki…

Discussion

Arbetsflödet som beskrivs här kan användas för att kvantifiera mitokondriell membranpotential och superoxidnivåer robust och reproducerbart med hjälp av fluorescensbaserad avbildning30. Det finns viktiga tekniska begränsningar att tänka på när du utformar dessa experiment. HeLa-celler transfekterades med en tom YFP-vektor, YFP-ParkinWT eller YFP-ParkinT240R. Den tomma YFP-vektorn användes som en kontroll för att bekräfta att experimentella fynd var specifika för…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Vi tackar medlemmarna i Evans labb för deras tankeväckande feedback på detta manuskript. Detta arbete stöds av Duke Whitehead Scholars, Duke Science and Technology Scholars och Howard Hughes Medical Institute (HHMI) Hanna Gray Fellowship. Figur 1A gjordes med hjälp av BioRender.com.

Materials

Chemicals, Peptides, and Recombinant Proteins
CCCP (carbonyl cyanide m-chlorophenyl hydrazone)  Sigma-Aldrich C2759
DMEM (1x) with 4.5 g/L glucose Gibco 11-965-084
DMSO, Anhydrous ThermoFisher Scientific D12345
Fetal Bovine Serum Hyclone SH3007103
FuGENE 6 (Tranfection Reagent) Promega E2691
GlutaMAX 100x (L-Glutamine Solution)  Gibco  35-050-061
Hoescht 33342 ThermoFisher Scientific 62249
MitoSOX  Red  ThermoFisher Scientific M36008
MitoTracker Deep Red ThermoFisher Scientific M7514
Opti-MEM (Redued Serum media) ThermoFisher scientific 31985070
Tetramethylrhodamine, Ethyl Ester, Perchlorate (TMRE)  ThermoFisher Scientific T669
Experimental models: Organisms/Strains
HeLa-M (Homo sapiens) A. Peden (Cambridge Institute for Medical Research) N/A
Recombinant DNA
EYFP Empty Vector N/A N/A
YFP-Parkin T240R This Paper Generated by site-directed mutagenesis from YFP-Parkin
YFP-Parkin WT Addgene; PMID:19029340 RRID:Addgene_23955
Software and Algorithms
Adobe Illustrator Adobe Inc. https://www.adobe.com/products/illustrator (Schindelin, 2012)
Excel (Spreadsheet Software) Microsoft Office  https://www.microsoft.com/en-us/microsoft-365/excel
ImageJ https://imagej.net/software/fiji/
Leica Application Suite (LAS X) Leica https://www.leica-microsystems.com/products/microscope-software/p/leica-las-x-ls/
Microsoft Excel Microsoft Office https://www.microsoft.com/excel
Prism9 (Statistical Analysis Software) GraphPad Software https://www.graphpad.com
Other
35 mm Dish, No. 1.5 Coverslip, 20 mm Glass Diameter, Uncoated MatTek P35G-1.5-20-C
Cage Incubator (Environmental Chamber) Okolab https://www.oko-lab.com/cage-incubator
DMiL Inverted Microscope Leica N/A
LIGHTNING Deconvolution Software Leica N/A
STELLARIS 8 confocal microscope Leica N/A
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Spinelli, J. B., Haigis, M. C. The multifaceted contributions of mitochondria to cellular metabolism. Nature Cell Biology. 20 (7), 745-754 (2018).
  2. West, A. P., Shadel, G. S., Ghosh, S. Mitochondria in innate immune responses. Nature Reviews. Immunology. 11 (6), 389-402 (2011).
  3. Seth, R. B., Sun, L., Ea, C. K., Chen, Z. J. Identification and characterization of MAVS, a mitochondrial antiviral signaling protein that activates NF-kappaB and IRF 3. Cell. 122 (5), 669-682 (2005).
  4. Tait, S. W. G., Green, D. R. Mitochondria and cell signalling. Journal of Cell Science. 125, 807-815 (2012).
  5. Antico Arciuch, V. G., Elguero, M. E., Poderoso, J. J., Carreras, M. C. Mitochondrial regulation of cell cycle and proliferation. Antioxidants and Redox Signaling. 16 (10), 1150-1180 (2012).
  6. Grunewald, A., Kumar, K. R., Sue, C. M. New insights into the complex role of mitochondria in Parkinson’s disease. Progress in Neurobiology. 177, 73-93 (2019).
  7. Borsche, M., Pereira, S. L., Klein, C., Grunewald, A. Mitochondria and Parkinson’s disease: clinical, molecular, and translational aspects. Journal of Parkinson’s Disease. 11 (1), 45-60 (2021).
  8. Ou, Z., et al. Global trends in the incidence, prevalence, and years lived with disability of Parkinson’s disease in 204 countries/territories from 1990 to 2019. Frontiers in Public Health. 9, 776847 (2021).
  9. Martinez-Vicente, M. Neuronal mitophagy in neurodegenerative diseases. Frontiers in Molecular Neuroscience. 10, 64 (2017).
  10. Youle, R. J., Narendra, D. P. Mechanisms of mitophagy. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 12 (1), 9-14 (2011).
  11. Villa, E., Marchetti, S., Ricci, J. E. No Parkin zone: mitophagy without Parkin. Trends in Cell Biology. 28 (11), 882-895 (2018).
  12. Geisler, S., et al. The PINK1/Parkin-mediated mitophagy is compromised by PD-associated mutations. Autophagy. 6 (7), 871-878 (2010).
  13. Kane, L. A., et al. PINK1 phosphorylates ubiquitin to activate Parkin E3 ubiquitin ligase activity. The Journal of Cell Biology. 205 (2), 143-153 (2014).
  14. Koyano, F., et al. Ubiquitin is phosphorylated by PINK1 to activate parkin. Nature. 510 (7503), 162-166 (2014).
  15. Ordureau, A., et al. Defining roles of PARKIN and ubiquitin phosphorylation by PINK1 in mitochondrial quality control using a ubiquitin replacement strategy. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (21), 6637-6642 (2015).
  16. Ordureau, A., et al. Quantitative proteomics reveal a feedforward mechanism for mitochondrial PARKIN translocation and ubiquitin chain synthesis. Molecular Cell. 56 (3), 360-375 (2014).
  17. Kitada, T., et al. Mutations in the parkin gene cause autosomal recessive juvenile parkinsonism. Nature. 392 (6676), 605-608 (1998).
  18. Valente, E. M., et al. PARK6 is a common cause of familial parkinsonism. Neurological Sciences. 23, S117-S118 (2002).
  19. Matsuda, N., et al. PINK1 stabilized by mitochondrial depolarization recruits Parkin to damaged mitochondria and activates latent Parkin for mitophagy. The Journal of Cell Biology. 189 (2), 211-221 (2010).
  20. Sriram, S. R., et al. Familial-associated mutations differentially disrupt the solubility, localization, binding and ubiquitination properties of parkin. Human Molecular Genetics. 14 (17), 2571-2586 (2005).
  21. Vives-Bauza, C., et al. PINK1-dependent recruitment of Parkin to mitochondria in mitophagy. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (1), 378-383 (2010).
  22. Wong, Y. C., Holzbaur, E. L. F. Optineurin is an autophagy receptor for damaged mitochondria in parkin-mediated mitophagy that is disrupted by an ALS-linked mutation. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (42), E4439-E4448 (2014).
  23. Bertolin, G., et al. Parkin maintains mitochondrial levels of the protective Parkinson’s disease-related enzyme 17-beta hydroxysteroid dehydrogenase type 10. Cell Death and Differentiation. 22 (10), 1563-1576 (2015).
  24. Crowley, L. C., Christensen, M. E., Waterhouse, N. J. Measuring mitochondrial transmembrane potential by TMRE staining. Cold Spring Harbor Protocols. 2016 (12), (2016).
  25. Kuznetsov, A. V., et al. Mitochondrial ROS production under cellular stress: comparison of different detection methods. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 400 (8), 2383-2390 (2011).
  26. Moore, A. S., Holzbaur, E. L. F. Dynamic recruitment and activation of ALS-associated TBK1 with its target optineurin are required for efficient mitophagy. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (24), E3349-E3358 (2016).
  27. Evans, C. S., Holzbaur, E. L. F. Degradation of engulfed mitochondria is rate-limiting in Optineurin-mediated mitophagy in neurons. eLife. 9, e50260 (2020).
  28. Jacobsen, L. B., Calvin, S. A., Colvin, K. E., Wright, M. FuGENE 6 Transfection Reagent: the gentle power. Methods. 33 (2), 104-112 (2004).
  29. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  30. Mitra, K., Lippincott-Schwartz, J. Analysis of mitochondrial dynamics and functions using imaging approaches. Current Protocols in Cell Biology. , 1-21 (2010).
  31. Lin, H. C., Liu, S. Y., Lai, H. S., Lai, I. R. Isolated mitochondria infusion mitigates ischemia-reperfusion injury of the liver in rats. Shock. 39 (3), 304-310 (2013).
  32. Kholmukhamedov, A., Schwartz, J. M., Lemasters, J. J. Isolated mitochondria infusion mitigates ischemia-reperfusion injury of the liver in rats: mitotracker probes and mitochondrial membrane potential. Shock. 39 (6), 543 (2013).
  33. Thorn, K. Genetically encoded fluorescent tags. Molecular Biology of the Cell. 28 (7), 848-857 (2017).
  34. Pavel, M., et al. Contact inhibition controls cell survival and proliferation via YAP/TAZ-autophagy axis. Nature Communications. 9 (1), 2961 (2018).
  35. Rossignol, R., et al. Energy substrate modulates mitochondrial structure and oxidative capacity in cancer cells. Cancer Research. 64 (3), 985-993 (2004).
  36. Schornack, P. A., Gillies, R. J. Contributions of cell metabolism and H+ diffusion to the acidic pH of tumors. Neoplasia. 5 (2), 135-145 (2003).
  37. Christensen, M. E., Jansen, E. S., Sanchez, W., Waterhouse, N. J. Flow cytometry based assays for the measurement of apoptosis-associated mitochondrial membrane depolarisation and cytochrome c release. Methods. 61 (2), 138-145 (2013).
  38. Muller, B., et al. Application of extracellular flux analysis for determining mitochondrial function in mammalian oocytes and early embryos. Scientific Reports. 9 (1), 16778 (2019).
  39. Connolly, N. M. C., et al. Guidelines on experimental methods to assess mitochondrial dysfunction in cellular models of neurodegenerative diseases. Cell Death and Differentiation. 25 (3), 542-572 (2018).
  40. Demine, S., Renard, P., Arnould, T. Mitochondrial uncoupling: a key controller of biological processes in physiology and diseases. Cells. 8 (8), 795 (2019).
  41. Narendra, D., Tanaka, A., Suen, D. F., Youle, R. J. Parkin is recruited selectively to impaired mitochondria and promotes their autophagy. The Journal of Cell Biology. 183 (5), 795-803 (2008).
  42. Kwak, S. H., Park, K. S., Lee, K. U., Lee, H. K. Mitochondrial metabolism and diabetes. Journal of Diabetes Investigation. 1 (5), 161-169 (2010).
  43. Reddy, P. H. Role of mitochondria in neurodegenerative diseases: mitochondria as a therapeutic target in Alzheimer’s disease. CNS Spectrums. 14 (8), 8-13 (2009).
  44. Wang, W., Zhao, F., Ma, X., Perry, G., Zhu, X. Mitochondria dysfunction in the pathogenesis of Alzheimer’s disease: recent advances. Molecular Neurodegeneration. 15 (1), 30 (2020).
  45. Baloyannis, S. J. Mitochondrial alterations in Alzheimer’s disease. Journal of Alzheimer’s Disease. 9 (2), 119-126 (2006).
  46. Wallace, D. C. Mitochondria and cancer. Nature Reviews. Cancer. 12 (10), 685-698 (2012).
  47. Middleton, P., Vergis, N. Mitochondrial dysfunction and liver disease: role, relevance, and potential for therapeutic modulation. Therapeutic Advances in Gastroenterology. 14, 17562848211031394 (2021).

Tags

Keywords: Mitochondrial Membrane PotentialSuperoxide LevelsLive ImagingHeLa CellsNeurodegenerative DiseasesParkinson’s DiseaseALSSTEDSIMExpansion MicroscopyMitophagyPINK1ParkinMitochondrial Quality ControlATP SynthesisCCCPParkin T240R Mutation
check_url/65304?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Fazli, M., Evans, C. S. Fluorescence-Based Quantification of Mitochondrial Membrane Potential and Superoxide Levels Using Live Imaging in HeLa Cells. J. Vis. Exp. (195), e65304, doi:10.3791/65304 (2023).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image