Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Fluorescensbaserad kvantifiering av mitokondriell membranpotential och superoxidnivåer med hjälp av levande avbildning i HeLa-celler

Published: May 12, 2023 doi: 10.3791/65304
Automatic Translation
1, 1
1Department of Cell Biology, Duke University Medical Center

Summary

Denna teknik beskriver ett effektivt arbetsflöde för att visualisera och kvantitativt mäta mitokondriell membranpotential och superoxidnivåer i HeLa-celler med hjälp av fluorescensbaserad levande avbildning.

Abstract

Mitokondrier är dynamiska organeller som är kritiska för metabolisk homeostas genom att kontrollera energiproduktionen via ATP-syntes. För att stödja cellulär metabolism samarbetar olika mitokondriella kvalitetskontrollmekanismer för att upprätthålla ett hälsosamt mitokondriellt nätverk. En sådan väg är mitofagi, där PTEN-inducerat kinas 1 (PINK1) och Parkin-fosfo-ubiquitinering av skadade mitokondrier underlättar autofagosombindning och efterföljande avlägsnande från cellen via lysosomfusion. Mitophagy är viktigt för cellulär homeostas, och mutationer i Parkin är kopplade till Parkinsons sjukdom (PD). På grund av dessa fynd har det lagts stor vikt vid att undersöka mitokondriella skador och omsättning för att förstå de molekylära mekanismerna och dynamiken i mitokondriell kvalitetskontroll. Här användes levande cellavbildning för att visualisera det mitokondriella nätverket av HeLa-celler, för att kvantifiera mitokondriell membranpotential och superoxidnivåer efter behandling med karbonylcyanid m-klorfenylhydrazon (CCCP), ett mitokondriellt frikopplingsmedel. Dessutom uttrycktes en PD-länkad mutation av Parkin (ParkinT240R) som hämmar Parkin-beroende mitofagi för att bestämma hur mutantuttryck påverkar mitokondriellt nätverk jämfört med celler som uttrycker Parkin av vildtyp. Protokollet som beskrivs här beskriver ett enkelt arbetsflöde med fluorescensbaserade metoder för att kvantifiera mitokondriell membranpotential och superoxidnivåer effektivt.

Introduction

Mitokondriellt nätverk är en serie sammankopplade organeller som spelar en avgörande roll i energiproduktion1, medfödd immunitet2,3 och cellsignalering 4,5. Mitokondriell dysreglering har associerats med neurodegenerativa sjukdomar som Parkinsons sjukdom (PD)6,7. PD är en progressiv neurodegenerativ sjukdom som påverkar dopaminerga neuroner i substantia nigra som påverkar nästan 10 miljoner människor världen över8. PD har varit genetiskt kopplad till mitofagi, en mitokondriell kvalitetskontrollväg som är nödvändig för att upprätthålla cellulär homeostas som selektivt tar bort skadade mitokondrier 9,10. Studier har identifierat flera oberoende mitofagivägar, inklusive FUN14-domän innehållande 1 (FUNDC1)-medierad mitofagi, Bcl-2-interagerande protein 3 (BNIP3)-underlättad mitofagi, NIX-beroende mitofagi och det välkarakteriserade PTEN-inducerade kinas 1 (PINK1)/Parkin-reglerade mitofagi10,11. PINK1 (ett förmodat kinas) och Parkin (ett E3 ubiquitinligas) arbetar tillsammans för att fosfo-ubiquitinatskadade mitokondrier, vilket driver bildandet av autofagosomer som uppslukar den skadade organellen och smälter samman med lysosomer för att initiera nedbrytning 12,13,14,15,16. Mutationer i Parkin har associerats med PD-länkade fenotyper såsom neurodegeneration via förlust av dopaminerga neuroner17,18.

Här beskrivs ett protokoll där HeLa-celler, rutinmässigt använda odödliga celler härrörande från livmoderhalscancer, används för att undersöka Parkins roll för att upprätthålla mitokondriell nätverkshälsa. HeLa-celler uttrycker försumbara nivåer av endogent Parkin och kräver därför exogent Parkin-uttryck19. För att studera Parkins roll i mitokondriell nätverkshälsa transfekteras HeLa-celler med antingen vildtyp Parkin (ParkinWT), en Parkin-mutant (ParkinT240R) eller en tom kontrollvektor. ParkinT240R är en autosomalt recessiv juvenil parkinsonismmutation som påverkar Parkin E3-ligasaktiviteten, vilket avsevärt minskar effektiviteten hos mitofagivägen20. HeLa-celler utsätts för milda (5 μM) eller svåra (20 μM) koncentrationer av karbonylcyanid m-klorfenylhydrazon (CCCP), ett mitokondriellt frikopplingsmedel. Behandling med svåra koncentrationer av CCCP används rutinmässigt för att inducera parkinmedierad mitofagi i olika cellinjer, såsom HeLa- och COS-7-celler21,22,23.

Efter behandling använder protokollet levande avbildning av mitokondriellt nätverk med hjälp av två för närvarande tillgängliga mitokondriella riktade fluorescerande färgämnen. Tetrametylrodamin, etylester, perklorat (TMRE) är ett katjoniskt färgämne som fluorescerar baserat på mitokondriell membranpotential24, medan MitoSOX är en mitokondriell superoxidindikator där fluorescensintensiteten är en funktion av superoxidkoncentrationen25. Slutligen använder det skisserade protokollet en fluorescensbaserad kvantifiering och ett enkelt arbetsflöde för att effektivt kvantifiera mitokondriell membranpotential och superoxidnivåer med minimalt utrymme för användarbias. Även om detta protokoll utformades för att studera mitokondriell funktion i HeLa-celler, kan det anpassas för ytterligare cellinjer och primära celltyper för att kvantitativt karakterisera mitokondriell nätverkshälsa.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Beredning av biologiska prover

OBS: Utför följande steg med steril teknik i ett biosäkerhetsskåp. Spraya ytan på skåpet och allt material med 70% etanol.

  1. HeLa-cellodling och transfektion
    1. Odla 30 000 HeLa-celler i Dulbeccos modifierade örnmedium (DMEM) innehållande 4,5 g/L glukos kompletterat med 10 % fetalt bovint serum och 1 % L-glutaminlösning (HeLa-media; se materialförteckning). Platta cellerna på 35 mm bildplattor med glasbotten (seT kunna av material) som innehåller 2 ml förvärmda HeLa-medier. Håll HeLa-kulturerna vid 5% CO2 och 37 °C26,27.
    2. Dagen efter plätering, inspektera 35 mm bildskålarna med ett ljusmikroskop för att säkerställa att cellerna är ~ 50% -60% sammanflytande. När de är sammanflytande, transfektera HeLa-cellerna med tom gul fluorescerande proteinvektor (YFP), YFP-ParkinWT eller YFP-ParkinT240R (figur 1A).
    3. Bered två separata blandningar i sterila mikrocentrifugrör för varje transfektion. Blanda genom att knacka på röret eller försiktigt pipettera upp och ner.
      1. Blanda 200 μl reducerat serummedium (se materialtabell) med 2 μg plasmid-DNA i rör 1.
      2. Blanda 200 μl reducerat serummedium med 6 μl transfektionsreagens (se Materialtabell)28 i rör 2.
    4. Inkubera rören i 5 minuter vid rumstemperatur (RT). Tillsätt rör 2 till rör 1, blanda genom pipettering upp och ner och inkubera i 20 minuter vid rumstemperatur.
    5. Tillsätt transfektionskomplexen droppvis till de befintliga bildskålarna som innehåller HeLa-cellkulturerna, vilket säkerställer lika fördelning över hela skålen. Placera bildskålarna i 5% CO2 och 37 ° C inkubatorn över natten.
      OBS: Märk varje maträtt med lämplig transfekterad plasmid. För varje experiment, märk de tre YFP-ParkinWT-skålarna (dimetylsulfoxid [DMSO; se materialtabell], 5 μM CCCP och 20 μM CCCP). Upprepa märkningen med de tre YFP-ParkinT240R-skålarna och de tre tomma YFP-vektorskålarna.
  2. Beredning av CCCP och fluorescerande färgämnen
    VARNING: Fluorescerande färgämnen är ofta ljuskänsliga. Förvara färgämnena i mörkret med aluminiumfolie eller bruna centrifugrör för att minska exponeringen för ljus.
    1. Gör en 5 mM arbetsstock av CCCP (se materialförteckning) genom att lösa upp 5 mg CCCP i 4,89 ml DMSO. Gör en 20 mM arbetsstock av CCCP genom att lösa upp 5 mg CCCP i 1,22 ml DMSO.
    2. Späd 10 μL av en 1 mM MitoTracker Deep Red (se materialtabell) stamlösning i 390 μL DMSO för att göra en 25 μM arbetsstock.
    3. Lös 50 μg MitoSOX Red25 (se materialtabell) i 13 μL DMSO för att skapa ett 5 mM arbetslager.
    4. Lös 10 mg TMRE24 (se Materialtabell) i 19,4 ml DMSO till en 1 mM stamlösning. Späd ut TMRE genom att tillsätta 10 μL 1 mM TMRE till 990 μL DMSO för att skapa en arbetsstock på 10 μM.

2. CCCP-behandling och mitokondriell märkning med fluorescerande sonder i HeLa-celler

VARNING: Utför följande steg snabbt för att säkerställa att HeLa-cellerna inte är ute ur inkubatorn under en längre period.

  1. Dagen efter transfektionen tillsätts 2 μl av antingen 5 eller 20 mM CCCP (slutkoncentration: 5 μM respektive 20 μM) till varje försöksplatta. För kontrollplattor, tillsätt 2 μL DMSO. Sätt tillbaka plattorna i 5 % CO2 och 37 °C inkubatorn i 1,5 timmar (figur 1A).
    OBS: CCCP-behandlingen är totalt 2 timmar. Mitokondrierna märks dock med fluorescerande sonder under de sista 30 minuterna av CCCP-behandlingen.
  2. Efter 1,5 h, ta bort plattorna från inkubatorn och tillsätt fluorescerande sonder till bildplattorna. Sätt tillbaka plattorna i 5 % CO2 och 37 °C inkubatorn i 30 minuter (figur 1A).
    1. TMRE-experiment: Tillsätt 2 μL 25 μM MitoTracker (slutlig koncentration: 25 nM) och 2 μL 10 μM TMRE (slutlig koncentration: 10 nM).
    2. MitoSOX-experiment: Tillsätt 2 μL 25 μM MitoTracker (slutlig koncentration: 25 nM) och 1 μL 5 mM MitoSOX (slutlig koncentration: 2,5 μM).
  3. Efter 2 timmars CCCP-behandling, förbered HeLa-cellerna för avbildning (figur 1A,B).
    1. TMRE-experiment: HeLa-celler är omedelbart redo att avbildas; se till att TMRE finns kvar i HeLa-cellodlingsmediet.
    2. MitoSOX-experiment: Tvätta cellerna 3x med 2 ml förvärmda HeLa-medier för att ta bort fritt MitoSOX-färgämne. Tillsätt 2 ml förvärmt media. HeLa-cellerna är nu redo att avbildas.
      OBS: Tvätta HeLa-cellerna med färska, förvärmda HeLa-medier som innehåller samma DMSO- eller CCCP-koncentration som experimentbetingelsen. inkludera inte MitoSOX eller MitoTracker.

3. Inställning av konfokalmikroskopbildinsamling

OBS: Avbilda HeLa-cellerna med hjälp av ett konfokalmikroskop (se materialtabell) utrustat med ett 63x/1,40 numeriskt bländarmål (NA) för nedsänkning av olja och en miljökammare (se materialtabell).

  1. Vid 1 h före avbildning, slå på CO2 genom att öppna tankventilen. Tryck på På-knappen för att slå på miljökontrollen för mikroskopet. Använd upp - och nedpilarna på pekplattan för att justera temperaturen till 37 °C och CO2 till 5 %. Tryck på Ställ in när du är klar.
    OBS: Se till att dörrarna till miljökammaren är stängda och vänta på att förhållandena stabiliseras.
  2. Laserinställningar
    1. Slå på White Light Laser (WLL) och ställ in lasereffekten på 85% och excitationskontrollen till maximal effekt. Klicka på fliken Hämta, välj Lägg till laser och växla WLL till På i dialogrutan som visas. Klicka på laserströmbrytaren och ange 85 %. Klicka på knappen Excitationskontroll och välj Maximal effekt i rullgardinsmenyn (bild 2A).
    2. TMRE-experiment: Ställ in excitations- och emissionsspektra för YFP, MitoTracker och TMRE.
      1. För YFP, ställ in excitationslasern på 514 nm och emissionsspektrafönstret på 524-545 nm. På fliken Hämta klickar du på knappen Lägg till ny inställning; Klicka sedan på Lägg till laser och dra den till Inställning 1. Dubbelklicka på excitationslinjen och ange 514 som våglängd i dialogrutan. Dubbelklicka på motsvarande detektor och ange 524 för början och 545 för slutvåglängden.
      2. För MitoTracker Deep Red, ställ in excitationslasern på 641 och emissionsspektrafönstret på 650-750 nm. På fliken Hämta klickar du på knappen Lägg till laser och drar den till Inställning 1. Dubbelklicka på Excitationslinjen och ange 641 som våglängd i dialogrutan. Dubbelklicka på motsvarande detektor och ange 650 för början och 750 för slutvåglängden.
      3. För TMRE, ställ in excitationslasern på 555 nm och emissionsspektrafönstret på 557-643 nm. På fliken Hämta klickar du på knappen Lägg till ny inställning; Klicka sedan på knappen Lägg till laser och dra den till Inställning 2. Dubbelklicka på Excitation Line och ange 555 som våglängd i dialogrutan. Dubbelklicka på motsvarande detektor och ange 557 för början och 643 för slutvåglängden.
    3. MitoSOX-experiment: Ställ in excitations- och emissionsspektra för YFP, MitoTracker och MitoSOX (figur 2B).
      1. För YFP, ställ in excitationslasern på 507 nm och emissionsspektrafönstret på 517-540 nm. På fliken Hämta klickar du på knappen Lägg till ny inställning; Klicka sedan på knappen Lägg till laser och dra den till Inställning 1. Dubbelklicka på excitationslinjen och ange 507 som våglängd i dialogrutan. Dubbelklicka på motsvarande detektor och ange 517 för början och 540 för slutvåglängden.
      2. För MitoSOX, ställ in excitationslasern på 547 nm och emissionsspektrafönstret på 564-636 nm. På fliken Hämta klickar du på knappen Lägg till ny inställning ; Klicka sedan på knappen Lägg till laser och dra den till Inställning 2. Dubbelklicka på Excitationsraden och ange 547 som våglängd i dialogrutan. Dubbelklicka på motsvarande detektor och ange 564 för början och 636 för slutvåglängden.
      3. För MitoTracker Deep Red, ställ in excitationslasern på 641 nm och emissionsspektrafönstret på 652-742 nm. På fliken Hämta klickar du på knappen Lägg till ny inställning; klicka på knappen Lägg till laser och dra den till Inställning 3. Dubbelklicka på Excitationslinjen och ange 641 som våglängd i dialogrutan. Dubbelklicka på motsvarande detektor och ange 652 för början och 742 för slutvåglängden.
  3. Inställningar för bildinsamling (bild 2C)
    1. Ställ in formatet på 1 024 x 1 024, skanningshastigheten på 600 Hz och linjegenomsnittet på 3.
      1. Välj fliken Förvärv och klicka på knappen Format . I listrutan väljer du 1 024 x 1 024. Klicka på knappen Hastighet och välj 600 i rullgardinsmenyn. Klicka sedan på knappen Radgenomsnitt och välj 3 i rullgardinsmenyn.
      2. Aktivera dubbelriktad skanning och ställ in fas- och zoomfaktorn på 22,61 respektive 1,50.
        1. På fliken Förvärv växlar du knappen Dubbelriktad till På. Klicka på fas X-inställningen och ställ in den på 22.61. Klicka på inställningen Zoomfaktor och ställ in den på 1,50.

4. Bildinsamling

VARNING: Experimenten måste göra en visuell bedömning för att välja cellerna baserat på YFP-fluorescenssignalen. Undvik övermättade pixlar, eftersom de kan påverka fluorescensintensitetskvantifieringen avsevärt. Använd en över/under-uppslagstabell som anger pixelmättnad för att undvika att hämta mättade bilder.

  1. Klicka på inställningen av intresse och tryck på Fast Live för att ge en liveförhandsvisning av fluorescensbilden.
  2. Justera förstärkningen och intensiteten genom att dubbelklicka på motsvarande detektor. I dialogrutan som visas justerar du förstärkningen med skjutreglaget. För att ändra intensiteten, dubbelklicka på Excitation Line och använd upp- och nedpilarna i popup-fönstret för att ändra intensiteten. Klicka på Stoppa för att avsluta förhandsgranskningen.
    1. TMRE-experiment : Avbilda DMSO-kontrollplattan först. Justera förstärkningen och intensiteten för TMRE-signalen (inställning 2) så att mitokondrienätverkets intensitet ligger strax under mättnaden. Håll förstärkningen och intensiteten konstant för experimentet. Justera förstärkningen och intensiteten för MitoTracker och YFP (inställning 1) så att mitokondriella nätverket är synligt men svagt.
    2. MitoSOX-experiment: Avbilda DMSO-kontrollplattan först. Justera förstärkningen och intensiteten för MitoSOX-signalen (inställning 2) så att fluorescensen är synlig men svag; Håll förstärkningen och intensiteten konstant för experimentet. Justera förstärkningen och intensiteten för YFP (inställning 1) och MitoTracker (inställning 3) så att mitokondriellt nätverk är synligt men svagt.
      Anteckna förstärkningen och intensiteten av TMRE och MitoSOX, eftersom dessa värden måste förbli konstanta under hela experimentet. Fluorescenssignalerna från YFP och MitoTracker kvantifieras inte i detta protokoll. Därför kan förstärkningen och intensiteten justeras för varje bild. Det är mest effektivt att ha förstärknings- och intensitetsinställningarna där cellerna är lätta att se men fortfarande svaga, för att säkerställa att cellerna inte utsätts för överdriven laserintensitet som orsakar cellskador eller fotoblekning.
  3. När förstärknings- och intensitetsinställningarna är klara klickar du på Start för att hämta en bild. Hämta bilder av 20 celler per experimentellt tillstånd (t.ex. fem bilder med fyra celler per bild; Figur 2D).

5. Kvantifiering av fluorescensintensitet med ImageJ

Bildfilerna sparas som ".lif" och är kompatibla med ImageJ29. Kompatibla filtyper med ImageJ anges på deras webbplats. Det kan vara nödvändigt att konvertera filtypen om den är inkompatibel.

  1. Skapa och spara en intresseregion (ROI).
    1. I ImageJ klickar du på Arkiv | Nyhet | Bild. I dialogrutan som visas klickar du på OK.
    2. Klicka på knappen Rektangelverktyg och rita en ruta på 6 mikron x 6 mikron. Öppna ROI-hanteraren genom att klicka på Analysera | Verktyg | ROI-hanteraren och vänta tills en dialogruta med ROI-hanteraren visas (bild 3A). Lägg till den rektangulära avkastningen på investeringen i chefen genom att klicka på Lägg till i dialogrutan för chef. Spara ROI genom att välja Mer, klicka sedan på knappen Spara och OK.
  2. Mät fluorescensintensiteten.
    1. I bild J klickar du på Arkiv och väljer Öppna. Markera bildfilerna för experimentet i dialogrutan och klicka på Öppna.
    2. Vänta tills fönstret Importalternativ för bioformat visas (bild 3B). Välj Dela kanaler och klicka på Öppna.
      OBS: Funktionen för delade kanaler gör att varje kanal i bilden kan öppnas som ett separat fönster. Kanalordern motsvarar anskaffningsordern.
      1. TMRE-experiment : YFP (inställning 1) är den första kanalen (c = 0); MitoTracker (inställning 1) är den andra kanalen (c = 1); och TMRE (inställning 2) är den tredje kanalen (c = 2).
      2. MitoSOX-experiment : YFP (inställning 1) är den första kanalen (c = 0); MitoSOX (inställning 2) är den andra kanalen (c = 1); och MitoTracker (inställning 3) är den tredje kanalen (c = 2).
    3. Justera ljusstyrkan genom att välja Bild | Justera | Ljusstyrka (figur 3C).
      Tryck inte på Set eller Apply för att säkerställa att bildens ljusstyrka inte ändras permanent. Ibland är fluorescensintensiteten inte synlig i TMRE- eller MitoSOX-kanalerna. Justera ljusstyrkan för att möjliggöra enklare visualisering. Ändring av ljusstyrkan påverkar inte de råa fluorescensintensitetsvärdena.
    4. Klicka på Analysera och välj Ange mått. Markera rutorna Area och Mean gray value och klicka på OK (bild 3D).
      OBS: Det genomsnittliga gråvärdet är fluorescensintensiteten.
    5. Öppna ROI Manager och ladda ROI som sparades i steg 5.1 genom att klicka på Analysera | Verktyg | ROI-chef. I ROI-hanteraren klickar du på Mer, sedan på Öppna i listan som visas och väljer den sparade avkastningen.
    6. Mät fluorescensintensiteten för fem slumpmässiga regioner i en enda cell genom att välja den sparade avkastningen från ROI-hanteraren och flytta ROI till en slumpmässig plats i en cell (figur 3E). Mät fluorescensintensiteten genom att trycka på M. Upprepa det här steget med ytterligare fyra områden som inte överlappar varandra. När en dialogruta med area- och medelgråvärden visas (bild 3F) kopierar och klistrar du in värdena i ett kalkylblad för analys.
      1. TMRE-experiment : Välj bild (c = 2).
      2. MitoSOX-experiment : Välj bild (c = 2).
    7. Erhåll de genomsnittliga fluorescensintensitetsvärdena. Använd kalkylprogram (se Materialförteckning) och beräkna medelvärdet av de fem genomsnittliga gråvärdena. Upprepa denna process för varje cell.
    8. Analysera och jämföra TMRE- eller MitoSOX-medelvärdet för gråvärden över experimentella förhållanden med hjälp av ett statistiskt program (se Materialförteckning; Figur 4 och figur 5). Presentera data som stapeldiagram eller fioldiagram.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

I detta protokoll användes fluorescensbaserad kvantifiering för att mäta membranpotentialen och superoxidnivåerna i mitokondriella nätverket efter CCCP-behandling (figur 1). Detta arbetsflöde använde HeLa-celler, en odödliggjord cellinje härledd från livmoderhalscancer. HeLa-celler används rutinmässigt för att studera mitokondriell biologi och är relativt platta, vilket gör det enkelt att visualisera mitokondriella nätverket med hjälp av mikroskopi. För att undersöka Parkins roll för att upprätthålla mitokondriell nätverkshälsa transfekterades HeLa-celler tillfälligt med en tom kontrollvektor, ParkinWT eller ParkinT240R (en mutant som stör mitofagi)21. HeLa-celler pläterades i 35 mm bildplattor med glasbotten och transfekterades när ~ 50% -60% sammanflöde uppnåddes (figur 1A). Eftersom HeLa-celler snabbt delar sig är detta vanligtvis dagen efter plätering av cellerna i bildskålarna. Ett ljusmikroskop användes för att observera YFP-fluorescenssignalen följande dag för att bedöma transfektionseffektiviteten. Experiment utfördes endast efter en lyckad transfektion.

Efter inspektion behandlades HeLa-cellerna med milda (5 μM) eller svåra (20 μM) koncentrationer av CCCP för att depolarisera mitokondriellt nätverk (steg 1.2 visar detaljerade instruktioner för beredning av CCCP och fluorescerande sonder). CCCP-behandlingen utfördes i totalt 2 timmar. Under de sista 30 minuterna av CCCP-behandlingen märktes mitokondrierna med MitoTracker och TMRE/MitoSOX (figur 1A). Det bör noteras att TMRE och MitoSOX har överlappande fluorescensspektra och inte kan användas samtidigt. Istället använde vi separata bildrätter för TMRE- och MitoSOX-experimenten. För TMRE-experiment var HeLa-cellerna omedelbart redo att avbildas i slutet av 2 timmars CCCP-behandling. TMRE-koncentrationen måste förbli konstant. därför stannade TMRE kvar i HeLa-media. Fri MitoSOX måste dock tas bort före avbildning. För MitoSOX-experimenten tvättades cellerna tre gånger med HeLa-media för att avlägsna det fria färgämnet. För detta steg är det viktigt att använda HeLa-media som innehåller samma DMSO- eller CCCP-koncentration som experimentbetingelserna. Hoechst 33342, en nuklemarkör, användes ursprungligen för att bedöma HeLa-cellerna efter transient transfektion och CCCP-behandling (figur 1B).

Därefter utfördes konfokalmikroskopi för att visualisera TMRE- och MitoSOX-fluorescensintensiteter för att mäta mitokondriell membranpotential respektive superoxidnivåer. Bilderna togs med hjälp av ett 63x (1,4 NA) oljenedsänkningsmål med parametrar för dubbelriktad skanning, en rumslig upplösning på 1 024 x 1 024 pixlar, en skanningshastighet på 600 Hz, linjemedelvärde på 3, en fas på 22,61 och en zoomfaktor på 1,5 (figur 2C). DMSO-kontrollplattan avbildades först för alla experiment för att ställa in förstärknings- och intensitetsvärdena för TMRE och MitoSOX. För att göra kvantitativa jämförelser mellan förhållanden måste dessa värden ställas in i DMSO-tillståndet och förbli konstanta under hela experimentet. CCCP inducerar mitokondriell depolarisering och förlust av membranpotential, vilket resulterar i en minskad TMRE-fluorescensintensitet. Därför hade kontrollexperimenten den högsta TMRE-intensiteten, och förstärknings- och intensitetsvärdena sattes nära mättnad. Däremot ökar högre superoxidnivåer MitoSOX-intensiteten. Därför hade kontrollen den lägsta MitoSOX-fluorescensintensiteten, och förstärknings- och intensitetsvärdena sattes lågt där en svag signal var närvarande. Eftersom MitoTracker, TMRE och MitoSOX är viktiga färgämnen och märker alla celler, bör de inte användas när du väljer celler att avbilda. Istället valdes cellerna baserat på YFP-signalen för att säkerställa att de transfekterades. Enplansbilder förvärvades, med fokus på botten av HeLa-cellen, där en stor population av mitokondrier var belägen.

Kvantifiering av TMRE- och MitoSOX-fluorescensintensitet
Kvantifiering av TMRE- och MitoSOX-fluorescensintensiteterna analyserades med hjälp av ImageJ (figur 3). En ROI på 6 mikron x 6 mikron skapades och lagrades i ROI-hanteraren. ROI placerades i fem slumpmässiga icke-överlappande regioner i varje cell för att mäta TMRE- eller MitoSOX-intensiteten. Fluorescensintensiteten motsvarar medelvärdet för gråton i ImageJ. De fem intensitetsvärdena beräknades i genomsnitt för varje cell för att beräkna den genomsnittliga fluorescensintensiteten per cell. Dessa värden plottades och analyserades för statistisk signifikans över behandlingsförhållandena.

Resultaten för TMRE- och MitoSOX-fluorescensintensiteterna visas i figur 4 respektive figur 5. Som förväntat minskade behandling med det kända frikopplingsmedlet CCCP TMRE-fluorescensintensiteten jämfört med kontrollförhållandena (figur 4A,B). Dessutom inducerade svår (20 μM) CCCP-behandling superoxidproduktion och ökade MitoSOX-fluorescensintensiteten (figur 5A, B). I milda (5 μM) CCCP-stressförhållanden resulterade uttrycket av ParkinWT och ParkinT240R i högre TMRE-intensitet jämfört med den tomma YFP-kontrollvektorn. På samma sätt var MitoSOX-intensiteten lägre i celler som uttryckte ParkinWT och ParkinT240R jämfört med celler som uttryckte YFP-kontrollvektorn (figur 5A, B). Dessa resultat tyder på att Parkin-uttryck hjälper till att upprätthålla mitokondriella nätverkshälsan genom att bevara högre mitokondriella membranpotentialer och låga superoxidnivåer. Således kan protokollet som beskrivs här användas för att exakt jämföra fluorescensintensitet för att analysera Parkins roll vid kontroll av mitokondriell membranpotential och superoxidbildning.

Figure 1
Bild 1: Experimentellt arbetsflöde . (A) Schematisk bild av det experimentella arbetsflödet som används för att transfektera, behandla med CCCP och märka mitokondriernas nätverk och avbilda TMRE- och MitoSOX-fluorescensintensiteten i HeLa-celler. (B) Representativa bilder av celler som uttrycker en tom YFP-vektor (överst), YFP-ParkinWT (mitten) och YFP-ParkinT240R (nederst; magenta). Hoechst 33342 (vit) används för att märka DNA. Skalstång = 10 μm. Förkortningar: CCCP = karbonylcyanid m-klorfenylhydrazon; TMRE = tetrametylrodamin-etylester-perklorat, YFP = gult fluorescerande protein. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 2
Bild 2: Användargränssnittet för att ställa in inställningar för konfokal inhämtning . (A) Dialogrutan Laserinställningar. Den röda rektangeln markerar laser, effekttillstånd, lasereffekt och våglängder med vitt ljus. (B) Experimentell kanal inrättad för ett MitoSOX-experiment. Inställningar, excitationslinjer och emissionsspektrafönster visas för YFP, MitoSOX och MitoTracker. (C) Förvärvsinställningar visar format, hastighet, dubbelriktad riktning, fas X, zoomfaktor och linjemedelvärde. (D) En representativ förvärvad bild. HeLa-celler uttrycker YFP (magenta) och mitokondrierna är märkta med MitoSOX (grön) och MitoTracker (cyan). Skalstång = 10 μm. Förkortningar: WLL = vit ljuslaser; YFP = gult fluorescerande protein. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 3
Figur 3: ImageJ-arbetsflöde för att kvantifiera TMRE- och MitoSOX-fluorescensintensiteter . (A) ROI-chefspanelen med ett exempel på ROI i ImageJ. (B) Panelen för importalternativ för bioformat. Den röda rektangeln markerar alternativet Dela kanaler som ska väljas. (C) Parametrar för inställningar för ljusstyrka och kontrast. (D) Ställ in mätparameter. De röda rektanglarna markerar alternativen Yta och Medelgrått som ska väljas. (E) Representativ bild av en HeLa-cell märkt med MitoSOX. Den röda fyrkanten illustrerar avkastningen från panel A. Skalstapel = 10 μm. (F) Resultatpanel som visar försöksområdet och genomsnittliga gråvärden från ROI. Det genomsnittliga gråvärdet (orange) representerar fluorescensintensitetsvärdena. Förkortningar: TMRE = tetrametylrodamin-etylester-perklorat; ROI = region av intresse. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 4
Figur 4: TMRE-fluorescensintensitet efter mitokondriell skada. (A) Representativa bilder av HeLa-celler efter 2 timmars behandling med DMSO, 5 μM CCCP eller 20 μM CCCP för att inducera mitokondriell skada. Celler uttrycker exogent en tom YFP-vektor, YFP-ParkinWT eller YFP-ParkinT240R (magenta) och märkta med MitoTracker (cyan) och TMRE (grön). Skalstapel = 30 μm. (B) Kvantifiering av TMRE-fluorescensintensitet för celler som uttrycker tom YFP-vektor (blå), YFP-ParkinWT (orange) och YFP-ParkinT240R (lila) under DMSO- och CCCP-behandlade förhållanden. p < 0,0001 med tvåvägs ANOVA med ett multipeljämförelsetest. (C–E) Kvantifieringen av TMRE-fluorescensintensiteterna från panel B separeras för att markera skillnader i DMSO (C), 5 μM CCCP (D) och 20 μM CCCP (E). * p < 0,05; p < 0,001; p < 0,0001 av Kruskal-Wallis ANOVA med Dunns multipeljämförelsetest. Ns = inte signifikant. Medelvärde ± SEM; n= 79-104 från tre oberoende biologiska replikat. Förkortningar: CCCP = karbonylcyanid m-klorfenylhydrazon; TMRE = tetrametylrodamin-etylester-perklorat, YFP = gult fluorescerande protein; DMSO = dimetylsulfoxid. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 5
Figur 5: MitoSOX fluorescensintensitet efter skada på mitokondriellt nätverk. (A) Representativa bilder av HeLa-celler behandlade i 2 timmar med DMSO, 5 μM CCCP eller 20 μM CCCP för att koppla bort mitokondriernas membranpotential. Cellerna transfekterades med tom YFP-vektor, YFP-ParkinWT eller YFP-ParkinT240R (magenta) och märktes med MitoTracker (cyan) och MitoSOX (grön). Skalstapel = 30 μm. (B) Kvantifiering av MitoSOX fluorescensintensitet för celler som uttrycker tom YFP-vektor (blå), YFP-ParkinWT (orange) och YFP-ParkinT240R (lila) för kontroll- och behandlingsförhållanden. p < 0,0001 med tvåvägs ANOVA med Dunns multipeljämförelsetest. (C–E) Kvantifieringen av MitoSOX fluorescensintensiteter från panel B separeras för att markera skillnader i DMSO (C), 5 μM CCCP (D) och 20 μM CCCP (E). *p < 0,05; p < 0,0001 av Kruskal-Wallis ANOVA med Dunns multipeljämförelsetest. Ns = inte signifikant. Medelvärde ± SEM; n = 87-107 från tre oberoende biologiska replikat. Förkortningar: CCCP = karbonylcyanid m-klorfenylhydrazon; TMRE = tetrametylrodamin-etylester-perklorat, YFP = gult fluorescerande protein; DMSO = dimetylsulfoxid. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Arbetsflödet som beskrivs här kan användas för att kvantifiera mitokondriell membranpotential och superoxidnivåer robust och reproducerbart med hjälp av fluorescensbaserad avbildning30. Det finns viktiga tekniska begränsningar att tänka på när du utformar dessa experiment. HeLa-celler transfekterades med en tom YFP-vektor, YFP-ParkinWT eller YFP-ParkinT240R. Den tomma YFP-vektorn användes som en kontroll för att bekräfta att experimentella fynd var specifika för Parkin. För den transienta transfektionen bestämdes ett massförhållande på 1:3 för DNA till transfektionsreagens experimentellt för att ge den högsta transfektionshastigheten, där 2 μg plasmid-DNA användes för varje konstruktion28. Att hålla YFP-taggen konsekvent för alla konstruktioner var viktigt, eftersom fluorescerande proteiner skiljer sig åt i medfödd ljusstyrka31,32. Om flera fluorescerande proteintaggar måste användas, bör fluorescerande proteiner med liknande ljusstyrka och fotostabilitet väljas33.

För att mäta mitokondriell membranpotential och superoxidnivåer valdes två väldokumenterade färgämnen. Fluorescenssignalen för TMRE är baserad på mitokondriell membranpotential, medan MitoSOX fluorescensintensitet är en funktion av superoxidnivåer. För fluorescensbaserad avbildning bör det inte finnas någon spektral överlappning mellan fluorescerande sonder. Det ursprungliga protokollet utfördes dock med mCherry-ParkinWT och mCherry-ParkinT240R, som överlappade med de rödförskjutna spektra för TMRE och MitoSOX. För att undvika spektral överlappning och minimera potentiell överhörning valdes YFP-taggade Parkin-konstruktioner. Denna justering krävde att MitoTracker-färgämnet ändrades från grönt till långrött. Dessutom optimerades HeLa-cellpläteringsdensiteten; Ursprungligen pläterades HeLa-celler vid 45 000 celler per bildskål, men detta resulterade i överkonfluenta rätter. Hög cellsammanflöde kan minska transfektionseffektiviteten, främja celldöd och förändra cellulär metabolism34,35,36. För att undvika dessa potentiella effekter pläterades cellerna med en densitet av 30 000 celler per bildskål.

Huvudbegränsningen för detta protokoll är potentialen för användarförspänning, särskilt när du väljer celler och ROI-platser. Protokollet använder förändringar i TMRE- och MitoSOX-fluorescensintensiteterna som en funktionell avläsning för membranpotential och superoxidnivåer. Därför kan cellval med hjälp av dessa sonder potentiellt snedvrida de experimentella resultaten. För att bekämpa denna bias valde vi celler enbart baserat på YFP-uttryck. Icke-överlappande ROI valdes slumpmässigt över mitokondriella nätverket i cellen. Även om denna metod tidigare användes för att mäta fluorescensintensitet27, kunde ytterligare biasreducerande åtgärder vidtas. För det första kan studien blindas med hjälp av Blind Analysis Tools i ImageJ för att förhindra ROI-val som stöder förväntade resultat. För det andra kan fluorescensintensiteter mätas med hjälp av avancerad bildanalysprogramvara som eliminerar behovet av ROI.

Medan detta protokoll använder konfokalmikroskopi för fluorescensbaserad kvantifiering, kan ytterligare metoder, såsom flödescytometri, användas för att kvantifiera fluorescensförändringar i TMRE och MitoSOX37. Här använde vi konfokalmikroskopi snarare än flödescytometri för att visualisera mitokondriell nätverksmorfologi. Det skisserade protokollet kan enkelt anpassas för att mäta TMRE och MitoSOX fluorescens med flödescytometri som ger liknande experimentella resultat. Dessutom kan analyser av syreförbrukningshastighet (OCR) användas för att detektera förändringar i funktionen hos den mitokondriella elektrontransportkedjan utan katjoniska färgämnen. Medan OCR ger ett känsligt mått på mitokondriell dysfunktion, är det inte specifikt för membranpotential eller superoxidkoncentration, utan ger istället ett globalt mått på mitokondriell funktion38. Dessa analyser kan utföras i samband med TMRE- och MitoSOX-experiment för att bedöma mitokondriell hälsa39.

Även om detta protokoll specifikt fokuserar på effekten av mitokondriell frånkoppling CCCP40, kan skadliga reagens med alternativa mekanismer användas. Till exempel är antimycin A och oligomycin A elektrontransportkedjehämmare som vanligtvis används för att inducera mitokondriell skada via produktion av reaktiva syreradikaler (ROS)38. Medan vi specifikt mätte mitokondriella superoxidnivåer med MitoSOX, kunde intracellulär ROS mätas med CellROX. I HeLa-celler var det nödvändigt att överuttrycka Parkin på grund av det låga endogena uttrycket. Framtida studier kan observera effekterna av Parkin-uttryck på mitokondriell nätverkshälsa med hjälp av cellodlingssystem som uttrycker endogen Parkin41. Eftersom mitokondrier är kritiska regulatorer av energimetabolism och cellulär homeostas är mitokondriell dysfunktion associerad med många sjukdomar, inklusive diabetes42, Alzheimers sjukdom 43,44,45, cancer 46 och leversjukdom 47. Därför kan detta arbetsflöde anpassas för att studera mitokondriell hälsa och dysreglering i relevanta cellinjer och primärkulturer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har inga konkurrerande intressen att deklarera.

Acknowledgments

Vi tackar medlemmarna i Evans labb för deras tankeväckande feedback på detta manuskript. Detta arbete stöds av Duke Whitehead Scholars, Duke Science and Technology Scholars och Howard Hughes Medical Institute (HHMI) Hanna Gray Fellowship. Figur 1A gjordes med hjälp av BioRender.com.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Chemicals, Peptides, and Recombinant Proteins
CCCP (carbonyl cyanide m-chlorophenyl hydrazone)  Sigma-Aldrich C2759
DMEM (1x) with 4.5 g/L glucose Gibco 11-965-084
DMSO, Anhydrous ThermoFisher Scientific D12345
Fetal Bovine Serum Hyclone SH3007103
FuGENE 6 (Tranfection Reagent) Promega E2691
GlutaMAX 100x (L-Glutamine Solution)  Gibco  35-050-061
Hoescht 33342 ThermoFisher Scientific 62249
MitoSOX  Red  ThermoFisher Scientific M36008
MitoTracker Deep Red ThermoFisher Scientific M7514
Opti-MEM (Redued Serum media) ThermoFisher scientific 31985070
Tetramethylrhodamine, Ethyl Ester, Perchlorate (TMRE)  ThermoFisher Scientific T669
Experimental models: Organisms/Strains
HeLa-M (Homo sapiens) A. Peden (Cambridge Institute for Medical Research) N/A
Recombinant DNA
EYFP Empty Vector N/A N/A
YFP-Parkin T240R This Paper Generated by site-directed mutagenesis from YFP-Parkin
YFP-Parkin WT Addgene; PMID:19029340 RRID:Addgene_23955
Software and Algorithms
Adobe Illustrator Adobe Inc. https://www.adobe.com/products/illustrator (Schindelin, 2012)
Excel (Spreadsheet Software) Microsoft Office  https://www.microsoft.com/en-us/microsoft-365/excel
ImageJ https://imagej.net/software/fiji/
Leica Application Suite (LAS X) Leica https://www.leica-microsystems.com/products/microscope-software/p/leica-las-x-ls/
Microsoft Excel Microsoft Office https://www.microsoft.com/excel
Prism9 (Statistical Analysis Software) GraphPad Software https://www.graphpad.com
Other
35 mm Dish, No. 1.5 Coverslip, 20 mm Glass Diameter, Uncoated MatTek P35G-1.5-20-C
Cage Incubator (Environmental Chamber) Okolab https://www.oko-lab.com/cage-incubator
DMiL Inverted Microscope Leica N/A
LIGHTNING Deconvolution Software Leica N/A
STELLARIS 8 confocal microscope Leica N/A

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Spinelli, J. B., Haigis, M. C. The multifaceted contributions of mitochondria to cellular metabolism. Nature Cell Biology. 20 (7), 745-754 (2018).
  2. West, A. P., Shadel, G. S., Ghosh, S. Mitochondria in innate immune responses. Nature Reviews. Immunology. 11 (6), 389-402 (2011).
  3. Seth, R. B., Sun, L., Ea, C. K., Chen, Z. J. Identification and characterization of MAVS, a mitochondrial antiviral signaling protein that activates NF-kappaB and IRF 3. Cell. 122 (5), 669-682 (2005).
  4. Tait, S. W. G., Green, D. R. Mitochondria and cell signalling. Journal of Cell Science. 125, 807-815 (2012).
  5. Antico Arciuch, V. G., Elguero, M. E., Poderoso, J. J., Carreras, M. C. Mitochondrial regulation of cell cycle and proliferation. Antioxidants and Redox Signaling. 16 (10), 1150-1180 (2012).
  6. Grunewald, A., Kumar, K. R., Sue, C. M. New insights into the complex role of mitochondria in Parkinson's disease. Progress in Neurobiology. 177, 73-93 (2019).
  7. Borsche, M., Pereira, S. L., Klein, C., Grunewald, A. Mitochondria and Parkinson's disease: clinical, molecular, and translational aspects. Journal of Parkinson's Disease. 11 (1), 45-60 (2021).
  8. Ou, Z., et al. Global trends in the incidence, prevalence, and years lived with disability of Parkinson's disease in 204 countries/territories from 1990 to 2019. Frontiers in Public Health. 9, 776847 (2021).
  9. Martinez-Vicente, M. Neuronal mitophagy in neurodegenerative diseases. Frontiers in Molecular Neuroscience. 10, 64 (2017).
  10. Youle, R. J., Narendra, D. P. Mechanisms of mitophagy. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 12 (1), 9-14 (2011).
  11. Villa, E., Marchetti, S., Ricci, J. E. No Parkin zone: mitophagy without Parkin. Trends in Cell Biology. 28 (11), 882-895 (2018).
  12. Geisler, S., et al. The PINK1/Parkin-mediated mitophagy is compromised by PD-associated mutations. Autophagy. 6 (7), 871-878 (2010).
  13. Kane, L. A., et al. PINK1 phosphorylates ubiquitin to activate Parkin E3 ubiquitin ligase activity. The Journal of Cell Biology. 205 (2), 143-153 (2014).
  14. Koyano, F., et al. Ubiquitin is phosphorylated by PINK1 to activate parkin. Nature. 510 (7503), 162-166 (2014).
  15. Ordureau, A., et al. Defining roles of PARKIN and ubiquitin phosphorylation by PINK1 in mitochondrial quality control using a ubiquitin replacement strategy. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (21), 6637-6642 (2015).
  16. Ordureau, A., et al. Quantitative proteomics reveal a feedforward mechanism for mitochondrial PARKIN translocation and ubiquitin chain synthesis. Molecular Cell. 56 (3), 360-375 (2014).
  17. Kitada, T., et al. Mutations in the parkin gene cause autosomal recessive juvenile parkinsonism. Nature. 392 (6676), 605-608 (1998).
  18. Valente, E. M., et al. PARK6 is a common cause of familial parkinsonism. Neurological Sciences. 23, S117-S118 (2002).
  19. Matsuda, N., et al. PINK1 stabilized by mitochondrial depolarization recruits Parkin to damaged mitochondria and activates latent Parkin for mitophagy. The Journal of Cell Biology. 189 (2), 211-221 (2010).
  20. Sriram, S. R., et al. Familial-associated mutations differentially disrupt the solubility, localization, binding and ubiquitination properties of parkin. Human Molecular Genetics. 14 (17), 2571-2586 (2005).
  21. Vives-Bauza, C., et al. PINK1-dependent recruitment of Parkin to mitochondria in mitophagy. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (1), 378-383 (2010).
  22. Wong, Y. C., Holzbaur, E. L. F. Optineurin is an autophagy receptor for damaged mitochondria in parkin-mediated mitophagy that is disrupted by an ALS-linked mutation. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (42), E4439-E4448 (2014).
  23. Bertolin, G., et al. Parkin maintains mitochondrial levels of the protective Parkinson's disease-related enzyme 17-beta hydroxysteroid dehydrogenase type 10. Cell Death and Differentiation. 22 (10), 1563-1576 (2015).
  24. Crowley, L. C., Christensen, M. E., Waterhouse, N. J. Measuring mitochondrial transmembrane potential by TMRE staining. Cold Spring Harbor Protocols. 2016 (12), (2016).
  25. Kuznetsov, A. V., et al. Mitochondrial ROS production under cellular stress: comparison of different detection methods. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 400 (8), 2383-2390 (2011).
  26. Moore, A. S., Holzbaur, E. L. F. Dynamic recruitment and activation of ALS-associated TBK1 with its target optineurin are required for efficient mitophagy. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (24), E3349-E3358 (2016).
  27. Evans, C. S., Holzbaur, E. L. F. Degradation of engulfed mitochondria is rate-limiting in Optineurin-mediated mitophagy in neurons. eLife. 9, e50260 (2020).
  28. Jacobsen, L. B., Calvin, S. A., Colvin, K. E., Wright, M. FuGENE 6 Transfection Reagent: the gentle power. Methods. 33 (2), 104-112 (2004).
  29. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  30. Mitra, K., Lippincott-Schwartz, J. Analysis of mitochondrial dynamics and functions using imaging approaches. Current Protocols in Cell Biology. , Chapter 4, Unit 4.25 1-21 (2010).
  31. Lin, H. C., Liu, S. Y., Lai, H. S., Lai, I. R. Isolated mitochondria infusion mitigates ischemia-reperfusion injury of the liver in rats. Shock. 39 (3), 304-310 (2013).
  32. Kholmukhamedov, A., Schwartz, J. M., Lemasters, J. J. Isolated mitochondria infusion mitigates ischemia-reperfusion injury of the liver in rats: mitotracker probes and mitochondrial membrane potential. Shock. 39 (6), 543 (2013).
  33. Thorn, K. Genetically encoded fluorescent tags. Molecular Biology of the Cell. 28 (7), 848-857 (2017).
  34. Pavel, M., et al. Contact inhibition controls cell survival and proliferation via YAP/TAZ-autophagy axis. Nature Communications. 9 (1), 2961 (2018).
  35. Rossignol, R., et al. Energy substrate modulates mitochondrial structure and oxidative capacity in cancer cells. Cancer Research. 64 (3), 985-993 (2004).
  36. Schornack, P. A., Gillies, R. J. Contributions of cell metabolism and H+ diffusion to the acidic pH of tumors. Neoplasia. 5 (2), 135-145 (2003).
  37. Christensen, M. E., Jansen, E. S., Sanchez, W., Waterhouse, N. J. Flow cytometry based assays for the measurement of apoptosis-associated mitochondrial membrane depolarisation and cytochrome c release. Methods. 61 (2), 138-145 (2013).
  38. Muller, B., et al. Application of extracellular flux analysis for determining mitochondrial function in mammalian oocytes and early embryos. Scientific Reports. 9 (1), 16778 (2019).
  39. Connolly, N. M. C., et al. Guidelines on experimental methods to assess mitochondrial dysfunction in cellular models of neurodegenerative diseases. Cell Death and Differentiation. 25 (3), 542-572 (2018).
  40. Demine, S., Renard, P., Arnould, T. Mitochondrial uncoupling: a key controller of biological processes in physiology and diseases. Cells. 8 (8), 795 (2019).
  41. Narendra, D., Tanaka, A., Suen, D. F., Youle, R. J. Parkin is recruited selectively to impaired mitochondria and promotes their autophagy. The Journal of Cell Biology. 183 (5), 795-803 (2008).
  42. Kwak, S. H., Park, K. S., Lee, K. U., Lee, H. K. Mitochondrial metabolism and diabetes. Journal of Diabetes Investigation. 1 (5), 161-169 (2010).
  43. Reddy, P. H. Role of mitochondria in neurodegenerative diseases: mitochondria as a therapeutic target in Alzheimer's disease. CNS Spectrums. 14 (8), 8-13 (2009).
  44. Wang, W., Zhao, F., Ma, X., Perry, G., Zhu, X. Mitochondria dysfunction in the pathogenesis of Alzheimer's disease: recent advances. Molecular Neurodegeneration. 15 (1), 30 (2020).
  45. Baloyannis, S. J. Mitochondrial alterations in Alzheimer's disease. Journal of Alzheimer's Disease. 9 (2), 119-126 (2006).
  46. Wallace, D. C. Mitochondria and cancer. Nature Reviews. Cancer. 12 (10), 685-698 (2012).
  47. Middleton, P., Vergis, N. Mitochondrial dysfunction and liver disease: role, relevance, and potential for therapeutic modulation. Therapeutic Advances in Gastroenterology. 14, 17562848211031394 (2021).

Tags

Biologi utgåva 195 mitokondrier mitofagi neurodegeneration parkin mitokondriell membranpotential reaktiva syreradikaler superoxid HeLa-celler konfokalmikroskopi
Fluorescensbaserad kvantifiering av mitokondriell membranpotential och superoxidnivåer med hjälp av levande avbildning i HeLa-celler
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Fazli, M., Evans, C. S.… More

Fazli, M., Evans, C. S. Fluorescence-Based Quantification of Mitochondrial Membrane Potential and Superoxide Levels Using Live Imaging in HeLa Cells. J. Vis. Exp. (195), e65304, doi:10.3791/65304 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter