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Biology

Quantificação Baseada em Fluorescência do Potencial de Membrana Mitocondrial e Níveis de Superóxido Usando Imagem Viva em Células HeLa

Published: May 12, 2023
doi:
10.3791/65304
,
1Department of Cell Biology,Duke University Medical Center

Summary

Esta técnica descreve um fluxo de trabalho eficaz para visualizar e medir quantitativamente o potencial de membrana mitocondrial e os níveis de superóxido dentro de células HeLa usando imagens ao vivo baseadas em fluorescência.

Abstract

As mitocôndrias são organelas dinâmicas críticas para a homeostase metabólica, controlando a produção de energia via síntese de ATP. Para apoiar o metabolismo celular, vários mecanismos de controle de qualidade mitocondrial cooperam para manter uma rede mitocondrial saudável. Uma dessas vias é a mitofagia, onde a quinase 1 induzida por PTEN (PINK1) e a fosfoubiquitinação de Parkin das mitocôndrias danificadas facilitam o sequestro do autofagossomo e a subsequente remoção da célula via fusão lisossômica. A mitofagia é importante para a homeostase celular, e mutações em Parkin estão ligadas à doença de Parkinson (DP). Devido a esses achados, tem havido uma ênfase significativa na investigação do dano e turnover mitocondrial para entender os mecanismos moleculares e a dinâmica do controle de qualidade mitocondrial. Aqui, imagens de células vivas foram usadas para visualizar a rede mitocondrial de células HeLa, para quantificar o potencial de membrana mitocondrial e os níveis de superóxido após o tratamento com cianeto de carbonila m-clorofenil hidrazona (CCCP), um agente desacoplador mitocondrial. Além disso, uma mutação PD-ligada de Parkin (ParkinT240R) que inibe a mitofagia Parkin-dependente foi expressa para determinar como a expressão mutante impacta a rede mitocondrial em comparação com as pilhas que expressam Parkin selvagem-tipo. O protocolo descrito aqui descreve um fluxo de trabalho simples usando abordagens baseadas em fluorescência para quantificar o potencial de membrana mitocondrial e os níveis de superóxido de forma eficaz.

Introduction

A rede mitocondrial é uma série de organelas interconectadas que desempenham um papel crucial na produção de energia1, imunidade inata 2,3 e sinalização celular 4,5. A desregulação mitocondrial tem sido associada a doenças neurodegenerativas, como a doença de Parkinson (DP)6,7. A DP é uma doença neurodegenerativa progressiva que afeta neurônios dopaminérgicos da substância negra e afeta cerca de 10 milhões de pessoas em todo omundo8. A DP tem sido geneticamente ligada à mitofagia, uma via de controle de qualidade mitocondrial necessária para a manutenção da homeostase celular que remove seletivamente as mitocôndrias danificadas 9,10. Estudos identificaram múltiplas vias de mitofagia independentes, incluindo o domínio FUN14 contendo 1 mitofagia mediada por FUNDC1, mitofagia facilitada pela proteína de interação Bcl-2 3 (BNIP3), mitofagia dependente de NIX e a bem caracterizada quinase 1 induzida por PTEN (PINK1)/mitofagia regulada por Parkin10,11. PINK1 (uma suposta quinase) e Parkin (uma ubiquitina ligase E3) trabalham em conjunto com mitocôndrias danificadas por fosfo-ubiquitinato, o que impulsiona a formação de autofagossomos que engolem a organela danificada e se fundem com lisossomos para iniciar a degradação 12,13,14,15,16. Mutações em Parkin têm sido associadas a fenótipos ligados à DP, como a neurodegeneração via perda de neurônios dopaminérgicos17,18.

Aqui, é descrito um protocolo no qual células HeLa, rotineiramente usadas como células imortalizadas derivadas do câncer cervical, são usadas para investigar o papel de Parkin na manutenção da saúde da rede mitocondrial. As células HeLa expressam níveis desprezíveis de Parkin endógeno e, portanto, requerem expressão exógena de Parkin19. Para estudar o papel de Parkin na saúde da rede mitocondrial, as células HeLa são transfectadas com Parkin selvagem (ParkinWT), um mutante Parkin (ParkinT240R) ou um vetor de controle vazio. ParkinT240R é uma mutação autossômica recessiva do parkinsonismo juvenil que afeta a atividade da ligase Parkin E3, reduzindo significativamente a eficiência da via mitofágica20. As células HeLa estão sujeitas a concentrações leves (5 μM) ou severas (20 μM) de cianeto de carbonila m-clorofenil hidrazona (CCCP), um agente desacoplador mitocondrial. O tratamento com concentrações severas de CCCP é rotineiramente utilizado para induzir mitofagia mediada por Parkin em várias linhagens celulares, como células HeLa e COS-721,22,23.

Após o tratamento, o protocolo emprega imagens ao vivo da rede mitocondrial usando dois corantes fluorescentes direcionados para mitocôndrias atualmente disponíveis. A tetrametilrodamina, éster etílico, perclorato (TMRE) é um corante catiônico que fluoresce com base no potencial de membrana mitocondrial24, enquanto a MitoSOX é um indicador de superóxido mitocondrial onde a intensidade da fluorescência é função da concentração de superóxido25. Finalmente, o protocolo delineado usa uma quantificação baseada em fluorescência e fluxo de trabalho simples para quantificar efetivamente o potencial de membrana mitocondrial e os níveis de superóxido com escopo mínimo para viés do usuário. Embora este protocolo tenha sido desenhado para estudar a função mitocondrial em células HeLa, ele pode ser adaptado para linhagens celulares adicionais e tipos celulares primários para caracterizar quantitativamente a saúde da rede mitocondrial.

Protocol

1. Preparação de amostras biológicas NOTA: Execute as seguintes etapas usando técnica estéril em um gabinete de biossegurança. Borrife a superfície do gabinete e todos os materiais com etanol 70%. Cultura e transfecção de células HeLaCultura de 30.000 células HeLa em meio águia modificado de Dulbecco (DMEM) contendo 4,5 g/L de glicose suplementado com 10% de soro fetal bovino e solução de L-glutamina a 1% (HeLa media; ver Tabela de Mater…

Representative Results

Neste protocolo, a quantificação baseada em fluorescência foi utilizada para medir o potencial de membrana e os níveis de superóxido da rede mitocondrial após o tratamento com CCCP (Figura 1). Esse fluxo de trabalho usou células HeLa, uma linhagem celular imortalizada derivada do câncer cervical. As células HeLa são rotineiramente usadas para estudar a biologia mitocondrial e são relativamente planas, facilitando a visualização da rede mitocondrial usando microscopia. Para inves…

Discussion

O fluxo de trabalho aqui descrito pode ser usado para quantificar o potencial de membrana mitocondrial e os níveis de superóxido de forma robusta e reprodutível usando imagens baseadas em fluorescência30. Há limitações técnicas importantes a serem consideradas ao projetar esses experimentos. As células HeLa foram transfectadas com um vetor YFP vazio, YFP-ParkinWT ou YFP-ParkinT240R. O vetor YFP vazio foi usado como controle para confirmar que os achados experimentais…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Agradecemos aos membros do laboratório Evans por seu feedback atencioso sobre este manuscrito. Este trabalho é apoiado por Duke Whitehead Scholars, Duke Science and Technology Scholars, e Howard Hughes Medical Institute (HHMI) Hanna Gray Fellowship. A Figura 1A foi confeccionada com BioRender.com.

Materials

Chemicals, Peptides, and Recombinant Proteins
CCCP (carbonyl cyanide m-chlorophenyl hydrazone)  Sigma-Aldrich C2759
DMEM (1x) with 4.5 g/L glucose Gibco 11-965-084
DMSO, Anhydrous ThermoFisher Scientific D12345
Fetal Bovine Serum Hyclone SH3007103
FuGENE 6 (Tranfection Reagent) Promega E2691
GlutaMAX 100x (L-Glutamine Solution)  Gibco  35-050-061
Hoescht 33342 ThermoFisher Scientific 62249
MitoSOX  Red  ThermoFisher Scientific M36008
MitoTracker Deep Red ThermoFisher Scientific M7514
Opti-MEM (Redued Serum media) ThermoFisher scientific 31985070
Tetramethylrhodamine, Ethyl Ester, Perchlorate (TMRE)  ThermoFisher Scientific T669
Experimental models: Organisms/Strains
HeLa-M (Homo sapiens) A. Peden (Cambridge Institute for Medical Research) N/A
Recombinant DNA
EYFP Empty Vector N/A N/A
YFP-Parkin T240R This Paper Generated by site-directed mutagenesis from YFP-Parkin
YFP-Parkin WT Addgene; PMID:19029340 RRID:Addgene_23955
Software and Algorithms
Adobe Illustrator Adobe Inc. https://www.adobe.com/products/illustrator (Schindelin, 2012)
Excel (Spreadsheet Software) Microsoft Office  https://www.microsoft.com/en-us/microsoft-365/excel
ImageJ https://imagej.net/software/fiji/
Leica Application Suite (LAS X) Leica https://www.leica-microsystems.com/products/microscope-software/p/leica-las-x-ls/
Microsoft Excel Microsoft Office https://www.microsoft.com/excel
Prism9 (Statistical Analysis Software) GraphPad Software https://www.graphpad.com
Other
35 mm Dish, No. 1.5 Coverslip, 20 mm Glass Diameter, Uncoated MatTek P35G-1.5-20-C
Cage Incubator (Environmental Chamber) Okolab https://www.oko-lab.com/cage-incubator
DMiL Inverted Microscope Leica N/A
LIGHTNING Deconvolution Software Leica N/A
STELLARIS 8 confocal microscope Leica N/A
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References

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Keywords: Mitochondrial Membrane PotentialSuperoxide LevelsLive ImagingHeLa CellsNeurodegenerative DiseasesParkinson’s DiseaseALSSTEDSIMExpansion MicroscopyMitophagyPINK1ParkinMitochondrial Quality ControlATP SynthesisCCCPParkin T240R Mutation
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Fazli, M., Evans, C. S. Fluorescence-Based Quantification of Mitochondrial Membrane Potential and Superoxide Levels Using Live Imaging in HeLa Cells. J. Vis. Exp. (195), e65304, doi:10.3791/65304 (2023).
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