Quantificazione basata sulla fluorescenza del potenziale di membrana mitocondriale e dei livelli di superossido utilizzando l'imaging dal vivo nelle cellule HeLa
Summary
Questa tecnica descrive un flusso di lavoro efficace per visualizzare e misurare quantitativamente il potenziale della membrana mitocondriale e i livelli di superossido all’interno delle cellule HeLa utilizzando l’imaging dal vivo basato sulla fluorescenza.
Abstract
I mitocondri sono organelli dinamici critici per l’omeostasi metabolica controllando la produzione di energia attraverso la sintesi di ATP. Per sostenere il metabolismo cellulare, vari meccanismi di controllo della qualità mitocondriale cooperano per mantenere una rete mitocondriale sana. Uno di questi percorsi è la mitofagia, in cui la chinasi 1 indotta da PTEN (PINK1) e la fosfo-ubiquitinazione parkina dei mitocondri danneggiati facilitano il sequestro dell’autofagosoma e la successiva rimozione dalla cellula tramite fusione del lisosoma. La mitofagia è importante per l’omeostasi cellulare e le mutazioni nel Parkin sono legate alla malattia di Parkinson (PD). A causa di questi risultati, c’è stata un’enfasi significativa sullo studio del danno mitocondriale e del turnover per comprendere i meccanismi molecolari e le dinamiche del controllo di qualità mitocondriale. Qui, l’imaging di cellule vive è stato utilizzato per visualizzare la rete mitocondriale delle cellule HeLa, per quantificare il potenziale della membrana mitocondriale e i livelli di superossido dopo il trattamento con cianuro di carbonile m-clorofenil idrazone (CCCP), un agente di disaccoppiamento mitocondriale. Inoltre, una mutazione PD-linked di Parkin (ParkinT240R) che inibisce la mitofagia Parkin-dipendente è stata espressa per determinare come l’espressione mutante influisce sulla rete mitocondriale rispetto alle cellule che esprimono Parkin wild-type. Il protocollo qui descritto descrive un semplice flusso di lavoro che utilizza approcci basati sulla fluorescenza per quantificare efficacemente il potenziale della membrana mitocondriale e i livelli di superossido.
Introduction
La rete mitocondriale è una serie di organelli interconnessi che svolgono un ruolo cruciale nella produzione di energia1, nell’immunità innata2,3 e nella segnalazione cellulare 4,5. La disregolazione mitocondriale è stata associata a malattie neurodegenerative come il morbo di Parkinson (PD)6,7. Il PD è una malattia neurodegenerativa progressiva che colpisce i neuroni dopaminergici della substantia nigra che colpisce quasi 10 milioni di persone in tutto il mondo8. Il PD è stato geneticamente collegato alla mitofagia, una via di controllo della qualità mitocondriale necessaria per mantenere l’omeostasi cellulare che rimuove selettivamente i mitocondri danneggiati 9,10. Gli studi hanno identificato molteplici percorsi mitofagici indipendenti, tra cui la mitofagia mediata dal dominio FUN14 contenente 1 (FUNDC1), la mitofagia facilitata dalla proteina 3 interagente Bcl-2 (BNIP3), la mitofagia NIX-dipendente e la ben caratterizzata chinasi 1 (PINK1) / Parkin-regolata mitofagia10,11. PINK1 (una presunta chinasi) e Parkin (una ubiquitina ligasi E3) lavorano in tandem con i mitocondri danneggiati fosfo-ubiquitinati, che guidano la formazione di autofagosomi che inghiottono l’organello danneggiato e si fondono con i lisosomi per avviare la degradazione 12,13,14,15,16. Le mutazioni nel Parkin sono state associate a fenotipi legati alla PD come la neurodegenerazione attraverso la perdita di neuroni dopaminergici17,18.
Qui viene descritto un protocollo in cui le cellule HeLa, cellule immortalizzate utilizzate di routine derivate dal cancro cervicale, vengono utilizzate per studiare il ruolo del Parkin nel mantenimento della salute della rete mitocondriale. Le cellule HeLa esprimono livelli trascurabili di Parkin endogeno e pertanto richiedono l’espressione esogena di Parkina19. Per studiare il ruolo del Parkin nella salute della rete mitocondriale, le cellule HeLa sono trasfettate con Parkin di tipo selvatico (ParkinWT), un mutante Parkin (ParkinT240R) o un vettore di controllo vuoto. ParkinT240R è una mutazione autosomica recessiva del parkinsonismo giovanile che influenza l’attività della parkina E3 ligasi, riducendo significativamente l’efficienza della via mitofagia20. Le cellule HeLa sono soggette a concentrazioni lievi (5 μM) o gravi (20 μM) di cianuro di carbonile m-clorofenil idrazone (CCCP), un agente di disaccoppiamento mitocondriale. Il trattamento con gravi concentrazioni di CCCP viene utilizzato di routine per indurre la mitofagia mediata dal Parkina in varie linee cellulari, come HeLa e le cellule COS-721,22,23.
Dopo il trattamento, il protocollo impiega l’imaging dal vivo della rete mitocondriale utilizzando due coloranti fluorescenti mitocondriali attualmente disponibili. La tetrametilrhodamina, estere etilico, perclorato (TMRE) è un colorante cationico che fluoresce in base al potenziale di membrana mitocondriale24, mentre MitoSOX è un indicatore di superossido mitocondriale in cui l’intensità di fluorescenza è una funzione della concentrazione di superossido25. Infine, il protocollo delineato utilizza una quantificazione basata sulla fluorescenza e un flusso di lavoro semplice per quantificare efficacemente il potenziale della membrana mitocondriale e i livelli di superossido con un margine minimo per i pregiudizi dell’utente. Sebbene questo protocollo sia stato progettato per studiare la funzione mitocondriale nelle cellule HeLa, può essere adattato per ulteriori linee cellulari e tipi di cellule primarie per caratterizzare quantitativamente la salute della rete mitocondriale.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il flusso di lavoro qui descritto può essere utilizzato per quantificare il potenziale della membrana mitocondriale e i livelli di superossido in modo robusto e riproducibile utilizzando l’imaging basato sulla fluorescenza30. Ci sono importanti limitazioni tecniche da considerare quando si progettano questi esperimenti. Le cellule HeLa sono state trasfettate con un vettore YFP vuoto, YFP-ParkinWT o YFP-ParkinT240R. Il vettore YFP vuoto è stato utilizzato come controllo per …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo i membri del laboratorio Evans per il loro attento feedback su questo manoscritto. Questo lavoro è supportato da Duke Whitehead Scholars, Duke Science and Technology Scholars e Howard Hughes Medical Institute (HHMI) Hanna Gray Fellowship. La Figura 1A è stata realizzata utilizzando BioRender.com.
Materials
| Chemicals, Peptides, and Recombinant Proteins | |||
| CCCP (carbonyl cyanide m-chlorophenyl hydrazone) | Sigma-Aldrich | C2759 | |
| DMEM (1x) with 4.5 g/L glucose | Gibco | 11-965-084 | |
| DMSO, Anhydrous | ThermoFisher Scientific | D12345 | |
| Fetal Bovine Serum | Hyclone | SH3007103 | |
| FuGENE 6 (Tranfection Reagent) | Promega | E2691 | |
| GlutaMAX 100x (L-Glutamine Solution) | Gibco | 35-050-061 | |
| Hoescht 33342 | ThermoFisher Scientific | 62249 | |
| MitoSOX Red | ThermoFisher Scientific | M36008 | |
| MitoTracker Deep Red | ThermoFisher Scientific | M7514 | |
| Opti-MEM (Redued Serum media) | ThermoFisher scientific | 31985070 | |
| Tetramethylrhodamine, Ethyl Ester, Perchlorate (TMRE) | ThermoFisher Scientific | T669 | |
| Experimental models: Organisms/Strains | |||
| HeLa-M (Homo sapiens) | A. Peden (Cambridge Institute for Medical Research) | N/A | |
| Recombinant DNA | |||
| EYFP Empty Vector | N/A | N/A | |
| YFP-Parkin T240R | This Paper | Generated by site-directed mutagenesis from YFP-Parkin | |
| YFP-Parkin WT | Addgene; PMID:19029340 | RRID:Addgene_23955 | |
| Software and Algorithms | |||
| Adobe Illustrator | Adobe Inc. | https://www.adobe.com/products/illustrator | (Schindelin, 2012) |
| Excel (Spreadsheet Software) | Microsoft Office | https://www.microsoft.com/en-us/microsoft-365/excel | |
| ImageJ | https://imagej.net/software/fiji/ | ||
| Leica Application Suite (LAS X) | Leica | https://www.leica-microsystems.com/products/microscope-software/p/leica-las-x-ls/ | |
| Microsoft Excel | Microsoft Office | https://www.microsoft.com/excel | |
| Prism9 (Statistical Analysis Software) | GraphPad Software | https://www.graphpad.com | |
| Other | |||
| 35 mm Dish, No. 1.5 Coverslip, 20 mm Glass Diameter, Uncoated | MatTek | P35G-1.5-20-C | |
| Cage Incubator (Environmental Chamber) | Okolab | https://www.oko-lab.com/cage-incubator | |
| DMiL Inverted Microscope | Leica | N/A | |
| LIGHTNING Deconvolution Software | Leica | N/A | |
| STELLARIS 8 confocal microscope | Leica | N/A |
References
- Spinelli, J. B., Haigis, M. C. The multifaceted contributions of mitochondria to cellular metabolism. Nature Cell Biology. 20 (7), 745-754 (2018).
- West, A. P., Shadel, G. S., Ghosh, S. Mitochondria in innate immune responses. Nature Reviews. Immunology. 11 (6), 389-402 (2011).
- Seth, R. B., Sun, L., Ea, C. K., Chen, Z. J. Identification and characterization of MAVS, a mitochondrial antiviral signaling protein that activates NF-kappaB and IRF 3. Cell. 122 (5), 669-682 (2005).
- Tait, S. W. G., Green, D. R. Mitochondria and cell signalling. Journal of Cell Science. 125, 807-815 (2012).
- Antico Arciuch, V. G., Elguero, M. E., Poderoso, J. J., Carreras, M. C. Mitochondrial regulation of cell cycle and proliferation. Antioxidants and Redox Signaling. 16 (10), 1150-1180 (2012).
- Grunewald, A., Kumar, K. R., Sue, C. M. New insights into the complex role of mitochondria in Parkinson’s disease. Progress in Neurobiology. 177, 73-93 (2019).
- Borsche, M., Pereira, S. L., Klein, C., Grunewald, A. Mitochondria and Parkinson’s disease: clinical, molecular, and translational aspects. Journal of Parkinson’s Disease. 11 (1), 45-60 (2021).
- Ou, Z., et al. Global trends in the incidence, prevalence, and years lived with disability of Parkinson’s disease in 204 countries/territories from 1990 to 2019. Frontiers in Public Health. 9, 776847 (2021).
- Martinez-Vicente, M. Neuronal mitophagy in neurodegenerative diseases. Frontiers in Molecular Neuroscience. 10, 64 (2017).
- Youle, R. J., Narendra, D. P. Mechanisms of mitophagy. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 12 (1), 9-14 (2011).
- Villa, E., Marchetti, S., Ricci, J. E. No Parkin zone: mitophagy without Parkin. Trends in Cell Biology. 28 (11), 882-895 (2018).
- Geisler, S., et al. The PINK1/Parkin-mediated mitophagy is compromised by PD-associated mutations. Autophagy. 6 (7), 871-878 (2010).
- Kane, L. A., et al. PINK1 phosphorylates ubiquitin to activate Parkin E3 ubiquitin ligase activity. The Journal of Cell Biology. 205 (2), 143-153 (2014).
- Koyano, F., et al. Ubiquitin is phosphorylated by PINK1 to activate parkin. Nature. 510 (7503), 162-166 (2014).
- Ordureau, A., et al. Defining roles of PARKIN and ubiquitin phosphorylation by PINK1 in mitochondrial quality control using a ubiquitin replacement strategy. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (21), 6637-6642 (2015).
- Ordureau, A., et al. Quantitative proteomics reveal a feedforward mechanism for mitochondrial PARKIN translocation and ubiquitin chain synthesis. Molecular Cell. 56 (3), 360-375 (2014).
- Kitada, T., et al. Mutations in the parkin gene cause autosomal recessive juvenile parkinsonism. Nature. 392 (6676), 605-608 (1998).
- Valente, E. M., et al. PARK6 is a common cause of familial parkinsonism. Neurological Sciences. 23, S117-S118 (2002).
- Matsuda, N., et al. PINK1 stabilized by mitochondrial depolarization recruits Parkin to damaged mitochondria and activates latent Parkin for mitophagy. The Journal of Cell Biology. 189 (2), 211-221 (2010).
- Sriram, S. R., et al. Familial-associated mutations differentially disrupt the solubility, localization, binding and ubiquitination properties of parkin. Human Molecular Genetics. 14 (17), 2571-2586 (2005).
- Vives-Bauza, C., et al. PINK1-dependent recruitment of Parkin to mitochondria in mitophagy. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (1), 378-383 (2010).
- Wong, Y. C., Holzbaur, E. L. F. Optineurin is an autophagy receptor for damaged mitochondria in parkin-mediated mitophagy that is disrupted by an ALS-linked mutation. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (42), E4439-E4448 (2014).
- Bertolin, G., et al. Parkin maintains mitochondrial levels of the protective Parkinson’s disease-related enzyme 17-beta hydroxysteroid dehydrogenase type 10. Cell Death and Differentiation. 22 (10), 1563-1576 (2015).
- Crowley, L. C., Christensen, M. E., Waterhouse, N. J. Measuring mitochondrial transmembrane potential by TMRE staining. Cold Spring Harbor Protocols. 2016 (12), (2016).
- Kuznetsov, A. V., et al. Mitochondrial ROS production under cellular stress: comparison of different detection methods. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 400 (8), 2383-2390 (2011).
- Moore, A. S., Holzbaur, E. L. F. Dynamic recruitment and activation of ALS-associated TBK1 with its target optineurin are required for efficient mitophagy. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (24), E3349-E3358 (2016).
- Evans, C. S., Holzbaur, E. L. F. Degradation of engulfed mitochondria is rate-limiting in Optineurin-mediated mitophagy in neurons. eLife. 9, e50260 (2020).
- Jacobsen, L. B., Calvin, S. A., Colvin, K. E., Wright, M. FuGENE 6 Transfection Reagent: the gentle power. Methods. 33 (2), 104-112 (2004).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Mitra, K., Lippincott-Schwartz, J. Analysis of mitochondrial dynamics and functions using imaging approaches. Current Protocols in Cell Biology. , 1-21 (2010).
- Lin, H. C., Liu, S. Y., Lai, H. S., Lai, I. R. Isolated mitochondria infusion mitigates ischemia-reperfusion injury of the liver in rats. Shock. 39 (3), 304-310 (2013).
- Kholmukhamedov, A., Schwartz, J. M., Lemasters, J. J. Isolated mitochondria infusion mitigates ischemia-reperfusion injury of the liver in rats: mitotracker probes and mitochondrial membrane potential. Shock. 39 (6), 543 (2013).
- Thorn, K. Genetically encoded fluorescent tags. Molecular Biology of the Cell. 28 (7), 848-857 (2017).
- Pavel, M., et al. Contact inhibition controls cell survival and proliferation via YAP/TAZ-autophagy axis. Nature Communications. 9 (1), 2961 (2018).
- Rossignol, R., et al. Energy substrate modulates mitochondrial structure and oxidative capacity in cancer cells. Cancer Research. 64 (3), 985-993 (2004).
- Schornack, P. A., Gillies, R. J. Contributions of cell metabolism and H+ diffusion to the acidic pH of tumors. Neoplasia. 5 (2), 135-145 (2003).
- Christensen, M. E., Jansen, E. S., Sanchez, W., Waterhouse, N. J. Flow cytometry based assays for the measurement of apoptosis-associated mitochondrial membrane depolarisation and cytochrome c release. Methods. 61 (2), 138-145 (2013).
- Muller, B., et al. Application of extracellular flux analysis for determining mitochondrial function in mammalian oocytes and early embryos. Scientific Reports. 9 (1), 16778 (2019).
- Connolly, N. M. C., et al. Guidelines on experimental methods to assess mitochondrial dysfunction in cellular models of neurodegenerative diseases. Cell Death and Differentiation. 25 (3), 542-572 (2018).
- Demine, S., Renard, P., Arnould, T. Mitochondrial uncoupling: a key controller of biological processes in physiology and diseases. Cells. 8 (8), 795 (2019).
- Narendra, D., Tanaka, A., Suen, D. F., Youle, R. J. Parkin is recruited selectively to impaired mitochondria and promotes their autophagy. The Journal of Cell Biology. 183 (5), 795-803 (2008).
- Kwak, S. H., Park, K. S., Lee, K. U., Lee, H. K. Mitochondrial metabolism and diabetes. Journal of Diabetes Investigation. 1 (5), 161-169 (2010).
- Reddy, P. H. Role of mitochondria in neurodegenerative diseases: mitochondria as a therapeutic target in Alzheimer’s disease. CNS Spectrums. 14 (8), 8-13 (2009).
- Wang, W., Zhao, F., Ma, X., Perry, G., Zhu, X. Mitochondria dysfunction in the pathogenesis of Alzheimer’s disease: recent advances. Molecular Neurodegeneration. 15 (1), 30 (2020).
- Baloyannis, S. J. Mitochondrial alterations in Alzheimer’s disease. Journal of Alzheimer’s Disease. 9 (2), 119-126 (2006).
- Wallace, D. C. Mitochondria and cancer. Nature Reviews. Cancer. 12 (10), 685-698 (2012).
- Middleton, P., Vergis, N. Mitochondrial dysfunction and liver disease: role, relevance, and potential for therapeutic modulation. Therapeutic Advances in Gastroenterology. 14, 17562848211031394 (2021).
