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Biology

Quantificazione basata sulla fluorescenza del potenziale di membrana mitocondriale e dei livelli di superossido utilizzando l'imaging dal vivo nelle cellule HeLa

Published: May 12, 2023 doi: 10.3791/65304

Summary

Questa tecnica descrive un flusso di lavoro efficace per visualizzare e misurare quantitativamente il potenziale della membrana mitocondriale e i livelli di superossido all'interno delle cellule HeLa utilizzando l'imaging dal vivo basato sulla fluorescenza.

Abstract

I mitocondri sono organelli dinamici critici per l'omeostasi metabolica controllando la produzione di energia attraverso la sintesi di ATP. Per sostenere il metabolismo cellulare, vari meccanismi di controllo della qualità mitocondriale cooperano per mantenere una rete mitocondriale sana. Uno di questi percorsi è la mitofagia, in cui la chinasi 1 indotta da PTEN (PINK1) e la fosfo-ubiquitinazione parkina dei mitocondri danneggiati facilitano il sequestro dell'autofagosoma e la successiva rimozione dalla cellula tramite fusione del lisosoma. La mitofagia è importante per l'omeostasi cellulare e le mutazioni nel Parkin sono legate alla malattia di Parkinson (PD). A causa di questi risultati, c'è stata un'enfasi significativa sullo studio del danno mitocondriale e del turnover per comprendere i meccanismi molecolari e le dinamiche del controllo di qualità mitocondriale. Qui, l'imaging di cellule vive è stato utilizzato per visualizzare la rete mitocondriale delle cellule HeLa, per quantificare il potenziale della membrana mitocondriale e i livelli di superossido dopo il trattamento con cianuro di carbonile m-clorofenil idrazone (CCCP), un agente di disaccoppiamento mitocondriale. Inoltre, una mutazione PD-linked di Parkin (ParkinT240R) che inibisce la mitofagia Parkin-dipendente è stata espressa per determinare come l'espressione mutante influisce sulla rete mitocondriale rispetto alle cellule che esprimono Parkin wild-type. Il protocollo qui descritto descrive un semplice flusso di lavoro che utilizza approcci basati sulla fluorescenza per quantificare efficacemente il potenziale della membrana mitocondriale e i livelli di superossido.

Introduction

La rete mitocondriale è una serie di organelli interconnessi che svolgono un ruolo cruciale nella produzione di energia1, nell'immunità innata2,3 e nella segnalazione cellulare 4,5. La disregolazione mitocondriale è stata associata a malattie neurodegenerative come il morbo di Parkinson (PD)6,7. Il PD è una malattia neurodegenerativa progressiva che colpisce i neuroni dopaminergici della substantia nigra che colpisce quasi 10 milioni di persone in tutto il mondo8. Il PD è stato geneticamente collegato alla mitofagia, una via di controllo della qualità mitocondriale necessaria per mantenere l'omeostasi cellulare che rimuove selettivamente i mitocondri danneggiati 9,10. Gli studi hanno identificato molteplici percorsi mitofagici indipendenti, tra cui la mitofagia mediata dal dominio FUN14 contenente 1 (FUNDC1), la mitofagia facilitata dalla proteina 3 interagente Bcl-2 (BNIP3), la mitofagia NIX-dipendente e la ben caratterizzata chinasi 1 (PINK1) / Parkin-regolata mitofagia10,11. PINK1 (una presunta chinasi) e Parkin (una ubiquitina ligasi E3) lavorano in tandem con i mitocondri danneggiati fosfo-ubiquitinati, che guidano la formazione di autofagosomi che inghiottono l'organello danneggiato e si fondono con i lisosomi per avviare la degradazione 12,13,14,15,16. Le mutazioni nel Parkin sono state associate a fenotipi legati alla PD come la neurodegenerazione attraverso la perdita di neuroni dopaminergici17,18.

Qui viene descritto un protocollo in cui le cellule HeLa, cellule immortalizzate utilizzate di routine derivate dal cancro cervicale, vengono utilizzate per studiare il ruolo del Parkin nel mantenimento della salute della rete mitocondriale. Le cellule HeLa esprimono livelli trascurabili di Parkin endogeno e pertanto richiedono l'espressione esogena di Parkina19. Per studiare il ruolo del Parkin nella salute della rete mitocondriale, le cellule HeLa sono trasfettate con Parkin di tipo selvatico (ParkinWT), un mutante Parkin (ParkinT240R) o un vettore di controllo vuoto. ParkinT240R è una mutazione autosomica recessiva del parkinsonismo giovanile che influenza l'attività della parkina E3 ligasi, riducendo significativamente l'efficienza della via mitofagia20. Le cellule HeLa sono soggette a concentrazioni lievi (5 μM) o gravi (20 μM) di cianuro di carbonile m-clorofenil idrazone (CCCP), un agente di disaccoppiamento mitocondriale. Il trattamento con gravi concentrazioni di CCCP viene utilizzato di routine per indurre la mitofagia mediata dal Parkina in varie linee cellulari, come HeLa e le cellule COS-721,22,23.

Dopo il trattamento, il protocollo impiega l'imaging dal vivo della rete mitocondriale utilizzando due coloranti fluorescenti mitocondriali attualmente disponibili. La tetrametilrhodamina, estere etilico, perclorato (TMRE) è un colorante cationico che fluoresce in base al potenziale di membrana mitocondriale24, mentre MitoSOX è un indicatore di superossido mitocondriale in cui l'intensità di fluorescenza è una funzione della concentrazione di superossido25. Infine, il protocollo delineato utilizza una quantificazione basata sulla fluorescenza e un flusso di lavoro semplice per quantificare efficacemente il potenziale della membrana mitocondriale e i livelli di superossido con un margine minimo per i pregiudizi dell'utente. Sebbene questo protocollo sia stato progettato per studiare la funzione mitocondriale nelle cellule HeLa, può essere adattato per ulteriori linee cellulari e tipi di cellule primarie per caratterizzare quantitativamente la salute della rete mitocondriale.

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Protocol

1. Preparazione di campioni biologici

NOTA: eseguire i seguenti passaggi utilizzando una tecnica sterile in un armadio di biosicurezza. Spruzzare la superficie dell'armadio e tutti i materiali con etanolo al 70%.

  1. Coltura e trasfezione delle cellule HeLa
    1. Coltura di 30.000 cellule HeLa nel mezzo di coltura modificato di Dulbecco (DMEM) contenente 4,5 g/L di glucosio integrato con il 10% di siero bovino fetale e l'1% di soluzione di L-glutammina (HeLa media; vedi Tabella dei materiali). Placcare le celle su piastre di imaging con fondo di vetro da 35 mm (vedi Table of Materials) contenenti 2 mL di mezzo HeLa preriscaldato. Mantenere le colture HeLa al 5% di CO2 e 37 °C26,27.
    2. Il giorno dopo la placcatura, ispezionare le stoviglie di imaging da 35 mm utilizzando un microscopio ottico per assicurarsi che le cellule siano ~ 50% -60% confluenti. Una volta confluenti, trasfettare le cellule HeLa con il vettore YFP (yellow fluorescent protein) vuoto, YFP-ParkinWT o YFP-ParkinT240R (Figura 1A).
    3. Preparare due miscele separate in provette sterili per microcentrifuga per ogni trasfezione. Mescolare picchiettando il tubo o pipettando delicatamente su e giù.
      1. Nel tubo 1, mescolare 200 μL di mezzi sierici ridotti (vedere Tabella dei materiali) con 2 μg di DNA plasmide.
      2. Nella provetta 2, mescolare 200 μL di mezzo sierico ridotto con 6 μL di reagente di trasfezione (vedere Tabella dei materiali)28.
    4. Incubare i tubi per 5 minuti a temperatura ambiente (RT). Aggiungere il tubo 2 al tubo 1, mescolare mediante pipettaggio su e giù e incubare per 20 minuti a RT.
    5. Aggiungere i complessi di trasfezione a goccia ai piatti di imaging esistenti contenenti le colture cellulari HeLa, garantendo una distribuzione uniforme sull'intero piatto. Posizionare le piastre di imaging nell'incubatore al 5% di CO2 e 37 °C durante la notte.
      NOTA: Etichettare ogni piatto con il plasmide trasfettato appropriato. Per ogni esperimento, etichettare i tre piatti YFP-ParkinWT (dimetilsolfossido [DMSO; vedi Tabella dei materiali], 5 μM CCCP e 20 μM CCCP). Ripetere l'etichettatura con le tre parabole YFP-ParkinT240R e le tre parabole vettoriali YFP vuote.
  2. Preparazione di CCCP e coloranti fluorescenti
    ATTENZIONE: I coloranti fluorescenti sono spesso sensibili alla luce. Conservare i coloranti al buio utilizzando fogli di alluminio o tubi da centrifuga marrone per ridurre l'esposizione alla luce.
    1. Produrre una scorta di lavoro di 5 mM di CCCP (vedere Tabella dei materiali) sciogliendo 5 mg di CCCP in 4,89 mL di DMSO. Fare uno stock di lavoro di 20 mM di CCCP sciogliendo 5 mg di CCCP in 1,22 mL di DMSO.
    2. Diluire 10 μL di una soluzione madre MitoTracker Deep Red da 1 mM (vedere la tabella dei materiali) in 390 μL di DMSO per ottenere un materiale di lavoro da 25 μM.
    3. Sciogliere 50 μg di MitoSOX Red25 (vedere Tabella dei materiali) in 13 μL di DMSO per creare un materiale di lavoro di 5 mM.
    4. Sciogliere 10 mg di TMRE24 (vedere Tabella dei materiali) in 19,4 mL di DMSO per ottenere una soluzione madre da 1 mM. Diluire il TMRE aggiungendo 10 μL di 1 mM di TMRE in 990 μL di DMSO per ottenere un materiale di lavoro di 10 μM.

2. Trattamento CCCP ed etichettatura mitocondriale con sonde fluorescenti in cellule HeLa

ATTENZIONE: Eseguire rapidamente i seguenti passaggi per assicurarsi che le cellule HeLa non siano fuori dall'incubatore per un periodo prolungato.

  1. Il giorno dopo la trasfezione, aggiungere 2 μL di CCCP da 5 o 20 mM (concentrazione finale: 5 μM e 20 μM, rispettivamente) a ciascuna piastra sperimentale. Per le piastre di controllo, aggiungere 2 μL di DMSO. Riportare le piastre nell'incubatore al 5% di CO2 e 37 °C per 1,5 ore (Figura 1A).
    NOTA: Il trattamento CCCP è per un totale di 2 ore. Tuttavia, i mitocondri sono marcati con sonde fluorescenti durante gli ultimi 30 minuti del trattamento CCCP.
  2. Dopo 1,5 ore, rimuovere le piastre dall'incubatore e aggiungere sonde fluorescenti alle piastre di imaging. Riportare le piastre nell'incubatore al 5% di CO2 e 37 °C per 30 minuti (Figura 1A).
    1. Esperimento TMRE: aggiungere 2 μL di MitoTracker da 25 μM (concentrazione finale: 25 nM) e 2 μL di TMRE da 10 μM (concentrazione finale: 10 nM).
    2. Esperimento MitoSOX: aggiungere 2 μL di MitoTracker da 25 μM (concentrazione finale: 25 nM) e 1 μL di MitoSOX da 5 mM (concentrazione finale: 2,5 μM).
  3. Dopo il trattamento CCCP di 2 ore, preparare le cellule HeLa per l'imaging (Figura 1A,B).
    1. Esperimento TMRE: le cellule HeLa sono immediatamente pronte per l'immagine; assicurarsi che la TMRE rimanga nei terreni di coltura cellulare HeLa.
    2. Esperimento MitoSOX: lavare le cellule 3 volte con 2 ml di mezzo HeLa preriscaldato per rimuovere il colorante MitoSOX libero. Aggiungere 2 ml di fluido preriscaldato. Le cellule HeLa sono ora pronte per l'immagine.
      NOTA: Lavare le cellule HeLa con mezzi HeLa freschi e preriscaldati che contengono la stessa concentrazione di DMSO o CCCP della condizione sperimentale; non includono MitoSOX o MitoTracker.

3. Configurazione dell'acquisizione di immagini al microscopio confocale

NOTA: Immagini delle cellule HeLa utilizzando un microscopio confocale (vedi Tabella dei materiali) dotato di un obiettivo ad immersione in olio con apertura numerica (NA) 63x/1,40 e di una camera ambientale (vedi Tabella dei materiali).

  1. A 1 h prima dell'imaging, accendere la CO2 aprendo la valvola del serbatoio. Premere il pulsante On per accendere il controller ambientale per il microscopio. Utilizzare le frecce Su e Giù sul touchpad per regolare la temperatura a 37 °C e il CO2 al 5%. Premere Imposta al termine.
    NOTA: Assicurarsi che le porte della camera ambientale siano chiuse e attendere che le condizioni si stabilizzino.
  2. Impostazioni laser
    1. Accendere il laser a luce bianca (WLL) e impostare la potenza del laser all'85% e il controllo dell'eccitazione alla massima potenza. Fare clic sulla scheda Acquisisci, selezionare Aggiungi laser e, nella finestra di dialogo visualizzata, impostare WLL su On. Fare clic sul pulsante di accensione laser e immettere 85%. Fare clic sul pulsante Controllo eccitazione e selezionare Potenza massima dal menu a discesa (Figura 2A).
    2. Esperimento TMRE: Impostare gli spettri di eccitazione ed emissione per YFP, MitoTracker e TMRE.
      1. Per YFP, impostare il laser di eccitazione su 514 nm e la finestra degli spettri di emissione su 524-545 nm. Nella scheda Acquisisci, fai clic sul pulsante Aggiungi nuova impostazione; quindi, fai clic su Aggiungi laser e trascinalo in Impostazione 1. Fate doppio clic sulla linea di eccitazione e immettete 514 come lunghezza d'onda nella finestra di dialogo. Fare doppio clic sul rilevatore corrispondente e immettere 524 per l'inizio e 545 per la lunghezza d'onda finale.
      2. Per MitoTracker Deep Red, impostare il laser di eccitazione su 641 e la finestra degli spettri di emissione su 650-750 nm. Nella scheda Acquisisci, fai clic sul pulsante Aggiungi laser e trascinalo in Impostazione 1. Fate doppio clic sulla linea di eccitazione e immettete 641 come lunghezza d'onda nella finestra di dialogo. Fare doppio clic sul rilevatore corrispondente e immettere 650 per l'inizio e 750 per la lunghezza d'onda finale.
      3. Per TMRE, impostare il laser di eccitazione su 555 nm e la finestra degli spettri di emissione su 557-643 nm. Nella scheda Acquisisci, fai clic sul pulsante Aggiungi nuova impostazione; quindi, fai clic sul pulsante Aggiungi laser e trascinalo in Impostazione 2. Fate doppio clic sulla linea di eccitazione e immettete 555 come lunghezza d'onda nella finestra di dialogo. Fare doppio clic sul rilevatore corrispondente e immettere 557 per l'inizio e 643 per la lunghezza d'onda finale.
    3. Esperimento MitoSOX: Impostare gli spettri di eccitazione ed emissione per YFP, MitoTracker e MitoSOX (Figura 2B).
      1. Per YFP, impostare il laser di eccitazione su 507 nm e la finestra degli spettri di emissione su 517-540 nm. Nella scheda Acquisisci, fai clic sul pulsante Aggiungi nuova impostazione; quindi, fai clic sul pulsante Aggiungi laser e trascinalo in Impostazione 1. Fate doppio clic sulla linea di eccitazione e immettete 507 come lunghezza d'onda nella finestra di dialogo. Fare doppio clic sul rilevatore corrispondente e immettere 517 per l'inizio e 540 per la lunghezza d'onda finale.
      2. Per MitoSOX, impostare il laser di eccitazione su 547 nm e la finestra degli spettri di emissione su 564-636 nm. Nella scheda Acquisisci , fai clic sul pulsante Aggiungi nuova impostazione ; quindi, fai clic sul pulsante Aggiungi laser e trascinalo in Impostazione 2. Fate doppio clic sulla linea di eccitazione e immettete 547 come lunghezza d'onda nella finestra di dialogo. Fare doppio clic sul rilevatore corrispondente e immettere 564 per l'inizio e 636 per la lunghezza d'onda finale.
      3. Per MitoTracker Deep Red, impostare il laser di eccitazione su 641 nm e la finestra degli spettri di emissione su 652-742 nm. Nella scheda Acquisisci, fai clic sul pulsante Aggiungi nuova impostazione; fai clic sul pulsante Aggiungi laser e trascinalo in Impostazioni 3. Fate doppio clic sulla linea di eccitazione e immettete 641 come lunghezza d'onda nella finestra di dialogo. Fare doppio clic sul rilevatore corrispondente e immettere 652 per l'inizio e 742 per la lunghezza d'onda finale.
  3. Impostazioni di acquisizione delle immagini (Figura 2C)
    1. Impostare il formato su 1.024 x 1.024, la velocità di scansione su 600 Hz e la media di linea su 3.
      1. Selezionare la scheda Acquisizione e fare clic sul pulsante Formato . Dal menu a discesa, seleziona 1.024 x 1.024. Fai clic sul pulsante Velocità e seleziona 600 dal menu a discesa. Quindi, fai clic sul pulsante Media linea e, dal menu a discesa, seleziona 3.
      2. Attivare la scansione bidirezionale e impostare il fattore di fase e di zoom rispettivamente su 22,61 e 1,50.
        1. Nella scheda Acquisizione, impostare il pulsante Bidirezionale su Attivato. Fare clic sull'impostazione Fase X e impostarla su 22.61. Fare clic sull'impostazione Fattore di zoom e impostarla su 1,50.

4. Acquisizione di immagini

ATTENZIONE: Lo sperimentatore deve esprimere un giudizio visivo per selezionare le cellule in base al segnale di fluorescenza YFP. Evita i pixel sovrasaturi, in quanto possono influenzare significativamente la quantificazione dell'intensità della fluorescenza. Usa una tabella di ricerca sopra/sotto che indica la saturazione dei pixel per evitare di acquisire immagini sature.

  1. Fare clic su Impostazione di interesse e premere Fast Live per fornire un'anteprima in tempo reale dell'immagine a fluorescenza.
  2. Regolare il guadagno e l'intensità facendo doppio clic sul rilevatore corrispondente. Nella finestra di dialogo visualizzata, regolate il Guadagno utilizzando il dispositivo di scorrimento. Per modificare l'intensità, fare doppio clic sulla linea di eccitazione e utilizzare le frecce su e giù nella finestra popup per modificare l'intensità. Fare clic su Interrompi per terminare l'anteprima.
    1. Esperimento TMRE : Immagine prima della piastra di controllo DMSO . Regolare il guadagno e l'intensità del segnale TMRE (Impostazione 2) in modo che l'intensità della rete mitocondriale sia appena al di sotto della saturazione; Mantieni costante il guadagno e l'intensità per l'esperimento. Regolare il guadagno e l'intensità del MitoTracker e YFP (impostazione 1) in modo che la rete mitocondriale sia visibile ma debole.
    2. Esperimento MitoSOX: immagine prima della piastra di controllo DMSO. Regolare il guadagno e l'intensità del segnale MitoSOX (Impostazione 2) in modo che la fluorescenza sia visibile ma debole; Mantieni costante il guadagno e l'intensità per l'esperimento. Regolare il guadagno e l'intensità di YFP (Impostazione 1) e MitoTracker (Impostazione 3) in modo che la rete mitocondriale sia visibile ma debole.
      NOTA: Registrare il guadagno e l'intensità di TMRE e MitoSOX, poiché questi valori devono rimanere costanti durante l'esperimento. I segnali di fluorescenza di YFP e MitoTracker non sono quantificati in questo protocollo. Pertanto, il guadagno e l'intensità possono essere regolati per ogni immagine. È più efficace avere le impostazioni di guadagno e intensità in cui le cellule sono facili da vedere ma ancora deboli, per garantire che le cellule non siano esposte a intensità laser eccessive che causano danni cellulari o fotosbiancamento.
  3. Una volta completate le impostazioni di guadagno e intensità, fai clic su Avvia per acquisire un'immagine. Acquisire immagini di 20 cellule per condizione sperimentale (ad esempio, cinque immagini con quattro cellule per immagine; Figura 2D).

5. Quantificazione dell'intensità di fluorescenza con ImageJ

NOTA: i file di imaging vengono salvati come ".lif" e sono compatibili con ImageJ29. I tipi di file compatibili con ImageJ sono specificati sul loro sito Web. Potrebbe essere necessario convertire il tipo di file se è incompatibile.

  1. Creare e salvare un'area di interesse (ROI).
    1. In ImageJ, fare clic su File | Novità | Immagine. Nella finestra di dialogo visualizzata, fare clic su OK.
    2. Fate clic sul pulsante Strumento rettangolo (Rectangle Tool) e disegnate una casella da 6 micron x 6 micron. Apri il gestore ROI facendo clic su Analizza | Strumenti | ROI Manager e attendere che venga visualizzata una finestra di dialogo con il gestore ROI (Figura 3A). Aggiungere il ROI rettangolare al gestore facendo clic su Aggiungi nella finestra di dialogo del gestore. Salva il ROI selezionando Altro, quindi fai clic sul pulsante Salva e OK.
  2. Misurare l'intensità della fluorescenza.
    1. Nell'immagine J, fare clic su File e selezionare Apri. Nella finestra di dialogo, selezionare i file di imaging per l'esperimento e fare clic su Apri.
    2. Attendere che venga visualizzata la finestra Opzioni di importazione dei bioformati (Figura 3B). Selezionare Dividi canali e fare clic su Apri.
      NOTA: la funzione di divisione dei canali consente di aprire ciascun canale dell'immagine come finestra separata. L'ordine dei canali corrisponde all'ordine di acquisizione.
      1. Esperimenti TMRE : YFP (Setting 1) è il primo canale (c = 0); MitoTracker (Impostazione 1) è il secondo canale (c = 1); e TMRE (Impostazione 2) è il terzo canale (c = 2).
      2. Esperimenti MitoSOX : YFP (Setting 1) è il primo canale (c = 0); MitoSOX (Setting 2) è il secondo canale (c = 1); e MitoTracker (Impostazione 3) è il terzo canale (c = 2).
    3. Regolare la luminosità selezionando Immagine | Regola | Luminosità (Figura 3C).
      NOTA: non premere Imposta o Applica per assicurarsi che la luminosità dell'immagine non venga alterata in modo permanente. Occasionalmente, l'intensità della fluorescenza non è visibile nei canali TMRE o MitoSOX. Regola la luminosità per consentire una visualizzazione più semplice. La modifica della luminosità non influisce sui valori grezzi di intensità della fluorescenza.
    4. Fare clic su Analizza e selezionare Imposta misure. Selezionare le caselle Area e Valore grigio medio e fare clic su OK (Figura 3D).
      NOTA: il valore medio di grigio è l'intensità di fluorescenza.
    5. Aprire il ROI Manager e caricare il ROI salvato nel passaggio 5.1 facendo clic su Analizza | Strumenti | Responsabile ROI. In Gestione ROI, fai clic su Altro, quindi su Apri dall'elenco visualizzato e seleziona il ROI salvato.
    6. Misurare l'intensità di fluorescenza di cinque regioni casuali in una singola cella selezionando il ROI salvato dal gestore del ROI e spostare il ROI in una posizione casuale all'interno di una cella (Figura 3E). Misurare l'intensità della fluorescenza premendo M. Ripetere questo passaggio con altre quattro aree non sovrapposte. Quando viene visualizzata una finestra di dialogo con l'area e i valori di grigio medi (Figura 3F), copiare e incollare i valori in un foglio di calcolo per l'analisi.
      1. Esperimento TMRE : selezionare l'immagine (c = 2).
      2. Esperimento MitoSOX : selezionare l'immagine (c = 2).
    7. Ottenere i valori medi di intensità di fluorescenza. Utilizzando un software per fogli di calcolo (vedere Tabella dei materiali), calcolare la media dei cinque valori di grigio medi. Ripetere questo processo per ogni cella.
    8. Analizzare e confrontare i valori di grigio medi TMRE o MitoSOX in condizioni sperimentali utilizzando un programma software statistico (vedi Tabella dei materiali; Figura 4 e Figura 5). Presenta i dati come grafici a barre o diagrammi di violino.

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Representative Results

In questo protocollo, la quantificazione basata sulla fluorescenza è stata utilizzata per misurare il potenziale di membrana e i livelli di superossido della rete mitocondriale dopo il trattamento con CCCP (Figura 1). Questo flusso di lavoro ha utilizzato cellule HeLa, una linea cellulare immortalizzata derivata dal cancro cervicale. Le cellule HeLa sono abitualmente utilizzate per studiare la biologia mitocondriale e sono relativamente piatte, rendendo facile visualizzare la rete mitocondriale utilizzando la microscopia. Per studiare il ruolo del Parkin nel mantenimento della salute della rete mitocondriale, le cellule HeLa sono state trasfettate transitoriamente con un vettore di controllo vuoto, ParkinWT o ParkinT240R (un mutante che interrompe la mitofagia)21. Le cellule HeLa sono state placcate in piastre di imaging con fondo di vetro da 35 mm e sono state trasfettate una volta raggiunta la confluenza ~ 50% -60% (Figura 1A). Poiché le cellule HeLa si dividono rapidamente, questo è in genere il giorno dopo aver placcato le cellule nelle piastre di imaging. Un microscopio ottico è stato utilizzato per osservare il segnale di fluorescenza YFP il giorno seguente per valutare l'efficienza della trasfezione. Gli esperimenti sono stati eseguiti solo dopo una trasfezione riuscita.

Dopo l'ispezione, le cellule HeLa sono state trattate con concentrazioni lievi (5 μM) o gravi (20 μM) di CCCP per depolarizzare la rete mitocondriale (il punto 1.2 mostra istruzioni dettagliate per la preparazione di CCCP e sonde fluorescenti). Il trattamento CCCP è stato eseguito per un totale di 2 ore. Durante gli ultimi 30 minuti del trattamento con CCCP, i mitocondri sono stati marcati con MitoTracker e TMRE/MitoSOX (Figura 1A). Va notato che TMRE e MitoSOX hanno spettri di fluorescenza sovrapposti e non possono essere utilizzati contemporaneamente. Invece, abbiamo usato parabole di imaging separate per gli esperimenti TMRE e MitoSOX. Per gli esperimenti TMRE, le cellule HeLa erano immediatamente pronte per l'immagine alla fine del trattamento CCCP di 2 ore. La concentrazione di TMRE deve rimanere costante; pertanto, TMRE è rimasto nei media HeLa. Tuttavia, MitoSOX libero deve essere rimosso prima di eseguire l'imaging. Per gli esperimenti MitoSOX, le cellule sono state lavate tre volte con mezzi HeLa per rimuovere il colorante libero. Per questa fase, è essenziale utilizzare mezzi HeLa contenenti la stessa concentrazione di DMSO o CCCP delle condizioni sperimentali. Hoechst 33342, un marcatore nucleico, è stato inizialmente utilizzato per valutare le cellule HeLa dopo la trasfezione transitoria e il trattamento CCCP (Figura 1B).

Successivamente, è stata eseguita la microscopia confocale per visualizzare le intensità di fluorescenza TMRE e MitoSOX, per misurare rispettivamente il potenziale di membrana mitocondriale e i livelli di superossido. Le immagini sono state acquisite utilizzando un obiettivo di immersione in olio 63x (1,4 NA) con parametri di scansione bidirezionale, una risoluzione spaziale di 1.024 x 1.024 pixel, una velocità di scansione di 600 Hz, una media di linea di 3, una fase di 22,61 e un fattore di zoom di 1,5 (Figura 2C). La piastra di controllo DMSO è stata ripresa per prima per tutti gli esperimenti per impostare i valori di guadagno e intensità per TMRE e MitoSOX. Per effettuare confronti quantitativi tra le condizioni, questi valori devono essere impostati nella condizione DMSO e rimanere costanti per tutto l'esperimento. Il CCCP induce la depolarizzazione mitocondriale e una perdita di potenziale di membrana, con conseguente riduzione dell'intensità della fluorescenza TMRE. Pertanto, gli esperimenti di controllo hanno avuto la più alta intensità TMRE e i valori di guadagno e intensità sono stati impostati vicino alla saturazione. Al contrario, livelli più elevati di superossido aumentano l'intensità di MitoSOX. Pertanto, il controllo aveva la più bassa intensità di fluorescenza MitoSOX e i valori di guadagno e intensità erano bassi dove era presente un segnale debole. Poiché MitoTracker, TMRE e MitoSOX sono coloranti vitali ed etichettano tutte le cellule, non dovrebbero essere utilizzati quando si selezionano le cellule da visualizzare. Invece, le cellule sono state selezionate in base al segnale YFP per garantire che fossero trasfettate. Sono state acquisite immagini a piano singolo, concentrandosi sul fondo della cellula HeLa, dove si trovava una grande popolazione di mitocondri.

Quantificazione dell'intensità di fluorescenza TMRE e MitoSOX
La quantificazione delle intensità di fluorescenza TMRE e MitoSOX è stata analizzata utilizzando ImageJ (Figura 3). Un ROI di 6 micron x 6 micron è stato creato e archiviato nel gestore del ROI. Il ROI è stato collocato in cinque regioni casuali non sovrapposte di ciascuna cellula per misurare l'intensità TMRE o MitoSOX. L'intensità della fluorescenza corrisponde al valore medio di grigio in ImageJ. I cinque valori di intensità sono stati mediati per ogni cella per calcolare l'intensità media di fluorescenza per cellula. Questi valori sono stati tracciati e analizzati per la significatività statistica tra le condizioni di trattamento.

I risultati per le intensità di fluorescenza TMRE e MitoSOX sono mostrati rispettivamente nella Figura 4 e nella Figura 5. Come previsto, il trattamento con il noto agente disaccoppiante CCCP ha ridotto l'intensità della fluorescenza TMRE rispetto alle condizioni di controllo (Figura 4A,B). Inoltre, il trattamento CCCP severo (20 μM) ha indotto la produzione di superossido e aumentato l'intensità della fluorescenza MitoSOX (Figura 5A,B). In condizioni di stress CCCP lieve (5 μM), l'espressione di ParkinWT e ParkinT240R ha determinato una maggiore intensità di TMRE rispetto al vettore di controllo YFP vuoto. Allo stesso modo, l'intensità di MitoSOX era inferiore nelle cellule che esprimevano ParkinWT e ParkinT240R rispetto alle cellule che esprimevano il vettore di controllo YFP (Figura 5A,B). Questi risultati suggeriscono che l'espressione di Parkin aiuta a mantenere la salute della rete mitocondriale preservando potenziali di membrana mitocondriale più elevati e bassi livelli di superossido. Pertanto, il protocollo qui delineato può essere utilizzato per confrontare accuratamente l'intensità della fluorescenza per analizzare il ruolo del Parkin nel controllo del potenziale della membrana mitocondriale e della formazione di superossido.

Figure 1
Figura 1: Flusso di lavoro sperimentale. (A) Schema del flusso di lavoro sperimentale utilizzato per trasfettare, trattare con CCCP ed etichettare la rete dei mitocondri e l'intensità della fluorescenza TMRE e MitoSOX nelle cellule HeLa. (B) Immagini rappresentative di cellule che esprimono un vettore YFP vuoto (in alto), YFP-ParkinWT (al centro) e YFP-ParkinT240R (in basso; magenta). Hoechst 33342 (bianco) è usato per etichettare il DNA. Barra della scala = 10 μm. Abbreviazioni: CCCP = cianuro di carbonile m-clorofenil idrazone; TMRE = tetrametilrodiammina-estere etilestere-perclorato; YFP = proteina fluorescente gialla. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figure 2
Figura 2: L'interfaccia utente per impostare le impostazioni di acquisizione confocale . (A) Finestra di dialogo Impostazioni laser. Il rettangolo rosso evidenzia il laser a luce bianca, lo stato di potenza, la potenza del laser e le lunghezze d'onda. (B) Canale sperimentale impostato per un esperimento MitoSOX. Le impostazioni, le linee di eccitazione e le finestre degli spettri di emissione sono mostrate per YFP, MitoSOX e MitoTracker. (C) Le impostazioni di acquisizione mostrano il formato, la velocità, la bidirezionalità, la fase X, il fattore di zoom e la media delle linee. (D) Un'immagine acquisita rappresentativa. Le cellule HeLa esprimono YFP (magenta) e i mitocondri sono etichettati con MitoSOX (verde) e MitoTracker (ciano). Barra della scala = 10 μm. Abbreviazioni: WLL = laser a luce bianca; YFP = proteina fluorescente gialla. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figure 3
Figura 3: Flusso di lavoro ImageJ per quantificare le intensità di fluorescenza TMRE e MitoSOX . (A) Il pannello di gestione del ROI con un ROI di esempio in ImageJ. (B) Pannello delle opzioni di importazione dei bioformati. Il rettangolo rosso evidenzia l'opzione Dividi canali da selezionare. (C) Parametri delle impostazioni di luminosità e contrasto. (D) Impostare il parametro di misura. I rettangoli rossi evidenziano le opzioni Area e Valore medio grigio da selezionare. (E) Immagine rappresentativa di una cellula HeLa marcata con MitoSOX. Il quadrato rosso illustra il ROI del pannello A. Barra di scala = 10 μm. (F) Pannello dei risultati che mostra l'area sperimentale e i valori di grigio medi dei ROI. Il valore medio di grigio (arancione) rappresenta i valori di intensità della fluorescenza. Abbreviazioni: TMRE = tetrametilrhodamina-estere etilestere-perclorato; ROI = regione di interesse. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figure 4
Figura 4: Intensità di fluorescenza TMRE dopo danno mitocondriale. (A) Immagini rappresentative delle cellule HeLa dopo un trattamento di 2 ore con DMSO, 5 μM CCCP o 20 μM CCCP per indurre danni mitocondriali. Le cellule esprimono esogenamente un vettore YFP vuoto, YFP-ParkinWT o YFP-ParkinT240R (magenta) ed etichettate con MitoTracker (ciano) e TMRE (verde). Barra di scala = 30 μm. (B) Quantificazione dell'intensità di fluorescenza TMRE per cellule che esprimono vettore YFP vuoto (blu), YFP-ParkinWT (arancione) e YFP-ParkinT240R (viola) in condizioni trattate con DMSO e CCCP. p < 0,0001 mediante ANOVA bidirezionale con un test di confronto multiplo. (C-E) La quantificazione delle intensità di fluorescenza TMRE dal pannello B è separata per evidenziare le differenze in DMSO (C), 5 μM CCCP (D) e 20 μM CCCP (E). * p < 0,05; p < 0,001; p < 0,0001 di Kruskal-Wallis ANOVA con il test di confronto multiplo di Dunn. Ns = non significativo. Media ± SEM; n= 79-104 da tre repliche biologiche indipendenti. Abbreviazioni: CCCP = cianuro di carbonile m-clorofenil idrazone; TMRE = tetrametilrodiammina-estere etilestere-perclorato; YFP = proteina fluorescente gialla; DMSO = dimetilsolfossido. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figure 5
Figura 5: Intensità di fluorescenza MitoSOX a seguito di danni alla rete mitocondriale. (A) Immagini rappresentative di cellule HeLa trattate per 2 ore con DMSO, CCCP da 5 μM o CCCP da 20 μM per disaccoppiare il potenziale di membrana dei mitocondri. Le cellule sono state trasfettate con vettore YFP vuoto, YFP-ParkinWT o YFP-ParkinT240R (magenta) ed etichettate con MitoTracker (ciano) e MitoSOX (verde). Barra di scala = 30 μm. (B) Quantificazione dell'intensità di fluorescenza MitoSOX per cellule che esprimono vettore YFP vuoto (blu), YFP-ParkinWT (arancione) e YFP-ParkinT240R (viola) per condizioni di controllo e trattate. p < 0,0001 con ANOVA bidirezionale con il test di confronto multiplo di Dunn. (C-E) La quantificazione delle intensità di fluorescenza MitoSOX dal pannello B è separata per evidenziare le differenze in DMSO (C), 5 μM CCCP (D) e 20 μM CCCP (E). *p < 0,05; p < 0,0001 di Kruskal-Wallis ANOVA con il test di confronto multiplo di Dunn. Ns = non significativo. Media ± SEM; n = 87-107 da tre repliche biologiche indipendenti. Abbreviazioni: CCCP = cianuro di carbonile m-clorofenil idrazone; TMRE = tetrametilrodiammina-estere etilestere-perclorato; YFP = proteina fluorescente gialla; DMSO = dimetilsolfossido. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

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Discussion

Il flusso di lavoro qui descritto può essere utilizzato per quantificare il potenziale della membrana mitocondriale e i livelli di superossido in modo robusto e riproducibile utilizzando l'imaging basato sulla fluorescenza30. Ci sono importanti limitazioni tecniche da considerare quando si progettano questi esperimenti. Le cellule HeLa sono state trasfettate con un vettore YFP vuoto, YFP-ParkinWT o YFP-ParkinT240R. Il vettore YFP vuoto è stato utilizzato come controllo per confermare che i risultati sperimentali erano specifici per Parkin. Per la trasfezione transitoria, è stato determinato sperimentalmente un rapporto di massa di 1:3 per il DNA al reagente di trasfezione per produrre il più alto tasso di trasfezione, dove sono stati utilizzati 2 μg di DNA plasmidico per ciascun costrutto28. Mantenere il tag YFP coerente per tutti i costrutti era importante, poiché le proteine fluorescenti differiscono nella luminosità innata31,32. Se devono essere utilizzati più tag proteici fluorescenti, è necessario selezionare proteine fluorescenti con luminosità e fotostabilità simili33.

Per misurare il potenziale della membrana mitocondriale e i livelli di superossido, sono stati selezionati due coloranti ben documentati. Il segnale di fluorescenza della TMRE si basa sul potenziale di membrana mitocondriale, mentre l'intensità della fluorescenza MitoSOX è una funzione dei livelli di superossido. Per l'imaging basato sulla fluorescenza, non dovrebbe esserci sovrapposizione spettrale tra le sonde fluorescenti. Tuttavia, il protocollo iniziale è stato eseguito utilizzando mCherry-ParkinWT e mCherry-ParkinT240R, che si sovrapponevano agli spettri spostati verso il rosso di TMRE e MitoSOX. Per evitare sovrapposizioni spettrali e ridurre al minimo la potenziale diafonia, sono stati selezionati costrutti Parkin con tag YFP. Questa regolazione ha reso necessario modificare il colorante MitoTracker da verde a rosso lontano. Inoltre, la densità di placcatura cellulare HeLa è stata ottimizzata; inizialmente, le cellule HeLa sono state placcate a 45.000 cellule per capsula di imaging, ma ciò ha comportato piatti troppo confluenti. Un'elevata confluenza cellulare può ridurre l'efficienza della trasfezione, promuovere la morte cellulare e alterare il metabolismo cellulare34,35,36. Per evitare questi potenziali impatti, le cellule sono state placcate a una densità di 30.000 cellule per capsula di imaging.

La limitazione principale di questo protocollo è il potenziale pregiudizio dell'utente, in particolare quando si selezionano le celle e le posizioni ROI. Il protocollo utilizza i cambiamenti nelle intensità di fluorescenza TMRE e MitoSOX come lettura funzionale per il potenziale di membrana e i livelli di superossido. Pertanto, la selezione cellulare utilizzando queste sonde potrebbe potenzialmente influenzare i risultati sperimentali. Per combattere questo pregiudizio, abbiamo scelto cellule basate esclusivamente sull'espressione YFP. I ROI non sovrapposti sono stati selezionati casualmente attraverso la rete mitocondriale all'interno della cellula. Sebbene questo metodo sia stato precedentemente utilizzato per misurare l'intensità della fluorescenza27, è stato possibile adottare ulteriori misure di riduzione della distorsione. In primo luogo, lo studio potrebbe essere in cieco utilizzando gli strumenti di analisi cieca in ImageJ per impedire la selezione del ROI che supporta i risultati attesi. In secondo luogo, le intensità di fluorescenza potrebbero essere misurate utilizzando un software avanzato di analisi delle immagini che elimina la necessità di ROI.

Mentre questo protocollo utilizza la microscopia confocale per la quantificazione basata sulla fluorescenza, metodi aggiuntivi, come la citometria a flusso, potrebbero essere utilizzati per quantificare i cambiamenti di fluorescenza in TMRE e MitoSOX37. Qui, abbiamo usato la microscopia confocale piuttosto che la citometria a flusso per visualizzare la morfologia della rete mitocondriale. Il protocollo delineato potrebbe essere facilmente adattato per misurare la fluorescenza TMRE e MitoSOX con citometria a flusso che produce risultati sperimentali simili. Inoltre, i saggi del tasso di consumo di ossigeno (OCR) potrebbero essere utilizzati per rilevare i cambiamenti nella funzione della catena di trasporto degli elettroni mitocondriali senza coloranti cationici. Mentre l'OCR fornisce una misura sensibile della disfunzione mitocondriale, non è specifico per il potenziale di membrana o la concentrazione di superossido, ma fornisce invece una misura globale della funzione mitocondriale38. Questi test potrebbero essere eseguiti in combinazione con esperimenti TMRE e MitoSOX per valutare la salute mitocondriale39.

Sebbene questo protocollo si concentri specificamente sull'effetto del disaccoppiatore mitocondriale CCCP40, potrebbero essere utilizzati reagenti dannosi con meccanismi alternativi. Ad esempio, l'antimicina A e l'oligomicina A sono inibitori della catena di trasporto degli elettroni comunemente usati per indurre danni mitocondriali attraverso la produzione di specie reattive dell'ossigeno (ROS)38. Mentre abbiamo misurato specificamente i livelli di superossido mitocondriale utilizzando MitoSOX, i ROS intracellulari potrebbero essere misurati utilizzando CellROX. Nelle cellule HeLa, era necessario sovraesprimere Parkin a causa della bassa espressione endogena. Studi futuri potrebbero osservare gli effetti dell'espressione di Parkin sulla salute della rete mitocondriale utilizzando sistemi di coltura cellulare che esprimono Parkin41 endogeno. Poiché i mitocondri sono regolatori critici del metabolismo energetico e dell'omeostasi cellulare, la disfunzione mitocondriale è associata a numerose malattie, tra cui il diabete42, il morbo di Alzheimer 43,44,45, il cancro 46 e la malattia epatica 47. Pertanto, questo flusso di lavoro potrebbe essere adattato per studiare la salute mitocondriale e la disregolazione in linee cellulari rilevanti e colture primarie.

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Disclosures

Gli autori non hanno interessi concorrenti da dichiarare.

Acknowledgments

Ringraziamo i membri del laboratorio Evans per il loro attento feedback su questo manoscritto. Questo lavoro è supportato da Duke Whitehead Scholars, Duke Science and Technology Scholars e Howard Hughes Medical Institute (HHMI) Hanna Gray Fellowship. La Figura 1A è stata realizzata utilizzando BioRender.com.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Chemicals, Peptides, and Recombinant Proteins
CCCP (carbonyl cyanide m-chlorophenyl hydrazone)  Sigma-Aldrich C2759
DMEM (1x) with 4.5 g/L glucose Gibco 11-965-084
DMSO, Anhydrous ThermoFisher Scientific D12345
Fetal Bovine Serum Hyclone SH3007103
FuGENE 6 (Tranfection Reagent) Promega E2691
GlutaMAX 100x (L-Glutamine Solution)  Gibco  35-050-061
Hoescht 33342 ThermoFisher Scientific 62249
MitoSOX  Red  ThermoFisher Scientific M36008
MitoTracker Deep Red ThermoFisher Scientific M7514
Opti-MEM (Redued Serum media) ThermoFisher scientific 31985070
Tetramethylrhodamine, Ethyl Ester, Perchlorate (TMRE)  ThermoFisher Scientific T669
Experimental models: Organisms/Strains
HeLa-M (Homo sapiens) A. Peden (Cambridge Institute for Medical Research) N/A
Recombinant DNA
EYFP Empty Vector N/A N/A
YFP-Parkin T240R This Paper Generated by site-directed mutagenesis from YFP-Parkin
YFP-Parkin WT Addgene; PMID:19029340 RRID:Addgene_23955
Software and Algorithms
Adobe Illustrator Adobe Inc. https://www.adobe.com/products/illustrator (Schindelin, 2012)
Excel (Spreadsheet Software) Microsoft Office  https://www.microsoft.com/en-us/microsoft-365/excel
ImageJ https://imagej.net/software/fiji/
Leica Application Suite (LAS X) Leica https://www.leica-microsystems.com/products/microscope-software/p/leica-las-x-ls/
Microsoft Excel Microsoft Office https://www.microsoft.com/excel
Prism9 (Statistical Analysis Software) GraphPad Software https://www.graphpad.com
Other
35 mm Dish, No. 1.5 Coverslip, 20 mm Glass Diameter, Uncoated MatTek P35G-1.5-20-C
Cage Incubator (Environmental Chamber) Okolab https://www.oko-lab.com/cage-incubator
DMiL Inverted Microscope Leica N/A
LIGHTNING Deconvolution Software Leica N/A
STELLARIS 8 confocal microscope Leica N/A

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Biologia Numero 195 mitocondri mitofagia neurodegenerazione Parkin potenziale di membrana mitocondriale specie reattive dell'ossigeno superossido cellule HeLa microscopia confocale
Quantificazione basata sulla fluorescenza del potenziale di membrana mitocondriale e dei livelli di superossido utilizzando l'imaging dal vivo nelle cellule HeLa
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Fazli, M., Evans, C. S.More

Fazli, M., Evans, C. S. Fluorescence-Based Quantification of Mitochondrial Membrane Potential and Superoxide Levels Using Live Imaging in HeLa Cells. J. Vis. Exp. (195), e65304, doi:10.3791/65304 (2023).

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