Op fluorescentie gebaseerde kwantificering van mitochondriale membraanpotentiaal en superoxideniveaus met behulp van live beeldvorming in HeLa-cellen
Summary
Deze techniek beschrijft een effectieve workflow om mitochondriale membraanpotentiaal en superoxideniveaus in HeLa-cellen te visualiseren en kwantitatief te meten met behulp van op fluorescentie gebaseerde live beeldvorming.
Abstract
Mitochondriën zijn dynamische organellen die cruciaal zijn voor metabole homeostase door de energieproductie te regelen via ATP-synthese. Om het cellulaire metabolisme te ondersteunen, werken verschillende mitochondriale kwaliteitscontrolemechanismen samen om een gezond mitochondriaal netwerk te behouden. Een dergelijke route is mitofagie, waarbij PTEN-geïnduceerde kinase 1 (PINK1) en Parkin fosfo-ubiquitinatie van beschadigde mitochondriën autofagosoomsekwestratie en daaropvolgende verwijdering uit de cel via lysosoomfusie vergemakkelijken. Mitofagie is belangrijk voor cellulaire homeostase en mutaties in Parkin zijn gekoppeld aan de ziekte van Parkinson (PD). Vanwege deze bevindingen is er een aanzienlijke nadruk gelegd op het onderzoeken van mitochondriale schade en omzet om de moleculaire mechanismen en dynamiek van mitochondriale kwaliteitscontrole te begrijpen. Hier werd live-cell imaging gebruikt om het mitochondriale netwerk van HeLa-cellen te visualiseren, om het mitochondriale membraanpotentieel en superoxideniveaus te kwantificeren na behandeling met carbonylcyanide m-chlorophenyl hydrazone (CCCP), een mitochondriaal ontkoppelingsmiddel. Bovendien werd een PD-gebonden mutatie van Parkin (ParkinT240R) die Parkin-afhankelijke mitofagie remt, uitgedrukt om te bepalen hoe mutante expressie het mitochondriale netwerk beïnvloedt in vergelijking met cellen die wild-type Parkin tot expressie brengen. Het hier beschreven protocol beschrijft een eenvoudige workflow met behulp van fluorescentie-gebaseerde benaderingen om mitochondriale membraanpotentiaal en superoxideniveaus effectief te kwantificeren.
Introduction
Het mitochondriale netwerk is een reeks onderling verbonden organellen die een cruciale rol spelen bij energieproductie1, aangeboren immuniteit2,3 en celsignalering 4,5. Mitochondriale ontregeling is in verband gebracht met neurodegeneratieve ziekten zoals de ziekte van Parkinson (PD)6,7. PD is een progressieve neurodegeneratieve aandoening die dopaminerge neuronen van de substantia nigra aantast en die wereldwijd bijna 10 miljoen mensen treft8. PD is genetisch gekoppeld aan mitofagie, een mitochondriale kwaliteitscontroleroute die nodig is voor het handhaven van cellulaire homeostase die selectief beschadigde mitochondriën verwijdert 9,10. Studies hebben meerdere onafhankelijke mitofagieroutes geïdentificeerd, waaronder het FUN14-domein met 1 (FUNDC1) -gemedieerde mitofagie, Bcl-2 interagerende eiwit 3 (BNIP3) -gefaciliteerde mitofagie, NIX-afhankelijke mitofagie en de goed gekarakteriseerde PTEN-geïnduceerde kinase 1 (PINK1) / Parkin-gereguleerde mitofagie10,11. PINK1 (een vermeend kinase) en Parkin (een E3 ubiquitine ligase) werken samen met fosfo-ubiquitinaat beschadigde mitochondriën, die de vorming van autofagosomen aandrijft die het beschadigde organel overspoelen en fuseren met lysosomen om de afbraak te initiëren 12,13,14,15,16. Mutaties in Parkin zijn in verband gebracht met PD-gebonden fenotypes zoals neurodegeneratie via het verlies van dopaminerge neuronen17,18.
Hier wordt een protocol beschreven waarin HeLa-cellen, routinematig gebruikte onsterfelijke cellen afgeleid van baarmoederhalskanker, worden gebruikt om de rol van Parkin bij het handhaven van mitochondriale netwerkgezondheid te onderzoeken. HeLa-cellen drukken verwaarloosbare niveaus van endogene Parkin uit en vereisen daarom exogene Parkin-expressie19. Om de rol van Parkin in de gezondheid van mitochondriale netwerken te bestuderen, worden HeLa-cellen getransfecteerd met wild-type Parkin (ParkinWT), een Parkin-mutant (ParkinT240R) of een lege controlevector. ParkinT240R is een autosomaal recessieve juveniele parkinsonismemutatie die de Parkin E3-ligaseactiviteit beïnvloedt, waardoor de efficiëntie van de mitofagieroute aanzienlijk wordt verminderd20. HeLa-cellen zijn onderhevig aan milde (5 μM) of ernstige (20 μM) concentraties van carbonylcyanide m-chloorfenylhydrazon (CCCP), een mitochondriaal ontkoppelingsmiddel. Behandeling met ernstige concentraties CCCP wordt routinematig gebruikt om parkine-gemedieerde mitofagie te induceren in verschillende cellijnen, zoals HeLa- en COS-7-cellen21,22,23.
Na de behandeling maakt het protocol gebruik van live beeldvorming van het mitochondriale netwerk met behulp van twee momenteel beschikbare mitochondriale gerichte fluorescerende kleurstoffen. Tetramethylrhodamine, ethylester, perchloraat (TMRE) is een kationische kleurstof die fluoresceert op basis van mitochondriaal membraanpotentiaal24, terwijl MitoSOX een mitochondriale superoxide-indicator is waarbij de fluorescentie-intensiteit een functie is van superoxideconcentratie25. Ten slotte maakt het geschetste protocol gebruik van een op fluorescentie gebaseerde kwantificering en eenvoudige workflow om het mitochondriale membraanpotentiaal en superoxideniveaus effectief te kwantificeren met minimale ruimte voor gebruikersbias. Hoewel dit protocol is ontworpen om de mitochondriale functie in HeLa-cellen te bestuderen, kan het worden aangepast voor extra cellijnen en primaire celtypen om de mitochondriale netwerkgezondheid kwantitatief te karakteriseren.
Protocol
Representative Results
Discussion
De hier beschreven workflow kan worden gebruikt om mitochondriale membraanpotentiaal en superoxideniveaus robuust en reproduceerbaar te kwantificeren met behulp van op fluorescentie gebaseerde beeldvorming30. Er zijn belangrijke technische beperkingen waarmee rekening moet worden gehouden bij het ontwerpen van deze experimenten. HeLa-cellen werden getransfecteerd met een lege YFP-vector, YFP-ParkinWT of YFP-ParkinT240R. De lege YFP-vector werd gebruikt als een controle om te …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We danken de leden van het Evans-lab voor hun doordachte feedback op dit manuscript. Dit werk wordt ondersteund door Duke Whitehead Scholars, Duke Science and Technology Scholars en Howard Hughes Medical Institute (HHMI) Hanna Gray Fellowship. Figuur 1A is gemaakt met behulp van BioRender.com.
Materials
| Chemicals, Peptides, and Recombinant Proteins | |||
| CCCP (carbonyl cyanide m-chlorophenyl hydrazone) | Sigma-Aldrich | C2759 | |
| DMEM (1x) with 4.5 g/L glucose | Gibco | 11-965-084 | |
| DMSO, Anhydrous | ThermoFisher Scientific | D12345 | |
| Fetal Bovine Serum | Hyclone | SH3007103 | |
| FuGENE 6 (Tranfection Reagent) | Promega | E2691 | |
| GlutaMAX 100x (L-Glutamine Solution) | Gibco | 35-050-061 | |
| Hoescht 33342 | ThermoFisher Scientific | 62249 | |
| MitoSOX Red | ThermoFisher Scientific | M36008 | |
| MitoTracker Deep Red | ThermoFisher Scientific | M7514 | |
| Opti-MEM (Redued Serum media) | ThermoFisher scientific | 31985070 | |
| Tetramethylrhodamine, Ethyl Ester, Perchlorate (TMRE) | ThermoFisher Scientific | T669 | |
| Experimental models: Organisms/Strains | |||
| HeLa-M (Homo sapiens) | A. Peden (Cambridge Institute for Medical Research) | N/A | |
| Recombinant DNA | |||
| EYFP Empty Vector | N/A | N/A | |
| YFP-Parkin T240R | This Paper | Generated by site-directed mutagenesis from YFP-Parkin | |
| YFP-Parkin WT | Addgene; PMID:19029340 | RRID:Addgene_23955 | |
| Software and Algorithms | |||
| Adobe Illustrator | Adobe Inc. | https://www.adobe.com/products/illustrator | (Schindelin, 2012) |
| Excel (Spreadsheet Software) | Microsoft Office | https://www.microsoft.com/en-us/microsoft-365/excel | |
| ImageJ | https://imagej.net/software/fiji/ | ||
| Leica Application Suite (LAS X) | Leica | https://www.leica-microsystems.com/products/microscope-software/p/leica-las-x-ls/ | |
| Microsoft Excel | Microsoft Office | https://www.microsoft.com/excel | |
| Prism9 (Statistical Analysis Software) | GraphPad Software | https://www.graphpad.com | |
| Other | |||
| 35 mm Dish, No. 1.5 Coverslip, 20 mm Glass Diameter, Uncoated | MatTek | P35G-1.5-20-C | |
| Cage Incubator (Environmental Chamber) | Okolab | https://www.oko-lab.com/cage-incubator | |
| DMiL Inverted Microscope | Leica | N/A | |
| LIGHTNING Deconvolution Software | Leica | N/A | |
| STELLARIS 8 confocal microscope | Leica | N/A |
References
- Spinelli, J. B., Haigis, M. C. The multifaceted contributions of mitochondria to cellular metabolism. Nature Cell Biology. 20 (7), 745-754 (2018).
- West, A. P., Shadel, G. S., Ghosh, S. Mitochondria in innate immune responses. Nature Reviews. Immunology. 11 (6), 389-402 (2011).
- Seth, R. B., Sun, L., Ea, C. K., Chen, Z. J. Identification and characterization of MAVS, a mitochondrial antiviral signaling protein that activates NF-kappaB and IRF 3. Cell. 122 (5), 669-682 (2005).
- Tait, S. W. G., Green, D. R. Mitochondria and cell signalling. Journal of Cell Science. 125, 807-815 (2012).
- Antico Arciuch, V. G., Elguero, M. E., Poderoso, J. J., Carreras, M. C. Mitochondrial regulation of cell cycle and proliferation. Antioxidants and Redox Signaling. 16 (10), 1150-1180 (2012).
- Grunewald, A., Kumar, K. R., Sue, C. M. New insights into the complex role of mitochondria in Parkinson’s disease. Progress in Neurobiology. 177, 73-93 (2019).
- Borsche, M., Pereira, S. L., Klein, C., Grunewald, A. Mitochondria and Parkinson’s disease: clinical, molecular, and translational aspects. Journal of Parkinson’s Disease. 11 (1), 45-60 (2021).
- Ou, Z., et al. Global trends in the incidence, prevalence, and years lived with disability of Parkinson’s disease in 204 countries/territories from 1990 to 2019. Frontiers in Public Health. 9, 776847 (2021).
- Martinez-Vicente, M. Neuronal mitophagy in neurodegenerative diseases. Frontiers in Molecular Neuroscience. 10, 64 (2017).
- Youle, R. J., Narendra, D. P. Mechanisms of mitophagy. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 12 (1), 9-14 (2011).
- Villa, E., Marchetti, S., Ricci, J. E. No Parkin zone: mitophagy without Parkin. Trends in Cell Biology. 28 (11), 882-895 (2018).
- Geisler, S., et al. The PINK1/Parkin-mediated mitophagy is compromised by PD-associated mutations. Autophagy. 6 (7), 871-878 (2010).
- Kane, L. A., et al. PINK1 phosphorylates ubiquitin to activate Parkin E3 ubiquitin ligase activity. The Journal of Cell Biology. 205 (2), 143-153 (2014).
- Koyano, F., et al. Ubiquitin is phosphorylated by PINK1 to activate parkin. Nature. 510 (7503), 162-166 (2014).
- Ordureau, A., et al. Defining roles of PARKIN and ubiquitin phosphorylation by PINK1 in mitochondrial quality control using a ubiquitin replacement strategy. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (21), 6637-6642 (2015).
- Ordureau, A., et al. Quantitative proteomics reveal a feedforward mechanism for mitochondrial PARKIN translocation and ubiquitin chain synthesis. Molecular Cell. 56 (3), 360-375 (2014).
- Kitada, T., et al. Mutations in the parkin gene cause autosomal recessive juvenile parkinsonism. Nature. 392 (6676), 605-608 (1998).
- Valente, E. M., et al. PARK6 is a common cause of familial parkinsonism. Neurological Sciences. 23, S117-S118 (2002).
- Matsuda, N., et al. PINK1 stabilized by mitochondrial depolarization recruits Parkin to damaged mitochondria and activates latent Parkin for mitophagy. The Journal of Cell Biology. 189 (2), 211-221 (2010).
- Sriram, S. R., et al. Familial-associated mutations differentially disrupt the solubility, localization, binding and ubiquitination properties of parkin. Human Molecular Genetics. 14 (17), 2571-2586 (2005).
- Vives-Bauza, C., et al. PINK1-dependent recruitment of Parkin to mitochondria in mitophagy. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (1), 378-383 (2010).
- Wong, Y. C., Holzbaur, E. L. F. Optineurin is an autophagy receptor for damaged mitochondria in parkin-mediated mitophagy that is disrupted by an ALS-linked mutation. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (42), E4439-E4448 (2014).
- Bertolin, G., et al. Parkin maintains mitochondrial levels of the protective Parkinson’s disease-related enzyme 17-beta hydroxysteroid dehydrogenase type 10. Cell Death and Differentiation. 22 (10), 1563-1576 (2015).
- Crowley, L. C., Christensen, M. E., Waterhouse, N. J. Measuring mitochondrial transmembrane potential by TMRE staining. Cold Spring Harbor Protocols. 2016 (12), (2016).
- Kuznetsov, A. V., et al. Mitochondrial ROS production under cellular stress: comparison of different detection methods. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 400 (8), 2383-2390 (2011).
- Moore, A. S., Holzbaur, E. L. F. Dynamic recruitment and activation of ALS-associated TBK1 with its target optineurin are required for efficient mitophagy. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (24), E3349-E3358 (2016).
- Evans, C. S., Holzbaur, E. L. F. Degradation of engulfed mitochondria is rate-limiting in Optineurin-mediated mitophagy in neurons. eLife. 9, e50260 (2020).
- Jacobsen, L. B., Calvin, S. A., Colvin, K. E., Wright, M. FuGENE 6 Transfection Reagent: the gentle power. Methods. 33 (2), 104-112 (2004).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Mitra, K., Lippincott-Schwartz, J. Analysis of mitochondrial dynamics and functions using imaging approaches. Current Protocols in Cell Biology. , 1-21 (2010).
- Lin, H. C., Liu, S. Y., Lai, H. S., Lai, I. R. Isolated mitochondria infusion mitigates ischemia-reperfusion injury of the liver in rats. Shock. 39 (3), 304-310 (2013).
- Kholmukhamedov, A., Schwartz, J. M., Lemasters, J. J. Isolated mitochondria infusion mitigates ischemia-reperfusion injury of the liver in rats: mitotracker probes and mitochondrial membrane potential. Shock. 39 (6), 543 (2013).
- Thorn, K. Genetically encoded fluorescent tags. Molecular Biology of the Cell. 28 (7), 848-857 (2017).
- Pavel, M., et al. Contact inhibition controls cell survival and proliferation via YAP/TAZ-autophagy axis. Nature Communications. 9 (1), 2961 (2018).
- Rossignol, R., et al. Energy substrate modulates mitochondrial structure and oxidative capacity in cancer cells. Cancer Research. 64 (3), 985-993 (2004).
- Schornack, P. A., Gillies, R. J. Contributions of cell metabolism and H+ diffusion to the acidic pH of tumors. Neoplasia. 5 (2), 135-145 (2003).
- Christensen, M. E., Jansen, E. S., Sanchez, W., Waterhouse, N. J. Flow cytometry based assays for the measurement of apoptosis-associated mitochondrial membrane depolarisation and cytochrome c release. Methods. 61 (2), 138-145 (2013).
- Muller, B., et al. Application of extracellular flux analysis for determining mitochondrial function in mammalian oocytes and early embryos. Scientific Reports. 9 (1), 16778 (2019).
- Connolly, N. M. C., et al. Guidelines on experimental methods to assess mitochondrial dysfunction in cellular models of neurodegenerative diseases. Cell Death and Differentiation. 25 (3), 542-572 (2018).
- Demine, S., Renard, P., Arnould, T. Mitochondrial uncoupling: a key controller of biological processes in physiology and diseases. Cells. 8 (8), 795 (2019).
- Narendra, D., Tanaka, A., Suen, D. F., Youle, R. J. Parkin is recruited selectively to impaired mitochondria and promotes their autophagy. The Journal of Cell Biology. 183 (5), 795-803 (2008).
- Kwak, S. H., Park, K. S., Lee, K. U., Lee, H. K. Mitochondrial metabolism and diabetes. Journal of Diabetes Investigation. 1 (5), 161-169 (2010).
- Reddy, P. H. Role of mitochondria in neurodegenerative diseases: mitochondria as a therapeutic target in Alzheimer’s disease. CNS Spectrums. 14 (8), 8-13 (2009).
- Wang, W., Zhao, F., Ma, X., Perry, G., Zhu, X. Mitochondria dysfunction in the pathogenesis of Alzheimer’s disease: recent advances. Molecular Neurodegeneration. 15 (1), 30 (2020).
- Baloyannis, S. J. Mitochondrial alterations in Alzheimer’s disease. Journal of Alzheimer’s Disease. 9 (2), 119-126 (2006).
- Wallace, D. C. Mitochondria and cancer. Nature Reviews. Cancer. 12 (10), 685-698 (2012).
- Middleton, P., Vergis, N. Mitochondrial dysfunction and liver disease: role, relevance, and potential for therapeutic modulation. Therapeutic Advances in Gastroenterology. 14, 17562848211031394 (2021).
