JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biology

HeLa hücrelerinde canlı görüntüleme kullanılarak mitokondriyal membran potansiyelinin ve süperoksit seviyelerinin floresan bazlı ölçümü

Published: May 12, 2023
doi:
10.3791/65304
,
1Department of Cell Biology,Duke University Medical Center

Summary

Bu teknik, floresan tabanlı canlı görüntüleme kullanarak HeLa hücrelerindeki mitokondriyal membran potansiyelini ve süperoksit seviyelerini görselleştirmek ve nicel olarak ölçmek için etkili bir iş akışını tanımlar.

Abstract

Mitokondri, ATP sentezi yoluyla enerji üretimini kontrol ederek metabolik homeostaz için kritik öneme sahip dinamik organellerdir. Hücresel metabolizmayı desteklemek için, çeşitli mitokondriyal kalite kontrol mekanizmaları sağlıklı bir mitokondriyal ağı korumak için işbirliği yapar. Böyle bir yolak, PTEN’e bağlı kinaz 1 (PINK1) ve hasarlı mitokondrinin Parkin fosfo-ubikitinasyonunun otofagozom sekestrasyonunu ve daha sonra lizozom füzyonu yoluyla hücreden çıkarılmasını kolaylaştırdığı mitopajidir. Mitopaji, hücresel homeostaz için önemlidir ve Parkin’deki mutasyonlar Parkinson hastalığı (PD) ile bağlantılıdır. Bu bulgular nedeniyle, mitokondriyal kalite kontrolün moleküler mekanizmalarını ve dinamiklerini anlamak için mitokondriyal hasar ve cironun araştırılmasına önemli bir vurgu yapılmıştır. Burada, HeLa hücrelerinin mitokondriyal ağını görselleştirmek, mitokondriyal membran potansiyelini ve süperoksit seviyelerini ölçmek için canlı hücre görüntüleme, bir mitokondriyal ayrıştırıcı ajan olan karbonil siyanür m-klorofenil hidrazon (CCCP) ile tedaviyi takiben kullanıldı. Ek olarak, Parkin’e bağımlı mitopajiyi inhibe eden PD’ye bağlı bir Parkin mutasyonu (ParkinT240R), mutant ekspresyonun, vahşi tip Parkin’i eksprese eden hücrelere kıyasla mitokondriyal ağı nasıl etkilediğini belirlemek için ifade edildi. Burada özetlenen protokol, mitokondriyal membran potansiyelini ve süperoksit seviyelerini etkili bir şekilde ölçmek için floresan tabanlı yaklaşımlar kullanan basit bir iş akışını açıklamaktadır.

Introduction

Mitokondriyal ağ, enerji üretimi 1, doğuştan gelen bağışıklık2,3 ve hücre sinyalizasyonu 4,5’te çok önemli bir rol oynayan birbirine bağlı bir dizi organeldir. Mitokondriyal disregülasyon, Parkinson hastalığı (PD) gibi nörodejeneratif hastalıklarla ilişkilendirilmiştir6,7. PH, dünya çapında yaklaşık 10 milyon insanı etkileyen, substantia nigra’nın dopaminerjik nöronlarını etkileyen ilerleyici bir nörodejeneratif hastalıktır8. PD, genetik olarak, hasarlı mitokondri 9,10’u seçici olarak ortadan kaldıran hücresel homeostazı korumak için gerekli bir mitokondriyal kalite kontrol yolu olan mitopajiye bağlanmıştır. Çalışmalar, 1 (FUNDC1) aracılı mitopaji içeren FUN14 alanı, Bcl-2 etkileşimli protein 3 (BNIP3) kolaylaştırılmış mitopaji, NIX’e bağımlı mitofaji ve iyi karakterize edilmiş PTEN-indüklenmiş kinaz 1 (PINK1) / Parkin tarafından düzenlenen mitopaji10,11 dahil olmak üzere birçok bağımsız mitopaji yolu tanımlamıştır. PINK1 (varsayılan bir kinaz) ve Parkin (bir E3 ubikitin ligaz), fosfo-ubikitinat hasarlı mitokondri ile birlikte çalışır, bu da hasarlı organeli içine çeken otofagozomların oluşumunu yönlendirir ve 12,13,14,15,16 bozulmasını başlatmak için lizozomlarla kaynaşır. Parkin’deki mutasyonlar, dopaminerjik nöronların kaybı yoluyla nörodejenerasyon gibi PD’ye bağlı fenotiplerle ilişkilendirilmiştir17,18.

Burada, rutin olarak kullanılan HeLa hücrelerinin, rahim ağzı kanserinden türetilen ölümsüzleştirilmiş hücrelerin, Parkin’in mitokondriyal ağ sağlığını korumadaki rolünü araştırmak için kullanıldığı bir protokol açıklanmaktadır. HeLa hücreleri ihmal edilebilir seviyelerde endojen Parkin eksprese eder ve bu nedenle eksojen Parkin ekspresyonugerektirir 19. Parkin’in mitokondriyal ağ sağlığındaki rolünü incelemek için, HeLa hücreleri vahşi tip Parkin (ParkinWT), bir Parkin mutantı (ParkinT240R) veya boş bir kontrol vektörü ile transfekte edilir. ParkinT240R, Parkin E3 ligaz aktivitesini etkileyen, mitopaji yolu20’nin etkinliğini önemli ölçüde azaltan otozomal resesif geçişli bir juvenil parkinsonizm mutasyonudur. HeLa hücreleri, mitokondriyal ayrıştırıcı bir ajan olan hafif (5 μM) veya şiddetli (20 μM) karbonil siyanür m-klorofenil hidrazon (CCCP) konsantrasyonlarına maruz kalır. Şiddetli CCCP konsantrasyonları ile tedavi, HeLa ve COS-7 hücreleri21,22,23 gibi çeşitli hücre hatlarında Parkin aracılı mitopajiyi indüklemek için rutin olarak kullanılır.

Tedaviyi takiben, protokol şu anda mevcut olan iki mitokondriyal hedefli floresan boya kullanarak mitokondriyal ağın canlı görüntülemesini kullanır. Tetrametilrhodamin, etil ester, perklorat (TMRE), mitokondriyal membran potansiyeli24’e dayanan floresan katyonik bir boyadır, MitoSOX ise floresan yoğunluğunun süperoksit konsantrasyonu25’in bir fonksiyonu olduğu mitokondriyal bir süperoksit göstergesidir. Son olarak, özetlenen protokol, kullanıcı yanlılığı için minimum kapsamla mitokondriyal membran potansiyelini ve süperoksit seviyelerini etkili bir şekilde ölçmek için floresan tabanlı bir niceleme ve basit bir iş akışı kullanır. Bu protokol, HeLa hücrelerinde mitokondriyal fonksiyonu incelemek için tasarlanmış olmasına rağmen, mitokondriyal ağ sağlığını nicel olarak karakterize etmek için ek hücre hatları ve birincil hücre tipleri için uyarlanabilir.

Protocol

1. Biyolojik numunelerin hazırlanması NOT: Bir biyogüvenlik kabininde steril teknik kullanarak aşağıdaki adımları uygulayın. Kabinin yüzeyine ve tüm malzemelere% 70 etanol püskürtün. HeLa hücre kültürü ve transfeksiyonuDulbecco’nun modifiye kartal besiyerinde (DMEM) fetal sığır serumu ve %1 L-glutamin çözeltisi (HeLa media; bakınız Malzeme Tablosu) ile desteklenmiş 4.5 g/L glikoz içeren 30.000 HeLa hücresi kül…

Representative Results

Bu protokolde, CCCP tedavisini takiben mitokondriyal ağın membran potansiyelini ve süperoksit seviyelerini ölçmek için floresan bazlı niceleme kullanılmıştır (Şekil 1). Bu iş akışı, rahim ağzı kanserinden türetilen ölümsüzleştirilmiş bir hücre hattı olan HeLa hücrelerini kullandı. HeLa hücreleri mitokondriyal biyolojiyi incelemek için rutin olarak kullanılır ve nispeten düzdür, bu da mikroskopi kullanarak mitokondriyal ağı görselleştirmeyi kolaylaştır?…

Discussion

Burada özetlenen iş akışı, floresan bazlı görüntüleme30 kullanılarak mitokondriyal membran potansiyelini ve süperoksit seviyelerini sağlam ve tekrarlanabilir bir şekilde ölçmek için kullanılabilir. Bu deneyleri tasarlarken göz önünde bulundurulması gereken önemli teknik sınırlamalar vardır. HeLa hücreleri boş bir YFP vektörü, YFP-ParkinWT veya YFP-ParkinT240R ile transfekte edildi. Boş YFP vektörü, deneysel bulguların Parkin’e özgü olduğunu…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Evans laboratuvarı üyelerine bu makale hakkındaki düşünceli geri bildirimleri için teşekkür ederiz. Bu çalışma Duke Whitehead Scholars, Duke Science and Technology Scholars ve Howard Hughes Medical Institute (HHMI) Hanna Gray Fellowship tarafından desteklenmektedir. Şekil 1A , BioRender.com kullanılarak yapılmıştır.

Materials

Chemicals, Peptides, and Recombinant Proteins
CCCP (carbonyl cyanide m-chlorophenyl hydrazone)  Sigma-Aldrich C2759
DMEM (1x) with 4.5 g/L glucose Gibco 11-965-084
DMSO, Anhydrous ThermoFisher Scientific D12345
Fetal Bovine Serum Hyclone SH3007103
FuGENE 6 (Tranfection Reagent) Promega E2691
GlutaMAX 100x (L-Glutamine Solution)  Gibco  35-050-061
Hoescht 33342 ThermoFisher Scientific 62249
MitoSOX  Red  ThermoFisher Scientific M36008
MitoTracker Deep Red ThermoFisher Scientific M7514
Opti-MEM (Redued Serum media) ThermoFisher scientific 31985070
Tetramethylrhodamine, Ethyl Ester, Perchlorate (TMRE)  ThermoFisher Scientific T669
Experimental models: Organisms/Strains
HeLa-M (Homo sapiens) A. Peden (Cambridge Institute for Medical Research) N/A
Recombinant DNA
EYFP Empty Vector N/A N/A
YFP-Parkin T240R This Paper Generated by site-directed mutagenesis from YFP-Parkin
YFP-Parkin WT Addgene; PMID:19029340 RRID:Addgene_23955
Software and Algorithms
Adobe Illustrator Adobe Inc. https://www.adobe.com/products/illustrator (Schindelin, 2012)
Excel (Spreadsheet Software) Microsoft Office  https://www.microsoft.com/en-us/microsoft-365/excel
ImageJ https://imagej.net/software/fiji/
Leica Application Suite (LAS X) Leica https://www.leica-microsystems.com/products/microscope-software/p/leica-las-x-ls/
Microsoft Excel Microsoft Office https://www.microsoft.com/excel
Prism9 (Statistical Analysis Software) GraphPad Software https://www.graphpad.com
Other
35 mm Dish, No. 1.5 Coverslip, 20 mm Glass Diameter, Uncoated MatTek P35G-1.5-20-C
Cage Incubator (Environmental Chamber) Okolab https://www.oko-lab.com/cage-incubator
DMiL Inverted Microscope Leica N/A
LIGHTNING Deconvolution Software Leica N/A
STELLARIS 8 confocal microscope Leica N/A
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Spinelli, J. B., Haigis, M. C. The multifaceted contributions of mitochondria to cellular metabolism. Nature Cell Biology. 20 (7), 745-754 (2018).
  2. West, A. P., Shadel, G. S., Ghosh, S. Mitochondria in innate immune responses. Nature Reviews. Immunology. 11 (6), 389-402 (2011).
  3. Seth, R. B., Sun, L., Ea, C. K., Chen, Z. J. Identification and characterization of MAVS, a mitochondrial antiviral signaling protein that activates NF-kappaB and IRF 3. Cell. 122 (5), 669-682 (2005).
  4. Tait, S. W. G., Green, D. R. Mitochondria and cell signalling. Journal of Cell Science. 125, 807-815 (2012).
  5. Antico Arciuch, V. G., Elguero, M. E., Poderoso, J. J., Carreras, M. C. Mitochondrial regulation of cell cycle and proliferation. Antioxidants and Redox Signaling. 16 (10), 1150-1180 (2012).
  6. Grunewald, A., Kumar, K. R., Sue, C. M. New insights into the complex role of mitochondria in Parkinson’s disease. Progress in Neurobiology. 177, 73-93 (2019).
  7. Borsche, M., Pereira, S. L., Klein, C., Grunewald, A. Mitochondria and Parkinson’s disease: clinical, molecular, and translational aspects. Journal of Parkinson’s Disease. 11 (1), 45-60 (2021).
  8. Ou, Z., et al. Global trends in the incidence, prevalence, and years lived with disability of Parkinson’s disease in 204 countries/territories from 1990 to 2019. Frontiers in Public Health. 9, 776847 (2021).
  9. Martinez-Vicente, M. Neuronal mitophagy in neurodegenerative diseases. Frontiers in Molecular Neuroscience. 10, 64 (2017).
  10. Youle, R. J., Narendra, D. P. Mechanisms of mitophagy. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 12 (1), 9-14 (2011).
  11. Villa, E., Marchetti, S., Ricci, J. E. No Parkin zone: mitophagy without Parkin. Trends in Cell Biology. 28 (11), 882-895 (2018).
  12. Geisler, S., et al. The PINK1/Parkin-mediated mitophagy is compromised by PD-associated mutations. Autophagy. 6 (7), 871-878 (2010).
  13. Kane, L. A., et al. PINK1 phosphorylates ubiquitin to activate Parkin E3 ubiquitin ligase activity. The Journal of Cell Biology. 205 (2), 143-153 (2014).
  14. Koyano, F., et al. Ubiquitin is phosphorylated by PINK1 to activate parkin. Nature. 510 (7503), 162-166 (2014).
  15. Ordureau, A., et al. Defining roles of PARKIN and ubiquitin phosphorylation by PINK1 in mitochondrial quality control using a ubiquitin replacement strategy. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (21), 6637-6642 (2015).
  16. Ordureau, A., et al. Quantitative proteomics reveal a feedforward mechanism for mitochondrial PARKIN translocation and ubiquitin chain synthesis. Molecular Cell. 56 (3), 360-375 (2014).
  17. Kitada, T., et al. Mutations in the parkin gene cause autosomal recessive juvenile parkinsonism. Nature. 392 (6676), 605-608 (1998).
  18. Valente, E. M., et al. PARK6 is a common cause of familial parkinsonism. Neurological Sciences. 23, S117-S118 (2002).
  19. Matsuda, N., et al. PINK1 stabilized by mitochondrial depolarization recruits Parkin to damaged mitochondria and activates latent Parkin for mitophagy. The Journal of Cell Biology. 189 (2), 211-221 (2010).
  20. Sriram, S. R., et al. Familial-associated mutations differentially disrupt the solubility, localization, binding and ubiquitination properties of parkin. Human Molecular Genetics. 14 (17), 2571-2586 (2005).
  21. Vives-Bauza, C., et al. PINK1-dependent recruitment of Parkin to mitochondria in mitophagy. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (1), 378-383 (2010).
  22. Wong, Y. C., Holzbaur, E. L. F. Optineurin is an autophagy receptor for damaged mitochondria in parkin-mediated mitophagy that is disrupted by an ALS-linked mutation. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (42), E4439-E4448 (2014).
  23. Bertolin, G., et al. Parkin maintains mitochondrial levels of the protective Parkinson’s disease-related enzyme 17-beta hydroxysteroid dehydrogenase type 10. Cell Death and Differentiation. 22 (10), 1563-1576 (2015).
  24. Crowley, L. C., Christensen, M. E., Waterhouse, N. J. Measuring mitochondrial transmembrane potential by TMRE staining. Cold Spring Harbor Protocols. 2016 (12), (2016).
  25. Kuznetsov, A. V., et al. Mitochondrial ROS production under cellular stress: comparison of different detection methods. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 400 (8), 2383-2390 (2011).
  26. Moore, A. S., Holzbaur, E. L. F. Dynamic recruitment and activation of ALS-associated TBK1 with its target optineurin are required for efficient mitophagy. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (24), E3349-E3358 (2016).
  27. Evans, C. S., Holzbaur, E. L. F. Degradation of engulfed mitochondria is rate-limiting in Optineurin-mediated mitophagy in neurons. eLife. 9, e50260 (2020).
  28. Jacobsen, L. B., Calvin, S. A., Colvin, K. E., Wright, M. FuGENE 6 Transfection Reagent: the gentle power. Methods. 33 (2), 104-112 (2004).
  29. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  30. Mitra, K., Lippincott-Schwartz, J. Analysis of mitochondrial dynamics and functions using imaging approaches. Current Protocols in Cell Biology. , 1-21 (2010).
  31. Lin, H. C., Liu, S. Y., Lai, H. S., Lai, I. R. Isolated mitochondria infusion mitigates ischemia-reperfusion injury of the liver in rats. Shock. 39 (3), 304-310 (2013).
  32. Kholmukhamedov, A., Schwartz, J. M., Lemasters, J. J. Isolated mitochondria infusion mitigates ischemia-reperfusion injury of the liver in rats: mitotracker probes and mitochondrial membrane potential. Shock. 39 (6), 543 (2013).
  33. Thorn, K. Genetically encoded fluorescent tags. Molecular Biology of the Cell. 28 (7), 848-857 (2017).
  34. Pavel, M., et al. Contact inhibition controls cell survival and proliferation via YAP/TAZ-autophagy axis. Nature Communications. 9 (1), 2961 (2018).
  35. Rossignol, R., et al. Energy substrate modulates mitochondrial structure and oxidative capacity in cancer cells. Cancer Research. 64 (3), 985-993 (2004).
  36. Schornack, P. A., Gillies, R. J. Contributions of cell metabolism and H+ diffusion to the acidic pH of tumors. Neoplasia. 5 (2), 135-145 (2003).
  37. Christensen, M. E., Jansen, E. S., Sanchez, W., Waterhouse, N. J. Flow cytometry based assays for the measurement of apoptosis-associated mitochondrial membrane depolarisation and cytochrome c release. Methods. 61 (2), 138-145 (2013).
  38. Muller, B., et al. Application of extracellular flux analysis for determining mitochondrial function in mammalian oocytes and early embryos. Scientific Reports. 9 (1), 16778 (2019).
  39. Connolly, N. M. C., et al. Guidelines on experimental methods to assess mitochondrial dysfunction in cellular models of neurodegenerative diseases. Cell Death and Differentiation. 25 (3), 542-572 (2018).
  40. Demine, S., Renard, P., Arnould, T. Mitochondrial uncoupling: a key controller of biological processes in physiology and diseases. Cells. 8 (8), 795 (2019).
  41. Narendra, D., Tanaka, A., Suen, D. F., Youle, R. J. Parkin is recruited selectively to impaired mitochondria and promotes their autophagy. The Journal of Cell Biology. 183 (5), 795-803 (2008).
  42. Kwak, S. H., Park, K. S., Lee, K. U., Lee, H. K. Mitochondrial metabolism and diabetes. Journal of Diabetes Investigation. 1 (5), 161-169 (2010).
  43. Reddy, P. H. Role of mitochondria in neurodegenerative diseases: mitochondria as a therapeutic target in Alzheimer’s disease. CNS Spectrums. 14 (8), 8-13 (2009).
  44. Wang, W., Zhao, F., Ma, X., Perry, G., Zhu, X. Mitochondria dysfunction in the pathogenesis of Alzheimer’s disease: recent advances. Molecular Neurodegeneration. 15 (1), 30 (2020).
  45. Baloyannis, S. J. Mitochondrial alterations in Alzheimer’s disease. Journal of Alzheimer’s Disease. 9 (2), 119-126 (2006).
  46. Wallace, D. C. Mitochondria and cancer. Nature Reviews. Cancer. 12 (10), 685-698 (2012).
  47. Middleton, P., Vergis, N. Mitochondrial dysfunction and liver disease: role, relevance, and potential for therapeutic modulation. Therapeutic Advances in Gastroenterology. 14, 17562848211031394 (2021).

Tags

Keywords: Mitochondrial Membrane PotentialSuperoxide LevelsLive ImagingHeLa CellsNeurodegenerative DiseasesParkinson’s DiseaseALSSTEDSIMExpansion MicroscopyMitophagyPINK1ParkinMitochondrial Quality ControlATP SynthesisCCCPParkin T240R Mutation
check_url/65304?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Fazli, M., Evans, C. S. Fluorescence-Based Quantification of Mitochondrial Membrane Potential and Superoxide Levels Using Live Imaging in HeLa Cells. J. Vis. Exp. (195), e65304, doi:10.3791/65304 (2023).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image