Summary
이 기술은 형광 기반 라이브 이미징을 사용하여 HeLa 세포 내의 미토콘드리아 막 전위와 과산화물 수준을 시각화하고 정량적으로 측정하는 효과적인 워크플로우를 설명합니다.
Abstract
미토콘드리아는 ATP 합성을 통해 에너지 생산을 조절하여 대사 항상성에 중요한 동적 세포 기관입니다. 세포 대사를 지원하기 위해 다양한 미토콘드리아 품질 관리 메커니즘이 협력하여 건강한 미토콘드리아 네트워크를 유지합니다. 그러한 경로 중 하나는 손상된 미토콘드리아의 PTEN 유도 키나아제 1(PINK1) 및 파킨 포스포-유비퀴틴화가 리소좀 융합을 통해 세포에서 자가포식소 격리 및 후속 제거를 촉진하는 미토파지입니다. 유사분열은 세포 항상성에 중요하며 파킨의 돌연변이는 파킨슨병(PD)과 관련이 있습니다. 이러한 발견으로 인해 미토콘드리아 품질 관리의 분자 메커니즘과 역학을 이해하기 위해 미토콘드리아 손상 및 회전율을 조사하는 데 상당한 중점을 두었습니다. 여기에서 라이브 셀 이미징을 사용하여 HeLa 세포의 미토콘드리아 네트워크를 시각화하고 미토콘드리아 분리제인 카르보닐 시안화물 m-클로로페닐 히드라존(CCCP)으로 처리한 후 미토콘드리아 막 전위 및 슈퍼옥사이드 수준을 정량화했습니다. 또한, 파킨 의존성 미토파지를 억제하는 파킨의 PD 연관 돌연변이(ParkinT240R)를 발현하여 돌연변이 발현이 야생형 파킨을 발현하는 세포와 비교하여 미토콘드리아 네트워크에 어떤 영향을 미치는지 확인했습니다. 여기에 요약된 프로토콜은 미토콘드리아 막 전위와 과산화물 수준을 효과적으로 정량화하기 위해 형광 기반 접근 방식을 사용하는 간단한 워크플로를 설명합니다.
Introduction
미토콘드리아 네트워크는 에너지 생산1, 선천면역2,3, 세포신호전달4,5에 중요한 역할을 하는 일련의 상호 연결된 세포기관이다. 미토콘드리아 조절 장애는 파킨슨병(PD)과 같은 신경퇴행성 질환과 관련이 있습니다6,7. PD는 전 세계적으로 거의 1,000만 명에게 영향을 미치는 흑질의 도파민성 뉴런에 영향을 미치는 진행성 신경퇴행성 장애입니다8. PD는 손상된 미토콘드리아를 선택적으로 제거하는 세포 항상성을 유지하는 데 필요한 미토콘드리아 품질 관리 경로인 미토파지와 유전적으로 연결되어 있습니다 9,10. 연구에 따르면 FUN14 도메인 포함 1(FUNDC1) 매개 미토파지, Bcl-2 상호 작용 단백질 3(BNIP3) 촉진 미토파지, NIX 의존성 미토파지 및 잘 특성화된 PTEN 유도 키나아제 1(PINK1)/파킨 조절 미토파지10,11. PINK1(추정 키나아제)과 파킨(E3 유비퀴틴 리가아제)은 손상된 포스포-유비퀴티네이트 손상된 미토콘드리아와 함께 작용하여 손상된 세포 소기관을 삼키고 리소좀과 융합하여 분해를 시작하는 자가포식소체의 형성을 유도합니다 12,13,14,15,16. Parkin의 돌연변이는 도파민성 뉴런의 손실을 통한 신경변성과 같은 PD 관련 표현형과 관련이 있습니다17,18.
여기에서는 자궁경부암에서 유래한 불멸화 세포인 HeLa 세포를 사용하여 미토콘드리아 네트워크 건강을 유지하는 데 있어 Parkin의 역할을 조사하는 프로토콜이 설명되어 있습니다. HeLa 세포는 무시할 수 있는 수준의 내인성 파킨을 발현하므로 외인성 파킨 발현이 필요하다19. 미토콘드리아 네트워크 건강에서 파킨의 역할을 연구하기 위해 HeLa 세포를 야생형 파킨(ParkinWT), 파킨 돌연변이(ParkinT240R) 또는 빈 대조군 벡터로 형질감염시킵니다. ParkinT240R은 Parkin E3 ligase 활성에 영향을 미치는 상염색체 열성 소아 파킨슨증 돌연변이로, 미토파지 경로20의 효율성을 크게 감소시킵니다. HeLa 세포는 미토콘드리아 분리제인 카르보닐 시안화물 m-클로로페닐 히드라존(CCCP)의 경증(5μM) 또는 중증(20μM) 농도에 노출됩니다. 중증 농도의 CCCP를 이용한 치료는 다양한 세포주, 예컨대 HeLa 및 COS-7 세포에서 파킨 매개 미토파지를 유도하기 위해 일상적으로 사용된다21,22,23.
치료 후 이 프로토콜은 현재 사용 가능한 두 가지 미토콘드리아 표적 형광 염료를 사용하여 미토콘드리아 네트워크의 라이브 이미징을 사용합니다. 테트라메틸로다민, 에틸 에스테르, 과염소산염(TMRE)은 미토콘드리아 막 전위24를 기반으로 형광을 발하는 양이온성 염료이며, MitoSOX는 형광 강도가 과산화물 농도25의 함수인 미토콘드리아 과산화물 지표입니다. 마지막으로, 요약된 프로토콜은 형광 기반 정량화와 간단한 워크플로우를 사용하여 사용자 편향을 최소화하면서 미토콘드리아 막 전위와 과산화물 수준을 효과적으로 정량화합니다. 이 프로토콜은 HeLa 세포에서 미토콘드리아 기능을 연구하기 위해 설계되었지만 미토콘드리아 네트워크 건강을 정량적으로 특성화하기 위해 추가 세포주 및 일차 세포 유형에 적용할 수 있습니다.
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Protocol
1. 생물학적 시료의 제조
알림: 생물 안전 캐비닛에서 멸균 기술을 사용하여 다음 단계를 수행하십시오. 캐비닛 표면과 모든 재료에 70% 에탄올을 뿌립니다.
- HeLa 세포 배양 및 형질주입
- 10% 소 태아 혈청과 1% L-글루타민 용액이 보충된 4.5g/L 포도당을 함유하는 Dulbecco's modified eagle medium(DMEM)에서 30,000개의 HeLa 세포를 배양합니다(HeLa media; 표 참조). 2mL의 예열된 HeLa 배지가 들어 있는 35mm 유리 바닥 이미징 접시(T able of Materials 참조)에 세포를 플레이트합니다. HeLa 배양물을 5%CO2 및 37°C에서유지한다 26,27.
- 도금 다음 날 광학 현미경을 사용하여 35mm 이미징 접시를 검사하여 셀이 ~50%-60% 합류하는지 확인합니다. 일단 합류하면 빈 노란색 형광 단백질(YFP) 벡터, YFP-ParkinWT 또는 YFP-ParkinT240R 로 HeLa 세포를 transfection합니다(그림 1A).
- 각 형질감염을 위해 멸균 미세 원심분리 튜브에 두 개의 개별 혼합물을 준비합니다. 튜브를 두드리거나 위아래로 부드럽게 피펫팅하여 혼합합니다.
- 튜브 1에서 200 μL의 환원된 혈청 배지( 재료 표 참조)와 2 μg의 플라스미드 DNA를 혼합합니다.
- 튜브 2에서 200 μL의 환원된 혈청 배지와 6 μL의 형질주입 시약을 혼합합니다( 재료 표 참조)28.
- 실온(RT)에서 5분 동안 튜브를 배양합니다. 튜브 2를 튜브 1에 넣고 위아래로 피펫팅하여 혼합하고 RT에서 20분 동안 배양합니다.
- 형질주입 복합체를 HeLa 세포 배양물이 포함된 기존 이미징 접시에 적하하여 전체 접시에 균등하게 분포되도록 합니다. 이미징 디쉬를 5%CO2 및 37°C 인큐베이터에 밤새 넣는다.
참고: 각 접시에 적절한 형질주입된 플라스미드로 라벨을 붙입니다. 각 실험에 대해 3개의 YFP-ParkinWT 접시(디메틸 설폭사이드[DMSO; 재료 표 참조], 5μM CCCP 및 20μM CCCP)에 라벨을 붙입니다. 3개의 YFP-ParkinT240R 접시와 3개의 빈 YFP 벡터 접시로 라벨링을 반복합니다.
- CCCP 및 형광 염료의 제조
주의 : 형광 염료는 종종 빛에 민감합니다. 빛에 대한 노출을 줄이기 위해 알루미늄 호일이나 갈색 원심분리기 튜브를 사용하여 염료를 어두운 곳에 보관하십시오.- 5mg의 CCCP를 4.89mL의 DMSO에 용해시켜 5mM의 CCCP 작업 스톡을 만듭니다( 재료 표 참조). 5mg의 CCCP를 1.22mL의 DMSO에 용해시켜 20mM의 CCCP 작업 재고를 만듭니다.
- 10μL의 1mM MitoTracker Deep Red( 재료 표 참조) 원액을 390μL의 DMSO에 희석하여 25μM의 작업 스톡을 만듭니다.
- 50 μg의 MitoSOX Red25 ( 재료 표 참조)를 13 μL의 DMSO에 용해시켜 5 mM 작업 스톡을 만듭니다.
- 10mg의 TMRE24 ( 재료 표 참조)를 19.4mL의 DMSO에 용해시켜 1mM 원액을 만듭니다. 10μL의 DMSO에 1mM TMRE 10μL를 첨가하여 TMRE를 희석하여 10μM 작업 스톡을 만듭니다.
2. HeLa 세포에서 형광 프로브를 사용한 CCCP 처리 및 미토콘드리아 표지
주의 : HeLa 세포가 장기간 인큐베이터에서 나오지 않도록 다음 단계를 신속하게 수행하십시오.
- 형질감염 다음 날, 5 또는 20 mM CCCP (최종 농도: 각각 5 μM 및 20 μM)의 2 μL를 각 실험 플레이트에 첨가한다. 컨트롤 플레이트의 경우 2μL의 DMSO를 추가합니다. 플레이트를 5%CO2 및 37°C 인큐베이터에서 1.5시간 동안 복귀시킨다(도 1A).
참고: CCCP 치료는 총 2시간 동안입니다. 그러나 미토콘드리아는 CCCP 처리의 마지막 30분 동안 형광 프로브로 표지됩니다. - 1.5 시간 후, 인큐베이터에서 플레이트를 제거하고 이미징 접시에 형광 프로브를 추가합니다. 플레이트를 30분 동안 5%CO2 및 37°C 인큐베이터로 되돌린다(도 1A).
- TMRE 실험: 25μM MitoTracker(최종 농도: 25nM) 2μL와 10μM TMRE(최종 농도: 10nM) 2μL를 추가합니다.
- MitoSOX 실험: 25μM MitoTracker(최종 농도: 25nM) 2μL와 5mM MitoSOX(최종 농도: 2.5μM) 1μL를 추가합니다.
- 2시간 CCCP 처리 후 이미징을 위해 HeLa 세포를 준비합니다(그림 1A, B).
- TMRE 실험: HeLa 세포는 즉시 이미지화할 준비가 됩니다. TMRE가 HeLa 세포 배양 배지에 남아 있는지 확인합니다.
- MitoSOX 실험: 예열된 HeLa 배지 2mL로 세포를 3배 세척하여 유리 MitoSOX 염료를 제거합니다. 예열 매체 2mL를 추가합니다. 이제 HeLa 세포를 이미지화할 준비가 되었습니다.
참고: 실험 조건과 동일한 DMSO 또는 CCCP 농도를 포함하는 신선하고 예열된 HeLa 배지로 HeLa 세포를 세척합니다. MitoSOX 또는 MitoTracker는 포함하지 마십시오.
3. 컨포칼 현미경 이미지 획득 설정
참고: 63x/1.40 개구수(NA) 오일 이멀젼 대물렌즈와 환경 챔버(재료 표 참조)가 장착된 컨포칼 현미경(재료 표 참조)을 사용하여 HeLa 세포를 이미지화합니다.
- 이미징 1시간 전에 탱크 밸브를 열어 CO2를 켭니다. On 버튼을 눌러 현미경의 환경 컨트롤러를 켭니다. 터치패드의 위쪽 및 아래쪽 화살표를 사용하여 온도를 37°C로 조정하고 CO2를 5%로 조정합니다. 완료되면 설정을 누릅니다.
알림: 환경 챔버의 문이 닫혀 있는지 확인하고 조건이 안정될 때까지 기다립니다. - 레이저 설정
- 백색광 레이저(WLL)를 켜고 레이저 출력을 85%로 설정하고 여자 제어를 최대 출력으로 설정합니다. 획득(Acquire) 탭을 클릭하고 레이저 추가(Add Laser)를 선택한 다음 표시되는 대화 상자에서 WLL을 켜기로 전환합니다. 레이저 출력 버튼을 클릭하고 85%를 입력합니다. Excitation Control(여기 제어) 버튼을 클릭하고 드롭다운 메뉴에서 Maximum Power(최대 전력)를 선택합니다(그림 2A).
- TMRE 실험: YFP, MitoTracker 및 TMRE에 대한 여기 및 방출 스펙트럼을 설정합니다.
- YFP의 경우 여기 레이저를 514nm로 설정하고 방출 스펙트럼 창을 524-545nm로 설정합니다. Acquire(획득) 탭에서 Add New Setting(새 설정 추가) 버튼을 클릭합니다. 그런 다음 레이저 추가를 클릭하고 설정 1로 드래그합니다. 여기선(Excitation Line)을 두 번 클릭하고 대화 상자의 파장으로 514를 입력합니다. 해당 감지기를 두 번 클릭하고 시작 부분에 524를 입력하고 끝 파장에 545를 입력합니다.
- MitoTracker Deep Red의 경우 여기 레이저를 641로 설정하고 방출 스펙트럼 창을 650-750nm로 설정합니다. 획득(Acquire) 탭에서 레이저 추가(Add Laser) 버튼을 클릭하고 설정 1로 드래그합니다. 여기선(Excitation Line)을 두 번 클릭하고 대화 상자의 파장으로 641을 입력합니다. 해당 감지기를 두 번 클릭하고 시작 파장에 650, 끝 파장에 750을 입력합니다.
- TMRE의 경우 여기 레이저를 555nm로 설정하고 방출 스펙트럼 창을 557-643nm로 설정합니다. Acquire(획득) 탭에서 Add New Setting(새 설정 추가) 버튼을 클릭합니다. 그런 다음 레이저 추가 버튼을 클릭하고 설정 2로 드래그합니다. 여기선(Excitation Line)을 두 번 클릭하고 대화 상자에 파장으로 555를 입력합니다. 해당 감지기를 두 번 클릭하고 시작 파장에 557, 끝 파장에 643을 입력합니다.
- MitoSOX 실험: YFP, MitoTracker 및 MitoSOX에 대한 여기 및 방출 스펙트럼을 설정합니다(그림 2B).
- YFP의 경우 여기 레이저를 507nm로 설정하고 방출 스펙트럼 창을 517-540nm로 설정합니다. Acquire(획득) 탭에서 Add New Setting(새 설정 추가) 버튼을 클릭합니다. 그런 다음 레이저 추가 버튼을 클릭하고 설정 1로 드래그합니다. 여기선(Excitation Line)을 두 번 클릭하고 대화 상자에서 파장으로 507을 입력합니다. 해당 감지기를 두 번 클릭하고 시작 부분에 517을 입력하고 끝 파장에 540을 입력합니다.
- MitoSOX의 경우 여기 레이저를 547nm로 설정하고 방출 스펙트럼 창을 564-636nm로 설정합니다. Acquire(획득) 탭에서 Add New Setting(새 설정 추가) 버튼을 클릭합니다. 그런 다음 레이저 추가 버튼을 클릭하고 설정 2로 드래그합니다. 여기선(Excitation Line)을 두 번 클릭하고 대화 상자의 파장으로 547을 입력합니다. 해당 감지기를 두 번 클릭하고 시작 파장에 564, 끝 파장에 636을 입력합니다.
- MitoTracker Deep Red의 경우 여기 레이저를 641nm로 설정하고 방출 스펙트럼 창을 652-742nm로 설정합니다. Acquire(획득) 탭에서 Add New Setting(새 설정 추가) 버튼을 클릭합니다. 레이저 추가 버튼을 클릭하고 설정 3으로 드래그합니다. 여기선(Excitation Line)을 두 번 클릭하고 대화 상자의 파장으로 641을 입력합니다. 해당 감지기를 두 번 클릭하고 시작 부분에 652를 입력하고 끝 파장에 742를 입력합니다.
- 이미지 획득 설정(그림 2C)
- 형식을 1,024 x 1,024로, 스캔 속도를 600Hz로, 라인 평균을 3으로 설정합니다.
- 획득 탭을 선택하고 포맷 버튼을 클릭합니다. 드롭다운 메뉴에서 1,024 x 1,024를 선택합니다. 속도 버튼을 클릭하고 드롭다운 메뉴에서 600을 선택합니다. 그런 다음 Line Average 버튼을 클릭하고 드롭다운 메뉴에서 3을 선택합니다.
- 양방향 스캔을 켜고 위상 및 확대/축소 비율을 각각 22.61 및 1.50으로 설정합니다.
- 획득(Acquisition) 탭에서 양방향(Bidirectional) 버튼을 켜기(On)로 전환합니다. X 단계 설정을 클릭하고 22.61로 설정합니다. 확대/축소 계수 설정을 클릭하고 1.50으로 설정합니다.
- 형식을 1,024 x 1,024로, 스캔 속도를 600Hz로, 라인 평균을 3으로 설정합니다.
4. 이미지 획득
주의: 실험자는 YFP 형광 신호를 기반으로 세포를 선택하기 위해 시각적 판단을 내려야 합니다. 과포화된 픽셀은 형광 강도 정량화에 큰 영향을 미칠 수 있으므로 피하십시오. 채도가 높은 이미지를 획득하지 않도록 픽셀 채도를 나타내는 오버/언더 룩업 테이블을 사용합니다.
- 관심 설정을 클릭하고 Fast Live를 눌러 형광 이미지의 실시간 미리보기를 제공합니다.
- 해당 감지기를 두 번 클릭하여 게인과 강도를 조정합니다. 표시되는 대화 상자에서 슬라이더를 사용하여 게인을 조정합니다. 강도를 변경하려면 Excitation Line을 두 번 클릭하고 팝업 창에서 위쪽 및 아래쪽 화살표를 사용하여 강도를 변경합니다. 중지를 클릭하여 미리 보기를 종료합니다.
- TMRE 실험: 먼저 DMSO 제어판을 이미지화합니다. TMRE 신호의 게인과 강도를 조정(설정 2)하여 미토콘드리아 네트워크 강도가 포화 바로 아래에 있도록 합니다. 실험에 대한 게인과 강도를 일정하게 유지합니다. MitoTracker 및 YFP(설정 1)의 게인과 강도를 조정하여 미토콘드리아 네트워크가 보이지만 흐리게 보이도록 합니다.
- MitoSOX 실험: 먼저 DMSO 컨트롤 플레이트를 이미지화합니다. MitoSOX(설정 2) 신호의 게인과 강도를 조정하여 형광이 보이지만 희미해지도록 합니다. 실험에 대한 게인과 강도를 일정하게 유지합니다. YFP(설정 1)와 MitoTracker(설정 3)의 게인과 강도를 조정하여 미토콘드리아 네트워크가 보이지만 어두워지도록 합니다.
알림: TMRE와 MitoSOX의 이득과 강도는 실험 내내 일정하게 유지되어야 하므로 기록합니다. YFP 및 MitoTracker의 형광 신호는 이 프로토콜에서 정량화되지 않습니다. 따라서 각 이미지에 대해 게인과 강도를 조정할 수 있습니다. 세포가 세포 손상이나 광표백을 유발하는 과도한 레이저 강도에 노출되지 않도록 세포가 잘 보이지만 여전히 희미한 게인 및 강도 설정을 갖는 것이 가장 효과적입니다.
- 게인 및 강도 설정이 완료되면 시작을 클릭하여 이미지를 획득합니다. 실험 조건당 20개 세포의 이미지 획득(예: 이미지당 4개의 세포가 있는 5개의 이미지; 그림 2D).
5. ImageJ를 이용한 형광 강도 정량
참고: 이미징 파일은 ".lif"로 저장되며 ImageJ29와 호환됩니다. ImageJ와 호환되는 파일 형식은 해당 웹 사이트에 지정되어 있습니다. 호환되지 않는 경우 파일 형식을 변환해야 할 수 있습니다.
- 관심 영역(ROI)을 만들고 저장합니다.
- ImageJ에서 파일 | 새로 만들기 | 이미지. 표시되는 대화 상자에서 확인을 클릭합니다.
- 사각형 도구 버튼을 클릭하고 6미크론 x 6미크론 상자를 그립니다. Analyze(분석) | 도구 | ROI 관리자를 선택하고 ROI 관리자가 있는 대화 상자가 나타날 때까지 기다립니다(그림 3A). 관리자 대화 상자에서 추가를 클릭하여 관리자에 직사각형 ROI를 추가합니다. More(추가)를 선택하여 ROI를 저장한 다음 Save(저장) 버튼을 클릭하고 OK(확인)를 클릭합니다.
- 형광 강도를 측정합니다.
- 이미지 J에서 파일( File )을 클릭하고 열기(Open)를 선택합니다. 대화 상자에서 실험에 사용할 이미징 파일을 선택하고 열기를 클릭합니다.
- Bio-formats 가져오기 옵션 창이 나타날 때까지 기다립니다(그림 3B). 채널 분할을 선택하고 열기를 클릭합니다.
참고: 채널 분할 기능을 사용하면 이미지의 각 채널을 별도의 창으로 열 수 있습니다. 채널 순서는 획득 순서에 해당합니다.- TMRE 실험: YFP (설정 1)는 첫 번째 채널(c=0)입니다. MitoTracker (설정 1)는 두 번째 채널 (c = 1)입니다. TMRE(설정 2)는 세 번째 채널(c = 2)입니다.
- MitoSOX 실험: YFP (설정 1)는 첫 번째 채널(c=0)입니다. MitoSOX (설정 2)는 두 번째 채널(c = 1)입니다. MitoTracker (설정 3)는 세 번째 채널 (c = 2)입니다.
- Image | 조정 | 밝기(그림 3C).
참고: 이미지 밝기가 영구적으로 변경되지 않도록 설정 또는 적용을 누르지 마십시오. 때때로, 형광 강도는 TMRE 또는 MitoSOX 채널에서 보이지 않습니다. 더 쉽게 시각화할 수 있도록 밝기를 조정합니다. 밝기를 변경해도 원시 형광 강도 값에는 영향을 미치지 않습니다. - Analyze(분석)를 클릭하고 Set Measurements(측정 설정)를 선택합니다. Area(영역) 및 Mean gray(평균 회색) 값 상자를 선택하고 OK(확인)를 클릭합니다(그림 3D).
참고: 평균 회색 값은 형광 강도입니다. - ROI Manager를 열고 Analyze | 도구 | ROI 관리자. ROI 관리자에서 자세히를 클릭한 다음 표시되는 목록에서 열기를 클릭하고 저장된 ROI를 선택합니다.
- ROI 관리자에서 저장된 ROI를 선택하여 단일 셀에서 5개의 랜덤 영역의 형광 강도를 측정하고 ROI를 셀 내의 임의 위치로 이동합니다(그림 3E). M을 눌러 형광 강도를 측정합니다. 겹치지 않는 4개의 추가 영역을 사용하여 이 단계를 반복합니다. 영역 및 평균 회색 값이 있는 대화 상자가 나타나면(그림 3F) 분석을 위해 값을 복사하여 스프레드시트에 붙여넣습니다.
- TMRE 실험: 이미지를 선택합니다(c = 2).
- MitoSOX 실험: 이미지 선택(c = 2).
- 평균 형광 강도 값을 구합니다. 스프레드시트 소프트웨어( 재료 표 참조)를 사용하여 5개의 평균 회색 값의 평균을 구합니다. 각 셀에 대해 이 과정을 반복합니다.
- 통계 소프트웨어 프로그램을 사용하여 실험 조건에 걸쳐 TMRE 또는 MitoSOX 평균 회색 값을 분석하고 비교합니다( 재료 표 참조; 그림 4 및 그림 5). 데이터를 막대 그래프 또는 바이올린 플롯으로 표시합니다.
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Representative Results
이 프로토콜에서는 CCCP 처리 후 미토콘드리아 네트워크의 막 전위와 과산화물 수준을 측정하기 위해 형광 기반 정량화를 사용했습니다(그림 1). 이 워크플로우는 자궁경부암에서 추출한 불멸화 세포주인 HeLa 세포를 사용했습니다. HeLa 세포는 미토콘드리아 생물학을 연구하는 데 일상적으로 사용되며 비교적 평평하여 현미경을 사용하여 미토콘드리아 네트워크를 쉽게 시각화할 수 있습니다. 미토콘드리아 네트워크 건강을 유지하는 데 있어 Parkin의 역할을 조사하기 위해 HeLa 세포를 빈 대조군 벡터인 ParkinWT 또는 ParkinT240R (미토파지를 방해하는 돌연변이)21로 일시적으로 형질감염시켰습니다. HeLa 세포는 35mm 유리 바닥 이미징 접시에 도말하고 ~50%-60% 밀도에 도달하면 형질감염되었습니다(그림 1A). HeLa 세포는 빠르게 분열하기 때문에 일반적으로 세포를 이미징 접시에 도금한 다음 날입니다. 형질주입 효율을 평가하기 위해 다음 날 YFP 형광 신호를 관찰하기 위해 광학 현미경을 사용하였다. 실험은 성공적인 형질감염 후에만 수행되었습니다.
검사 후, HeLa 세포를 미토콘드리아 네트워크를 탈분극하기 위해 경증 (5 μM) 또는 중증 (20 μM) 농도의 CCCP로 처리 하였다 (단계 1.2는 CCCP 및 형광 프로브를 제조하기 위한 상세한 지침을 보여준다). CCCP 처리는 총 2시간 동안 수행되었습니다. CCCP 치료의 마지막 30분 동안 미토콘드리아는 MitoTracker 및 TMRE/MitoSOX로 표지되었습니다(그림 1A). TMRE와 MitoSOX는 형광 스펙트럼이 겹치며 동시에 사용할 수 없다는 점에 유의해야 합니다. 대신 TMRE 및 MitoSOX 실험을 위해 별도의 이미징 접시를 사용했습니다. TMRE 실험의 경우, HeLa 세포는 2시간 CCCP 처리가 끝날 때 즉시 이미지화할 준비가 되었습니다. TMRE 농도는 일정하게 유지되어야 합니다. 따라서 TMRE는 HeLa 미디어에 남아있었습니다. 그러나 이미징 전에 유리 MitoSOX를 제거해야 합니다. MitoSOX 실험을 위해, 세포를 HeLa 배지로 3회 세척하여 유리 염료를 제거하였다. 이 단계에서는 실험 조건과 동일한 DMSO 또는 CCCP 농도를 포함하는 HeLa 배지를 사용하는 것이 필수적입니다. 핵 마커인 Hoechst 33342는 처음에 일시적인 형질감염 및 CCCP 처리 후 HeLa 세포를 평가하는 데 사용되었습니다(그림 1B).
그 후, 공초점 현미경을 수행하여 TMRE 및 MitoSOX 형광 강도를 시각화하고 미토콘드리아 막 전위와 과산화물 수준을 각각 측정했습니다. 이미지는 양방향 스캐닝 매개변수, 1,024 x 1,024 픽셀의 공간 해상도, 600Hz의 스캔 속도, 3의 라인 평균, 22.61의 위상 및 1.5의 줌 계수를 가진 63x(1.4NA) 오일 이멀젼 대물렌즈를 사용하여 획득되었습니다(그림 2C). DMSO 대조군은 TMRE 및 MitoSOX에 대한 이득 및 강도 값을 설정하기 위해 모든 실험에 대해 먼저 이미지화되었습니다. 조건 간에 정량적 비교를 수행하려면 이러한 값을 DMSO 조건에서 설정하고 실험 내내 일정하게 유지해야 합니다. CCCP는 미토콘드리아 탈분극 및 막 전위 손실을 유도하여 TMRE 형광 강도를 감소시킵니다. 따라서 대조 실험은 TMRE 강도가 가장 높았고 이득 및 강도 값은 포화에 가깝게 설정되었습니다. 대조적으로, 과산화물 수치가 높을수록 MitoSOX 강도가 증가합니다. 따라서 대조군은 MitoSOX 형광 강도가 가장 낮았고 희미한 신호가 있는 경우 이득 및 강도 값을 낮게 설정했습니다. MitoTracker, TMRE 및 MitoSOX는 필수 염료이며 모든 세포에 라벨을 붙이기 때문에 이미지화할 세포를 선택할 때 사용해서는 안 됩니다. 대신, 세포가 형질감염되었는지 확인하기 위해 YFP 신호에 기초하여 세포를 선택하였다. 많은 양의 미토콘드리아가 위치한 HeLa 세포의 바닥에 초점을 맞춘 단일 평면 이미지를 획득했습니다.
TMRE 및 MitoSOX 형광 강도 정량화
TMRE 및 MitoSOX 형광 강도의 정량화는 ImageJ를 사용하여 분석되었습니다(그림 3). 6 미크론 x 6 미크론 ROI가 생성되어 ROI 관리자에 저장되었습니다. ROI는 TMRE 또는 MitoSOX 강도를 측정하기 위해 각 세포의 5개의 무작위 비중첩 영역에 배치되었습니다. 형광 강도는 ImageJ의 평균 회색 값에 해당합니다. 세포당 평균 형광 강도를 계산하기 위해 각 세포에 대해 5개의 강도 값을 평균화하였다. 이 값은 치료 조건 전반에 걸쳐 통계적 유의성에 대해 플롯 및 분석되었습니다.
TMRE 및 MitoSOX 형광 강도에 대한 결과를 각각 도 4 및 도 5에 나타내었다. 예상대로 알려진 비커플링제 CCCP로 처리하면 대조군 조건에 비해 TMRE 형광 강도가 감소했습니다(그림 4A, B). 또한, 중증(20μM) CCCP 처리는 과산화물 생성을 유도하고 MitoSOX 형광 강도를 증가시켰습니다(그림 5A, B). 경미한(5μM) CCCP 스트레스 조건에서 ParkinWT 및 ParkinT240R 의 발현은 빈 YFP 대조군 벡터에 비해 더 높은 TMRE 강도를 초래했습니다. 유사하게, MitoSOX 강도는 YFP 대조군 벡터를 발현하는 세포에 비해 ParkinWT 및 ParkinT240R 을 발현하는 세포에서 더 낮았습니다(그림 5A, B). 이러한 결과는 파킨 발현이 더 높은 미토콘드리아 막 전위와 낮은 과산화물 수준을 보존함으로써 미토콘드리아 네트워크 건강을 유지하는 데 도움이 된다는 것을 시사합니다. 따라서 여기에 설명된 프로토콜은 형광 강도를 정확하게 비교하여 미토콘드리아 막 전위와 과산화물 형성을 제어하는 데 있어 Parkin의 역할을 분석하는 데 사용할 수 있습니다.
그림 1: 실험 워크플로. (A) 형질주입, CCCP로 치료, 미토콘드리아 네트워크 표지, HeLa 세포의 TMRE 및 MitoSOX 형광 강도 이미지 이미지에 사용되는 실험 워크플로의 개략도. (B) 빈 YFP 벡터(위), YFP-ParkinWT(가운데) 및 YFP-ParkinT240R(아래, 자홍색)을 발현하는 세포의 대표 이미지. Hoechst 33342(흰색)는 DNA를 표시하는 데 사용됩니다. 스케일 바 = 10 μm. 약어: CCCP = 카르보닐 시안화물 m-클로로페닐 히드라존; TMRE = 테트라메틸로다민-에틸 에스테르-과염소산염; YFP = 노란색 형광 단백질. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 공초점 획득 설정을 위한 사용자 인터페이스 . (A) 레이저 설정 대화 상자. 빨간색 직사각형은 백색광 레이저, 전력 상태, 레이저 전력 및 파장을 강조 표시합니다. (B) MitoSOX 실험을 위해 설정된 실험 채널. 설정, 여기선 및 방출 스펙트럼 창은 YFP, MitoSOX 및 MitoTracker에 대해 표시됩니다. (C) 획득 설정에는 형식, 속도, 양방향성, 위상 X, 확대/축소 계수 및 라인 평균이 표시됩니다. (D) 대표 획득 이미지. HeLa 세포는 YFP(자홍색)를 발현하고 미토콘드리아는 MitoSOX(녹색) 및 MitoTracker(청록색)로 표지됩니다. 스케일 바 = 10 μm. 약어: WLL = 백색광 레이저; YFP = 노란색 형광 단백질. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: TMRE 및 MitoSOX 형광 강도를 정량화하기 위한 ImageJ 워크플로우. (A) ImageJ의 ROI 예제가 있는 ROI 관리자 패널. (B) Bio-formats 가져오기 옵션 패널. 빨간색 사각형은 선택해야 하는 채널 분할 옵션을 강조 표시합니다. (C) 밝기 및 대비 설정 매개변수. (D) 측정 매개변수를 설정합니다. 빨간색 사각형은 선택해야 하는 영역 및 평균 회색 값 옵션을 강조 표시합니다. (E) MitoSOX로 표지된 HeLa 세포의 대표 이미지. 빨간색 사각형은 패널 A의 ROI를 보여줍니다. 스케일 바 = 10 μm. (F) ROI의 실험 영역과 평균 회색 값을 보여주는 결과 패널. 평균 회색 값(주황색)은 형광 강도 값을 나타낸다. 약어: TMRE = 테트라메틸로다민-에틸 에스테르-과염소산염; ROI = 관심 영역. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 미토콘드리아 손상 후 TMRE 형광 강도. (A) 미토콘드리아 손상을 유도하기 위해 DMSO, 5μM CCCP 또는 20μM CCCP로 2시간 처리한 후 HeLa 세포의 대표 이미지. 세포는 빈 YFP 벡터, YFP-ParkinWT 또는 YFP-ParkinT240R(자홍색)을 외인성으로 발현하고 MitoTracker(청록색) 및 TMRE(녹색)로 표지됩니다. 스케일 바 = 30 μm. (B) DMSO 및 CCCP 처리 조건에서 빈 YFP 벡터(파란색), YFP-ParkinWT(주황색) 및 YFP-ParkinT240R(보라색)을 발현하는 세포에 대한 TMRE 형광 강도의 정량화. 다중 비교 검정을 통한 이원 ANOVA에 의한 p < 0.0001. (C-E) 패널 B에서 TMRE 형광 강도의 정량화는 DMSO (C), 5 μM CCCP (D) 및 20 μM CCCP (E)의 차이를 강조하기 위해 분리됩니다. * p < 0.05; p < 0.001; p < 0.0001 Kruskal-Wallis ANOVA와 Dunn의 다중 비교 검정. Ns = 유의하지 않음. 평균 ± SEM; n= 79-104 3개의 독립적인 생물학적 복제물에서. 약어: CCCP = 카르보닐 시안화물 m-클로로페닐 히드라존; TMRE = 테트라메틸로다민-에틸 에스테르-과염소산염; YFP = 황색 형광 단백질; DMSO = 디메틸 설폭사이드. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 미토콘드리아 네트워크 손상에 따른 MitoSOX 형광 강도. (A) 미토콘드리아 막 전위를 분리하기 위해 DMSO, 5μM CCCP 또는 20μM CCCP로 2시간 동안 처리된 HeLa 세포의 대표 이미지. 세포를 빈 YFP 벡터, YFP-Parkin WT, 또는 YFP-ParkinT240R (마젠타색)로 형질감염시키고, MitoTracker (청록색) 및 MitoSOX (녹색)로 표지하였다. 스케일 바 = 30 μm. (B) 대조군 및 처리 조건에 대해 빈 YFP 벡터(파란색), YFP-ParkinWT(주황색) 및 YFP-ParkinT240R(보라색)을 발현하는 세포에 대한 MitoSOX 형광 강도 정량화. Dunn의 다중 비교 검정을 사용한 이원 분산 분석에 의한 p < 0.0001. (C-E) 패널 B에서 MitoSOX 형광 강도의 정량화는 DMSO(C), 5μM CCCP(D) 및 20μM CCCP(E)의 차이를 강조하기 위해 분리됩니다. *p < 0.05; Dunn의 다중 비교 검정을 사용한 Kruskal-Wallis ANOVA의 p < 0.0001. Ns = 유의하지 않음. 평균 ± SEM; n = 87-107 3개의 독립적인 생물학적 복제물에서. 약어: CCCP = 카르보닐 시안화물 m-클로로페닐 히드라존; TMRE = 테트라메틸로다민-에틸 에스테르-과염소산염; YFP = 황색 형광 단백질; DMSO = 디메틸 설폭사이드. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
여기에 요약된 워크플로우는 형광 기반 이미징을 사용하여 미토콘드리아 막 전위와 슈퍼옥사이드 수준을 강력하고 재현성 있게 정량화하는 데 사용할 수 있습니다(30). 이러한 실험을 설계할 때 고려해야 할 중요한 기술적 제한 사항이 있습니다. HeLa 세포를 빈 YFP 벡터, YFP-ParkinWT, 또는 YFP-ParkinT240R로 형질감염시켰다. 실험 결과가 파킨에 특이적인지 확인하기 위해 빈 YFP 벡터를 대조군으로 사용했습니다. 일시적 형질감염의 경우, DNA 대 형질주입 시약에 대한 1:3의 질량비를 실험적으로 측정하여 가장 높은 형질주입률을 산출하였고, 여기서 2 μg의 플라스미드 DNA를 각각의 구축물28에 사용하였다. 형광 단백질이 선천적 밝기가 다르기 때문에 모든 구축물에 대해 YFP-태그를 일관되게 유지하는 것이 중요했습니다31,32. 여러 개의 형광 단백질 태그를 사용해야 하는 경우, 유사한 밝기와 광안정성을 가진 형광 단백질을 선택해야 한다33.
미토콘드리아 막 전위와 과산화물 수준을 측정하기 위해 잘 문서화 된 두 가지 염료가 선택되었습니다. TMRE의 형광 신호는 미토콘드리아 막 전위를 기반으로 하는 반면, MitoSOX 형광 강도는 과산화물 수준의 함수입니다. 형광 기반 이미징의 경우 형광 프로브 사이에 스펙트럼 겹침이 없어야 합니다. 그러나 초기 프로토콜은 mCherry-ParkinWT 및 mCherry-ParkinT240R을 사용하여 수행되었으며, 이는 TMRE 및 MitoSOX의 적색 편이 스펙트럼과 겹칩니다. 스펙트럼 중첩을 피하고 잠재적인 누화를 최소화하기 위해 YFP 태그가 부착된 Parkin 구조체를 선택했습니다. 이 조정으로 인해 MitoTracker 염료를 녹색에서 원적외선으로 변경해야 했습니다. 또한, HeLa 세포 도금 밀도가 최적화되었습니다. 처음에 HeLa 세포는 이미징 접시당 45,000개의 세포로 도말되었지만 이로 인해 과융합 접시가 발생했습니다. 높은 세포 밀도는 형질주입 효율을 감소시키고, 세포 사멸을 촉진하며, 세포 대사를 변화시킬 수 있다34,35,36. 이러한 잠재적 영향을 피하기 위해, 세포를 이미징 접시 당 30,000 세포의 밀도로 도말하였다.
이 프로토콜의 주요 제한 사항은 특히 셀 및 ROI 위치를 선택할 때 사용자 편향의 가능성입니다. 이 프로토콜은 TMRE 및 MitoSOX 형광 강도의 변화를 멤브레인 전위 및 과산화물 수준에 대한 기능적 판독값으로 사용합니다. 따라서 이러한 프로브를 사용한 세포 선택은 잠재적으로 실험 결과를 편향시킬 수 있습니다. 이러한 편향을 방지하기 위해 우리는 YFP 발현만을 기반으로 세포를 선택했습니다. 겹치지 않는 ROI는 세포 내의 미토콘드리아 네트워크에서 무작위로 선택되었습니다. 이 방법은 이전에 형광 강도27을 측정하는 데 사용되었지만 추가적인 바이어스 감소 조치를 취할 수 있습니다. 첫째, ImageJ의 블라인드 분석 도구를 사용하여 예상되는 결과를 지원하는 ROI 선택을 방지하기 위해 연구를 블라인드 할 수 있습니다. 둘째, ROI가 필요하지 않은 고급 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 형광 강도를 측정할 수 있습니다.
이 프로토콜은 형광 기반 정량화를 위해 컨포칼 현미경을 사용하지만, 유세포 분석과 같은 추가 방법을 사용하여 TMRE 및 MitoSOX37의 형광 변화를 정량화할 수 있습니다. 여기서는 미토콘드리아 네트워크 형태를 시각화하기 위해 유세포 분석이 아닌 컨포칼 현미경을 사용했습니다. 요약된 프로토콜은 유세포 분석을 통해 TMRE 및 MitoSOX 형광을 측정하는 데 쉽게 적용할 수 있으며 유사한 실험 결과를 얻을 수 있습니다. 또한, 산소 소비율(OCR) 분석은 양이온 염료 없이 미토콘드리아 전자 수송 사슬의 기능 변화를 감지하는 데 사용될 수 있습니다. OCR은 미토콘드리아 기능장애의 민감한 척도를 제공하지만, 세포막 전위 또는 슈퍼옥사이드 농도에 특이적인 것이 아니라, 대신 미토콘드리아 기능의 전체적인 척도를 제공한다38. 이러한 분석은 미토콘드리아 건강을 평가하기 위해 TMRE 및 MitoSOX 실험과 함께 수행될 수 있다39.
이 프로토콜은 특히 미토콘드리아 언커플러 CCCP40의 효과에 초점을 맞추고 있지만 대체 메커니즘을 가진 손상 시약을 사용할 수 있습니다. 예를 들어, 안티마이신 A 및 올리고마이신 A는 활성 산소 종(ROS) 생산을 통해 미토콘드리아 손상을 유도하기 위해 일반적으로 사용되는 전자 수송 사슬 억제제이다38. MitoSOX를 사용하여 미토콘드리아 과산화물 수준을 구체적으로 측정했지만 세포 내 ROS는 CellROX를 사용하여 측정할 수 있었습니다. HeLa 세포에서는 낮은 내인성 발현으로 인해 Parkin을 과발현할 필요가 있었습니다. 향후 연구에서는 내인성 Parkin41을 발현하는 세포 배양 시스템을 사용하여 미토콘드리아 네트워크 건강에 대한 Parkin 발현의 효과를 관찰할 수 있습니다. 미토콘드리아는 에너지 대사와 세포 항상성의 중요한 조절자이기 때문에 미토콘드리아 기능 장애는 당뇨병 42, 알츠하이머병 43,44,45, 암46, 간 질환 47을 포함한 수많은 질병과 관련이 있습니다. 따라서 이 워크플로는 관련 세포주 및 1차 배양에서 미토콘드리아 건강 및 조절 장애를 연구하는 데 적용될 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 선언 할 경쟁 이익이 없습니다.
Acknowledgments
이 원고에 대한 사려 깊은 피드백을 주신 Evans 연구실 구성원들에게 감사드립니다. 이 작업은 Duke Whitehead Scholars, Duke Science and Technology Scholars 및 Howard Hughes Medical Institute(HHMI) Hanna Gray Fellowship의 지원을 받습니다. 도 1A 는 BioRender.com 를 사용하여 만들어졌다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals, Peptides, and Recombinant Proteins | |||
| CCCP (carbonyl cyanide m-chlorophenyl hydrazone) | Sigma-Aldrich | C2759 | |
| DMEM (1x) with 4.5 g/L glucose | Gibco | 11-965-084 | |
| DMSO, Anhydrous | ThermoFisher Scientific | D12345 | |
| Fetal Bovine Serum | Hyclone | SH3007103 | |
| FuGENE 6 (Tranfection Reagent) | Promega | E2691 | |
| GlutaMAX 100x (L-Glutamine Solution) | Gibco | 35-050-061 | |
| Hoescht 33342 | ThermoFisher Scientific | 62249 | |
| MitoSOX Red | ThermoFisher Scientific | M36008 | |
| MitoTracker Deep Red | ThermoFisher Scientific | M7514 | |
| Opti-MEM (Redued Serum media) | ThermoFisher scientific | 31985070 | |
| Tetramethylrhodamine, Ethyl Ester, Perchlorate (TMRE) | ThermoFisher Scientific | T669 | |
| Experimental models: Organisms/Strains | |||
| HeLa-M (Homo sapiens) | A. Peden (Cambridge Institute for Medical Research) | N/A | |
| Recombinant DNA | |||
| EYFP Empty Vector | N/A | N/A | |
| YFP-Parkin T240R | This Paper | Generated by site-directed mutagenesis from YFP-Parkin | |
| YFP-Parkin WT | Addgene; PMID:19029340 | RRID:Addgene_23955 | |
| Software and Algorithms | |||
| Adobe Illustrator | Adobe Inc. | https://www.adobe.com/products/illustrator | (Schindelin, 2012) |
| Excel (Spreadsheet Software) | Microsoft Office | https://www.microsoft.com/en-us/microsoft-365/excel | |
| ImageJ | https://imagej.net/software/fiji/ | ||
| Leica Application Suite (LAS X) | Leica | https://www.leica-microsystems.com/products/microscope-software/p/leica-las-x-ls/ | |
| Microsoft Excel | Microsoft Office | https://www.microsoft.com/excel | |
| Prism9 (Statistical Analysis Software) | GraphPad Software | https://www.graphpad.com | |
| Other | |||
| 35 mm Dish, No. 1.5 Coverslip, 20 mm Glass Diameter, Uncoated | MatTek | P35G-1.5-20-C | |
| Cage Incubator (Environmental Chamber) | Okolab | https://www.oko-lab.com/cage-incubator | |
| DMiL Inverted Microscope | Leica | N/A | |
| LIGHTNING Deconvolution Software | Leica | N/A | |
| STELLARIS 8 confocal microscope | Leica | N/A |
References
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