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Biology

HeLa 세포에서 라이브 이미징을 사용한 미토콘드리아 막 전위 및 슈퍼옥사이드 수준의 형광 기반 정량화

Published: May 12, 2023
doi:
10.3791/65304
,
1Department of Cell Biology,Duke University Medical Center

Summary

이 기술은 형광 기반 라이브 이미징을 사용하여 HeLa 세포 내의 미토콘드리아 막 전위와 과산화물 수준을 시각화하고 정량적으로 측정하는 효과적인 워크플로우를 설명합니다.

Abstract

미토콘드리아는 ATP 합성을 통해 에너지 생산을 조절하여 대사 항상성에 중요한 동적 세포 기관입니다. 세포 대사를 지원하기 위해 다양한 미토콘드리아 품질 관리 메커니즘이 협력하여 건강한 미토콘드리아 네트워크를 유지합니다. 그러한 경로 중 하나는 손상된 미토콘드리아의 PTEN 유도 키나아제 1(PINK1) 및 파킨 포스포-유비퀴틴화가 리소좀 융합을 통해 세포에서 자가포식소 격리 및 후속 제거를 촉진하는 미토파지입니다. 유사분열은 세포 항상성에 중요하며 파킨의 돌연변이는 파킨슨병(PD)과 관련이 있습니다. 이러한 발견으로 인해 미토콘드리아 품질 관리의 분자 메커니즘과 역학을 이해하기 위해 미토콘드리아 손상 및 회전율을 조사하는 데 상당한 중점을 두었습니다. 여기에서 라이브 셀 이미징을 사용하여 HeLa 세포의 미토콘드리아 네트워크를 시각화하고 미토콘드리아 분리제인 카르보닐 시안화물 m-클로로페닐 히드라존(CCCP)으로 처리한 후 미토콘드리아 막 전위 및 슈퍼옥사이드 수준을 정량화했습니다. 또한, 파킨 의존성 미토파지를 억제하는 파킨의 PD 연관 돌연변이(ParkinT240R)를 발현하여 돌연변이 발현이 야생형 파킨을 발현하는 세포와 비교하여 미토콘드리아 네트워크에 어떤 영향을 미치는지 확인했습니다. 여기에 요약된 프로토콜은 미토콘드리아 막 전위와 과산화물 수준을 효과적으로 정량화하기 위해 형광 기반 접근 방식을 사용하는 간단한 워크플로를 설명합니다.

Introduction

미토콘드리아 네트워크는 에너지 생산1, 선천면역2,3, 세포신호전달4,5에 중요한 역할을 하는 일련의 상호 연결된 세포기관이다. 미토콘드리아 조절 장애는 파킨슨병(PD)과 같은 신경퇴행성 질환과 관련이 있습니다6,7. PD는 전 세계적으로 거의 1,000만 명에게 영향을 미치는 흑질의 도파민성 뉴런에 영향을 미치는 진행성 신경퇴행성 장애입니다8. PD는 손상된 미토콘드리아를 선택적으로 제거하는 세포 항상성을 유지하는 데 필요한 미토콘드리아 품질 관리 경로인 미토파지와 유전적으로 연결되어 있습니다 9,10. 연구에 따르면 FUN14 도메인 포함 1(FUNDC1) 매개 미토파지, Bcl-2 상호 작용 단백질 3(BNIP3) 촉진 미토파지, NIX 의존성 미토파지 및 잘 특성화된 PTEN 유도 키나아제 1(PINK1)/파킨 조절 미토파지10,11. PINK1(추정 키나아제)과 파킨(E3 유비퀴틴 리가아제)은 손상된 포스포-유비퀴티네이트 손상된 미토콘드리아와 함께 작용하여 손상된 세포 소기관을 삼키고 리소좀과 융합하여 분해를 시작하는 자가포식소체의 형성을 유도합니다 12,13,14,15,16. Parkin의 돌연변이는 도파민성 뉴런의 손실을 통한 신경변성과 같은 PD 관련 표현형과 관련이 있습니다17,18.

여기에서는 자궁경부암에서 유래한 불멸화 세포인 HeLa 세포를 사용하여 미토콘드리아 네트워크 건강을 유지하는 데 있어 Parkin의 역할을 조사하는 프로토콜이 설명되어 있습니다. HeLa 세포는 무시할 수 있는 수준의 내인성 파킨을 발현하므로 외인성 파킨 발현이 필요하다19. 미토콘드리아 네트워크 건강에서 파킨의 역할을 연구하기 위해 HeLa 세포를 야생형 파킨(ParkinWT), 파킨 돌연변이(ParkinT240R) 또는 빈 대조군 벡터로 형질감염시킵니다. ParkinT240R은 Parkin E3 ligase 활성에 영향을 미치는 상염색체 열성 소아 파킨슨증 돌연변이로, 미토파지 경로20의 효율성을 크게 감소시킵니다. HeLa 세포는 미토콘드리아 분리제인 카르보닐 시안화물 m-클로로페닐 히드라존(CCCP)의 경증(5μM) 또는 중증(20μM) 농도에 노출됩니다. 중증 농도의 CCCP를 이용한 치료는 다양한 세포주, 예컨대 HeLa 및 COS-7 세포에서 파킨 매개 미토파지를 유도하기 위해 일상적으로 사용된다21,22,23.

치료 후 이 프로토콜은 현재 사용 가능한 두 가지 미토콘드리아 표적 형광 염료를 사용하여 미토콘드리아 네트워크의 라이브 이미징을 사용합니다. 테트라메틸로다민, 에틸 에스테르, 과염소산염(TMRE)은 미토콘드리아 막 전위24를 기반으로 형광을 발하는 양이온성 염료이며, MitoSOX는 형광 강도가 과산화물 농도25의 함수인 미토콘드리아 과산화물 지표입니다. 마지막으로, 요약된 프로토콜은 형광 기반 정량화와 간단한 워크플로우를 사용하여 사용자 편향을 최소화하면서 미토콘드리아 막 전위와 과산화물 수준을 효과적으로 정량화합니다. 이 프로토콜은 HeLa 세포에서 미토콘드리아 기능을 연구하기 위해 설계되었지만 미토콘드리아 네트워크 건강을 정량적으로 특성화하기 위해 추가 세포주 및 일차 세포 유형에 적용할 수 있습니다.

Protocol

1. 생물학적 시료의 제조 알림: 생물 안전 캐비닛에서 멸균 기술을 사용하여 다음 단계를 수행하십시오. 캐비닛 표면과 모든 재료에 70% 에탄올을 뿌립니다. HeLa 세포 배양 및 형질주입10% 소 태아 혈청과 1% L-글루타민 용액이 보충된 4.5g/L 포도당을 함유하는 Dulbecco’s modified eagle medium(DMEM)에서 30,000개의 HeLa 세포를 배양합니다(HeLa media; 표 참조</stron…

Representative Results

이 프로토콜에서는 CCCP 처리 후 미토콘드리아 네트워크의 막 전위와 과산화물 수준을 측정하기 위해 형광 기반 정량화를 사용했습니다(그림 1). 이 워크플로우는 자궁경부암에서 추출한 불멸화 세포주인 HeLa 세포를 사용했습니다. HeLa 세포는 미토콘드리아 생물학을 연구하는 데 일상적으로 사용되며 비교적 평평하여 현미경을 사용하여 미토콘드리아 네트워크를 쉽게 시각?…

Discussion

여기에 요약된 워크플로우는 형광 기반 이미징을 사용하여 미토콘드리아 막 전위와 슈퍼옥사이드 수준을 강력하고 재현성 있게 정량화하는 데 사용할 수 있습니다(30). 이러한 실험을 설계할 때 고려해야 할 중요한 기술적 제한 사항이 있습니다. HeLa 세포를 빈 YFP 벡터, YFP-ParkinWT, 또는 YFP-ParkinT240R로 형질감염시켰다. 실험 결과가 파킨에 특이적인지 확인하기 위?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

이 원고에 대한 사려 깊은 피드백을 주신 Evans 연구실 구성원들에게 감사드립니다. 이 작업은 Duke Whitehead Scholars, Duke Science and Technology Scholars 및 Howard Hughes Medical Institute(HHMI) Hanna Gray Fellowship의 지원을 받습니다. 도 1A 는 BioRender.com 를 사용하여 만들어졌다.

Materials

Chemicals, Peptides, and Recombinant Proteins
CCCP (carbonyl cyanide m-chlorophenyl hydrazone)  Sigma-Aldrich C2759
DMEM (1x) with 4.5 g/L glucose Gibco 11-965-084
DMSO, Anhydrous ThermoFisher Scientific D12345
Fetal Bovine Serum Hyclone SH3007103
FuGENE 6 (Tranfection Reagent) Promega E2691
GlutaMAX 100x (L-Glutamine Solution)  Gibco  35-050-061
Hoescht 33342 ThermoFisher Scientific 62249
MitoSOX  Red  ThermoFisher Scientific M36008
MitoTracker Deep Red ThermoFisher Scientific M7514
Opti-MEM (Redued Serum media) ThermoFisher scientific 31985070
Tetramethylrhodamine, Ethyl Ester, Perchlorate (TMRE)  ThermoFisher Scientific T669
Experimental models: Organisms/Strains
HeLa-M (Homo sapiens) A. Peden (Cambridge Institute for Medical Research) N/A
Recombinant DNA
EYFP Empty Vector N/A N/A
YFP-Parkin T240R This Paper Generated by site-directed mutagenesis from YFP-Parkin
YFP-Parkin WT Addgene; PMID:19029340 RRID:Addgene_23955
Software and Algorithms
Adobe Illustrator Adobe Inc. https://www.adobe.com/products/illustrator (Schindelin, 2012)
Excel (Spreadsheet Software) Microsoft Office  https://www.microsoft.com/en-us/microsoft-365/excel
ImageJ https://imagej.net/software/fiji/
Leica Application Suite (LAS X) Leica https://www.leica-microsystems.com/products/microscope-software/p/leica-las-x-ls/
Microsoft Excel Microsoft Office https://www.microsoft.com/excel
Prism9 (Statistical Analysis Software) GraphPad Software https://www.graphpad.com
Other
35 mm Dish, No. 1.5 Coverslip, 20 mm Glass Diameter, Uncoated MatTek P35G-1.5-20-C
Cage Incubator (Environmental Chamber) Okolab https://www.oko-lab.com/cage-incubator
DMiL Inverted Microscope Leica N/A
LIGHTNING Deconvolution Software Leica N/A
STELLARIS 8 confocal microscope Leica N/A
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Keywords: Mitochondrial Membrane PotentialSuperoxide LevelsLive ImagingHeLa CellsNeurodegenerative DiseasesParkinson’s DiseaseALSSTEDSIMExpansion MicroscopyMitophagyPINK1ParkinMitochondrial Quality ControlATP SynthesisCCCPParkin T240R Mutation
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Fazli, M., Evans, C. S. Fluorescence-Based Quantification of Mitochondrial Membrane Potential and Superoxide Levels Using Live Imaging in HeLa Cells. J. Vis. Exp. (195), e65304, doi:10.3791/65304 (2023).
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