Två-foton laserinducerad neural skada: En metod för att observera Axon degeneration och regenerering i Drosophila Larver

Overview

Denna video beskriver två-foton laser ablation av axons i en Drosophila melanogaster larva och ett exempel protokoll för att inducera skada och avbilda skadestället.

Protocol

Detta protokoll är ett utdrag från Li et al., A Drosophila In Vivo Injury Model for Studying Neuroregeneration in the Peripheral and Central Nervous System, J. Vis. Exp. (2018).

1. Två-foton skada och confocal imaging

1. Inställningar för mikroskop
   OBS: Ett konfokalt laserskanningsmikroskop med en två-fotonlaser användes för detta experiment, men andra system med motsvarande inställning kommer också att räcka. Två-foton laser (930 nm) användes för att leverera skada och en Argon laser (488 nm) användes för confocal imaging av GFP.
   1. I början av varje session slår du på två-fotonlasern och/eller konfokallasrarna och mikroskopet. Öppna bildframställningsprogrammet.
   2. För tvåfotonskada, ställ in följande parametrar för avbildning av GFP med två-fotonlasern vid 930 nm (1 950 mW).
      1. Välj radsökningsläge. Öppna pinhole hela vägen. Öka laserintensiteten till ~20% (390 mW).
      2. Välj 512 x 512 som ramskanning. Använd maximal skanningshastighet (vanligtvis med pixeltiden på 0,77 μs). Se till att medelvärdet är 1 och bitdjupet är 8 bitar.
      3. Ställ in förstärkningen på ~750 och förskjutningen till 0.
      4. Spara detta förinställt experimentella protokoll som 2P GFP 930 Ablation, vilket möjliggör enkel återanvändning i framtida experiment.
   3. För konfokal avbildning ställer du in följande parametrar för avbildning av GFP med Argon-lasern vid 488 nm:
      1. Välj fliken Förvärv och sedan Z-stack.
      2. Under "Laser", slå på strömmen för 488 nm Argon laser.
      3. Gå till Kanaler, välj 488 mm laser och öka lasereffekten till 5-10%. För pinhole, använd 1-2 luftiga enheten (AU). Justera förstärkningen till 650.
      4. I förvärvslägeväljer du 1024 x 1024 som ramskanning, använder maximal genomsökningshastighet, ett genomsnittligt antal 2 och bitdjup på 8 bitar.
      5. Spara det här förinställt experimentella protokollet som GFP Imaging.
2. Larver anestesi med dietyleter och montering
   1. Placera en 60 mm glasform i en 15 cm lång petriskål i rökhuv. Vik och lägg en bit vävnadspapper längst ner i glasfatet och placera sedan en druvjuice agarplatta på vävnaden. Tillsätt dietyleter i glasformen, till den punkt där vävnadspapperet blötläggs och det finns ett lager flytande eter kvar i skålen. Håll alltid locket på.
   2. Förbered en glasrutschbana med en droppe halokarbon 27 olja i mitten. Tillsätt 4 fläckar vakuumfett i bildens fyra hörn för att senare stödja täcket.
   3. Använd tång för att plocka upp en rengjord larva och placera den på agarplattan i 60 mm glasformen. Täck glasfatet med locket och vänta tills larven slutar röra sig. För PNS-skada/avbildning, ta ut larven så snart svansen slutar rycka. För CNS, vänta tills hela larven blir orörlig, särskilt huvudsegmenten.
      OBS: Tidpunkten för eterexponering är avgörande. Se Diskussion.
   4. Plocka försiktigt upp den bedövade larven och placera den med huvudet upprätt i droppen halokarbonolja på glidningen. Lägg till ett omslagsglas ovanpå bilden. Använd försiktigt tryck för att trycka ner täcket tills det vidrör larven (bild 1A).
   5. Justera larvens läge genom att försiktigt trycka täcket åt vänster eller höger för att rulla larven, så att neuron/axon/dendriten av intresse är på toppen och närmast mikroskoplinsen.
   6. För PNS-skada, montera larven dorsala sidan upp, så att båda luftstruparna är synliga. Rulla sedan larven ~ 30 grader åt vänster för att skada klass III da neuron axoner (Figur 1B och 1C), 90 grader för att skada klass IV da neuron axoner (Figur 1B och 1E), eller ~ 30 grader för att skada klass IV da neuron dendriter ( Figur2A).
   7. För CNS-skada, placera larven för att vara helt ventral sida upp (Figur 3A), så att intresseområdet är närmast mikroskoplinsen i z-planet.
3. Skada med två-fotonlaser
   1. Placera rutschkanan med larven under mikroskopet och fäst den på plats med glidhållaren på scenen. Använd målet 10X (0,3 NA) för att hitta larven.
   2. Tillsätt 1 droppe objektiv olja på täckglaset, byt till 40X -målet (1,3 NA) och justera fokus.
   3. Växla till skanningsläget och återanvänd experimentprotokollet 2P GFP 930 Ablation. Se till att pinholeen är öppen hela vägen.
      OBS: Konfigurationen måste optimeras baserat på enskilda system.
   4. Starta liveläget för att hitta intresseområdet (ROI) och finjustera inställningarna för att uppnå god bildkvalitet med lämplig zoom.
      OBS: Syftet med detta steg är att hitta neuron / axon / dendrite att skada, snarare än att ta bilden av bästa kvalitet. Använd därför de minimala inställningarna som är tillräckliga för att visualisera målområdet för att undvika överexponering eller fotografering.
   5. Stoppa Live-genomsökningen så att beskärningsknappen blir tillgänglig. Låt stillbilden fungera som färdplan. Välj beskärningsfunktionen och justera skanningsfönstret för att fokusera på det mål som ska skadas.
   6. Minska avkastningen på sysselsatt vatten så att den är lika stor som den potentiella skadeplatsen. Täck till exempel bara bredden på en axon eller en dendrit, för att säkerställa skadans precision och minska skadorna på närliggande vävnader. Om så önskas, zooma in på ROI före beskärning, vilket möjliggör mer exakt skada.
   7. Öppna ett nytt bildfönster. Minska skanningshastigheten och öka laserintensiteten. Bestäm ökningen av laserintensiteten baserat på vävnadsfluorescenssignalen som skannas i liveläge.
   8. Vanligtvis ställer du in två-foton laserintensiteten från 25% för PNS-skada och 50-100% för VNC-skada. För PNS axon skada, se till att laserintensiteten är ~480 mW och pixel uppehållstiden är 8,19 μs. För VNC-axonskadan, se till att laserintensiteten och pixelboendetiden vanligtvis är 965-1930 mW respektive 8,19-32,77 μs.
   9. Starta kontinuerlig genomsökning. Låt markören hovra över knappen Kontinuerlig. Håll ett öga på bilden och stoppa skanningen så snart en drastisk ökning av fluorescens observeras.
      OBS: Utseendet på fluorescensspiken beror på auto-fluorescens på skadeplatsen.
   10. Växla tillbaka till liveläget genom att återanvända inställningarna. Hitta den intresseregion som just riktades genom att justera fokus.
       OBS: En bra indikation på lyckad skada är utseendet på en liten krater, ringliknande struktur eller lokaliserat skräp precis vid skadeplatsen.
   11. Flytta till nästa neuron och upprepa från steg 1.3.5, för att skada flera nervceller i ett enda djur. Eller upprepa steg 1.3.5 samtidigt som du gradvis ökar kraften och/eller minskar skanningshastigheten om den ursprungliga skadan var otillräcklig.
       OBS: Om lasereffekten är för hög kommer ett stort skadat område att synas i liveskanningsbilden efter skadan. För mycket skada kan orsaka larvens död.
   12. Återvinn larven genom att försiktigt ta bort täcket och överföra den skadade larven på en ny tallrik med jästpasta. Dike flera grottor på agarplattan med tång; alternativt, gör en ö av agar i plattan istället för att använda hela plattan, för att minska risken för larven att krypa ut ur plattan.
   13. Lägg plattan i en 60 mm Petri-skål med våt vävnad (blöt med 0,5% propionsyralösning) och kultur vid rumstemperatur eller 25 °C.
       OBS: Larven kommer att ligga kvar i larvstadiet i ungefär en extra dag vid rumstemperatur (22 °C) jämfört med vid 25 °C.
4. Konfokal avbildning efter skada
   1. Avbilda den skadade larven vid önskade tidpunkter genom att förbereda larven med samma procedur av anestesi och montering som i steg 1.2 och sedan avbilda med konfokal laser.
      OBS: Avbilda larven vid 24 timmar efter skada (AI) för att bekräfta axonal skada och vid 48 h AI (klass IV da nervceller) eller 72 h AI (klass III da nervceller) för att bedöma regenerering.
   2. Leta reda på larven med 10X-målet och byt sedan till ett 25X (0,8 NA) mål. Återanvänd experimentprotokollet GFP Imaging.
   3. Klicka på Live-knappen och hitta samma neuron som skadats tidigare.
   4. Ställ in de första och sista Z-positionerna i live-skanningsfönstret. Tryck på stoppa och klicka på Starta experiment för att hämta en Z-stack-bild.
      OBS: Se till att en normaliseringspunkt (axonkonvergeringspunkten) ingår vid hämtning av bilder så att kvantifiering av regenerering är möjlig (figur 1D, 1F) - detta diskuteras vidare i avsnittet dataanalys.
   5. Växla till Bildbehandling, välj den bild som just tagits och generera en maximal intensitetsprojektion. Spara både z-stacken och de maximala intensitetsprojektionsbilderna.

Representative Results

Figur 1: Da neuron axon regenerering i periferin visar klass specificitet. Aoch B) Schematisk ritning som visar larvernas position. C)Schematisk ritning av nervceller av klass III da. (D) Axons av klass III da-neuroner ddaF, märkta med 19-12-Gal4, UAS-CD4-tdGFP, repo-Gal80/+, misslyckas med att återväxt. (E) Schematisk ritning av klass IV da nervceller. (F) Axoner av klass IV da neuroner v'ada, märkta med ppk-CD4-tdGFP/+, återväxt utanför lesionsstället. (D och F) Röd linje anger axonlängd medan grön streckad linje markerar avståndet mellan cellkroppen och axonkonvergeringspunkten (DCAC). Den blå punkten markerar axon konvergeringspunkten. Skalstreck = 20 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 2: Da neuron dendrite regenerering. A)Illustrativ representation av nervceller av klass IV da. B)Illustrativ representation av dendritregenerering i klass IV da neuron ddaC, märkt med ppk-CD4-tdGFP/+. Laserablation är riktad mot den primära grenpunkten och utförs vid 48 h AEL. Vid 24 h bekräftas AI-skada transection av neuriten, och vid 72 h AI regenerering kvantifieras. Dendriter av ddaC-nervceller visar betydande återväxt, med nya dendritiska grenar som spirar från den avhuggna stammen för att kakel det lediga utrymmet. Det är värt att notera att nya terminalgrenar kontinuerligt läggs till de oskadda dendriterna i detta utvecklingsstadium. Skalstreck = 20 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 3: Da neuron axon regenerering i VNC. A)Schematisk ritning av en Drosophila larva monterad på en diabild och avbildad under mikroskopet. Klass IV da neuron axoner i VNC visualiseras i en ppk-CD4tdGFP/+ larva. Två kandidatkommuniksegment visas i den inzoomade bilden och den schematiska ritningen. Var och en av dem har två skadeplatser (röda cirklar). (B) Konfokala bilder av ett skadat segment avbildat vid 8, 24 och 72 timmar efter skada (AI). Röda linjer visar de återväxande axonerna. C)Mätning och normalisering av återväxtaxlar. Skalstreck = 20 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Diethyl ether, ACS reagent, anhydrous	Acros Organics	AC615080010
Halocarbon 27 Oil	Genesee Scientific	59-133
Propionic Acid	J.T.Baker	U33007
Cover Glasses: Rectangles	Fisher Scientific	12-544-D	50 mm X 22 mm
Zeiss LSM 880 laser scanning microscope	Zeiss
Zen software	Zeiss
Chameleon Ultra II	Coherent